毛细管电泳技术应用与应用.ppt

毛细管电泳技术及应用,电泳,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。,1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的分离：发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；,经典电泳,利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术毛细管电泳。,毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis,CE）,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用了25-100m内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，毛细管电泳的柱效远高于HPLC，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,分离过程,电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。电渗流电泳时,阴离子在负极最后流出除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,毛细管电泳的特点,1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；,一、CE基本原理二、电渗现象与电渗流electroosmoticflow三、影响电渗流的因素四、淌度mobility五、CE中的参数与关系式六、影响分离效率的因素,毛细管电泳理论基础,毛细管电泳(CE)基本原理,电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,电场力：FE=qE阻力：F=f故：qE=fq离子所带的有效电荷；E电场强度；离子在电场中的迁移速度；f平动摩擦系数(对于球形离子：f=6；离子的表观液态动力学半径；介质的粘度；),所以，迁移速度：,（球形离子）,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。淌度：单位电场强度下的平均电泳速度。,q离子所带的有效电荷；E电场强度；离子的表观液态动力学半径介质的粘度；,电渗现象与电渗流electroosmosisandelectroosmoticflow,1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。,2.HPCE中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,3.CE中电渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即电渗流=E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即=00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。电渗流=0E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算电渗流=Lef/teoLef毛细管有效长度；teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,CE中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向负极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向正极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向正极。,4.CE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,5.CE中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：+=电渗流+ef阳离子运动方向与电渗流一致；-=电渗流-ef阴离子运动方向与电渗流相反；0=电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要。,CE中影响电渗流的因素,1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,3.电解质溶液性质的影响,（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,5.色谱与电泳分离模式的结合。,3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；,1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,四、毛细管等电聚焦Capillaryisoelectricfocusing，CIEF,4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,五、毛细管等速电泳Capillaryisotachophoresis，CITP,3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；,capillaryisotachophoresis，CITP,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以“电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。,六、毛细管电动色谱Capillaryelectrokineticchromatography，CEC,七、毛细管微乳电动色谱(Microemulsionelectrokineticchromatography,MEEKC),CE相关技术1.毛细管电泳柱技术毛细管是CE的核心部件之一早期研究集中在毛细管直径、长度、形状和材料方面，目前集中在管壁的改性和各种柱的制备。,1)动态修饰毛细管内壁管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流，通常采用动态修饰和表面涂层两类方法。动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂，如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)，能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向添加剂还有聚胺、聚乙烯亚胺(PEI)等，甲基纤维素(MC)可形成一中性亲水性覆盖层。,2)毛细管内壁表面涂层涂层方法有很多种，包括物理涂布、化学涂层。最常用的方法是采用双官能团的偶联剂，如各种有机硅烷，第一个官能团(如甲氧基)与管壁上的游离羟基进行反应，使其与管壁进行共价结合，再用第二个官能团(如乙烯基)与涂渍物(如聚丙烯酰胺)进行反应，形成一稳定的涂层此外还有将纤维素、PEI和聚醚组成多层涂层，亲水性的绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层。,化学键合,物理吸附,3)凝胶柱和无胶筛分CGE的关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺凝胶栓来进行DNA片段分析和测序。测定蛋白质和肽的分子量常用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-LPAGE)。如将聚丙烯胺单体溶液中的交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)浓度降为零，得到线性非交联的亲水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分离的作用，称无胶筛分。此法简单，使用方便，分离能力比CGE差。,4)CEC的毛细管柱制备包括开管和填充柱开管柱：键合色谱涂层毛细管柱，例如：将核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脱氨酶等固定到毛细管表面，构成一开管反应器，再和CE连接，可进行核酸选择性检测、微量在线合成和分离寡核昔酸等工作。填充柱：可将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中。,2.毛细管电泳检测技术CE对检测器灵敏度要求相当高，故检测是CE中的关键问题。迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱末用于CE外，其它检测手段均已用于CE。现选择重要的几类检测器介绍其最新进展。,1)紫外检测器(UV)在合适位置除去涂层，将透明部分对准光路。UV检测器集中在提高灵敏度，可采用毛细管弯折、吹泡技术扩大光路。或采用平面积分检测池，这种设计可使检测光路增加到1cm。也有用光散射二极管(LEDS)作光源，其线性范围和信噪比优于汞灯。总体来说进展不大。,2)激光诱导荧光检测LIFLIF是CE最灵敏的检测器之一，极大地拓展了CE的应用，DNA测序就须用LIF，单细胞和单分子检测也离不开LIF。利用CE-LIF技术可检出染色的单个DNA分子，有望用于癌症的早期诊断及临床酶和免疫学检测等。CELIF和微透析结合可测定脑中神经肽。采用波长分辨荧光检测器可提供有关蛋白和DNA序列的一些结构和动态信息。一些适用于二极管激光器的荧光标记试剂如CY5等，正在不断开发和应用。,CE/LIF向三个方向发展：在原有氦镉激光器(325nm)和氩离子激光器(488nm)之外，发展价廉、长波长的二极管激光器；发展更多的荧光标记试剂来扩展应用面；开展更多的应用研究。LIF不但提高了灵敏度，也可增加选择性，缺点在于被测物须用荧光试剂标记成染色。,3).CE/MS联用CE/MS联用,弥补了CE定性鉴定的不足，故发展特别快。CE/MS联用主要在两方面发展：一是各种CE模式和MS联用，二是CE和各种MS联用。关键是解决接口装置。最早报道CE/MS联用是采用单级四极杆质谱，现已发展到三级四极质谱、离子阱质谱等。CE/MS联用特别适合于复杂生物体系的分离鉴定。因所需样品少，目前大部分工作集中在基因工程产品和蛋白样品，CE/MS联用现在已成为CE研究中的热点。,4)电化学检测器（EC）EC可避免光学类检测器遇到的光程太短的问题，故和LIF同为CE中灵敏度最高的检测器。报道最多的是电化学伏安检测器，常用碳纤维微电极进行单细胞极微量神经递质(如多巴胺等)的测定。可用脉冲伏安法测定糖、糖肽及金属离子，也可用循环伏安法，另一类常用的EC为电导检测器，Li的检测限达10-7mol/L(10-15mol)。,5)化学发光检测器(CL)CL具有结构简单、灵敏度高的特点，近年来引起重视。用CECL检测血红蛋白，其检测限比CEUV低约4个数量级。应用最多的仍是鲁米那(luminol)体系，因为该体系对多数待测物如一些金属离子、氨基酸及其衍生物的检测灵敏度很高，且反应在水相进行。电致化学发光(ECL)也已成功地用作CE检测。,6)其它检测器采