（应用化学专业论文）螺旋藻光系统Ⅰ的分离表征及稳定性研究.pdf

中国石油大学( 华东) 硕士学位论文 摘要 光合作用是地球上最伟大的反应之一，可以高效地将太阳能转换为电势能或化学 能。基于光合作用原理的太阳能利用可以帮助人们从根本上解决目前化石能源短缺和环 保的需求。然而光合膜蛋白基生物太阳能电池的开发和利用尚有诸多关键基础问题需要 解决。其中，光合膜蛋白p s i 的分离制备及如何保持其长期稳定是生物太阳能电池开发 利用的前提和保障。本论文针对这两项前期关键基础问题进行了研究。 首先，采用蔗糖密度梯度超速离心分离的方法成功从钝顶螺旋藻中分离出了p s i ， 并对此方法中的关键因素增溶比进行了优化。发现当增溶比为3 0 时，p s i 得率最高。通 过对p s i 吸收光谱、低温荧光光谱及圆二色光谱的表征，证实分离出的p s i 是单体和三 聚体的混合物。通过s d s p a g e 电泳分析及光学活性的检测，证明得到的是高纯度高活 性的p s i ，为进一步研究p s i 的稳定性及p s i 基生物太阳能电池开发奠定了重要的物质 基础。 其次，光合膜蛋白复合体的稳定性决定着生物太阳能电池的使用寿命。考察了几种 常见化学表面活性剂和多肽表面活性剂对p s i 热稳定性的影响。研究发现，几种常见化 学表面活性剂中，阳离子型十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 及非离子型十二烷基p d 麦芽糖苷( d m ) 对p s i 的稳定性效果优于阴离子型十二烷基硫酸钠( s d s ) 和两亲型 表面活性剂f c 一1 6 ，这可能同p s i 表面所带电荷有关。阳离子型多肽表面活性剂1 5 i ( ：2 对 p s i 的稳定性效果较好，能使p s i 的变性温度由4 8 2 。c 提高到5 2 9 。c ，明显优于常见化 学表面活性剂。i s k 2 还可以显著延长p s i 在4 8 2 时的半衰期，且具有明显的浓度效应。 而阴离子型的a 6 d 对p s i 的热稳定性有破坏作用。 为了进一步探讨i s k 2 对p s i 可能的稳定机理，系统考察了1 5 k 2 疏水基团( i ) 和亲 水基团( k ) 的个数改变对p s i 热稳定性的影响。研究发现，i x k y 系列多肽表面活性剂 对p s i 的热稳定性都有一定作用，但是两种基团个数的改变对p s i 的稳定能力未发现明 显规律，这可能与p s i 、表面活性剂和水分子间复杂的氢键或疏水作用有关。a f m 分析 发现，1 5 k 2 可以与p s i 和t r i t o nx 1 0 0 形成大的稳定的纳米囊泡结构，将p s i 的疏水区 域严密包裹在内，阻止了水分子对p s i 疏水区域的攻击，从而提高p s i 的热稳定性。此 外，还对该过程进行了简单的模拟。 关键词：光合系统i ，光谱分析，热稳定性，染料敏化电池，表面活性剂 摘要 s e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r a t i o na n d s t a b i l i z a t i o no f p h o t o s y s t e m if r o ms p i r u i i n a p l a t e n s i s y a n gf e n g ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o rx i ad a o - h o n g ，x uh a i a b s t r a c t l i f eo ne a r t hd e p e n d so np h o t o s y n t h e s i s ，t h ec o n v e r s i o no fl i g h te n e r g yf r o mt h es u nt o c h e m i c a le n e r g yo rm o s tn e g a t i v er e d o xp o t e n t i a l s o l a re n e r g yb a s e do np h o t o s y n t h e s i sc o u l d h e l ph u m a nt or e s o l v ed e p l e t i o no ff o s s i lf u e lr e s o u r c ea n da g g r a v a t i o no ft h ee n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n h o w e v e r , t h e r ea r em a n yt e c h i n a lh u r d l e st ob es o l v e dt od e v e l o ps u c ha p h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n ep r o t e i n - b a s e db i o l o g i c a ls o l a rc e l l i nt h i sp a p e r ，w em a i n l yf o c u s o nh i g ha c t i v ep h o t o s y s t e mi ( p s i ) c o m p l e xp r e p a r a t i o na n dh o wt om a i n t a i ni t sl o n g t e r m s t a b i l i t y ，w h i c ha let w ok e yp o i n t st od e v e l o ps u c hap r o m i s i n gs o l a rc e l ld e v i c e f i r s t l y ，i n t a c tp s iw a ss u c c e s s f u l l ys e p a r a t e df r o ms p i r u l i n ap l a t e n s i su s i n gs u c r o s e d e n s i t yg r a d i e n tu l t r a c e n t r i f u g a t i o nm e t h o d ，a n dt h ek e yf a c t o ro fs o l u b i l i z i n gr a t i ow a s o p t i m i z e d m a x i m u my i e l do f p s ic o u l db eo b t a i n e da ta s o l u b i l i z i n gr a t i oo f3 0 i s o l a t e dp s i w a sp r o v e dt ob eam i x t u r eo fm o n o m e ra n dt r i m e ra n a l y z e d 、析t l la b s o r p t i o ns p e c t r a , l o w t e m p e r a t u r ef l u o r e s c e n c es p e c t r aa n dc i r c u l a rd i c h r o i s m t h ep u r i t ya n da c t i v i t yo fi s o l a t e d p s iw a sd e t e r m i n e du s i n gs d s p a g ea n do x y g e nc o n s u m p t i o n ，w h i c hl a i da ni m p o r t a n t f o u n d a t i o nt of u r t h e rs t u d yt h es t a b i l i t yo fp s ia n dp s i - b a s e db i o l o g i c a ls o l a rc e l ld e v i c e s e c o n d l y , s t a b i l i t yo fp h o t o s y n t h e t i cm e m b r a n ep r o t e i nc o m p l e xd e t e r m i n e st h el i f e s p a n o fs o l a rc e l ld e v i c e s s e v e r a lc o n v e n t i o n a lc h e m i c a ls u r f a c t a n t sa n dp e p t i d es u r f a c t a n t sw e r e i n v e s t i g a t e dt oi m p r o v et h e r m a ls t a b i l i t yo fi s o l a t e dp s ii ns o l u t i o n c a t i o n i c ( c l 蛆) a n d n o n - i o n i c ( d m ) s h o w e db e n e re f f e c to nt h es t a b i l i t yo fp s it h a na n i o n i c ( s d s ) a n d z w i t t e r i o n i cs u r f a c t a n t ( f c - 16 ) ，w h i c hm a y b ec o r r e l a t ew i t ht h es u r f a c ec h a r g e so fp s i c a t i o n i cp e p t i d e1 5 k 2c o u l de n h a n c ed e n a t u r e dt e m p e r a t u r eo fp s if r o m4 8 2 ct o5 2 9 0 c ， w h i c hw a sm u c hb e t t e rt h a nc o n v e n t i o n a lc h e m i c a ls u r f a c t a n t s i s k zc o u l da l s os i g n i f i c a n t l y 中国石油大学( 华东) 硕十学位论文 e x t e n dh a l f - l i f eo fp s ia t4 8 2 a n ds h o w e da l lo b v i o u sc o n c e n t r a t i o ne f f e c t a n i o n i ca 6 d e v e ne x h i b i t e dc o n v e r s ee f f e c to nt h et h e r m a ls t a b i l i t yo fp s i i no r d e rt of u r t h e re x p l o r et h em e c h a n i s mo fs u r f a c t a n ts t a b i l i z i n ge f f e c to np s i ，t h e n u m b e ro fh y d r o p h o b i cg r o u pia n dh y d r o p h i l i cg r o u pkw a sc h a n g e ds y s t e m a t i c a l l yt os t u d y i t si n f l u e n c eo nt h et h e r m a ls t a b i l i t yo fp s i a l ls y n t h e s i z e di x k ys e r i e so fp e p t i d es u r f a c t a n t s c o u l de n c h a n ct h et h e r m a ls t a b i l i t yo fp s it os o m ee x t e n t ，b u tn oo b v i o u sr u l ew a sf o u n dw i t h c h a n g i n gt h en u m b e ro ft w og r o u p so n t h es t a b i l i t yo fp s i ，w h i c hw a si n f l u e n c e db y h y d r o g e n b o n d so rh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ec o m p l e xs y s t e mc o n t a i n i n gp s i ，s u r f a c t a n t s a n dw a t e rm o l e c u l e s a f ma n a l y s i ss h o w e dt h a t1 5 k 2t o g e t h e rw i t hp s ia n dt r i t o nx 一10 0 c o u l df o r ml a r g ev e s i c u l a rs t r u c t u r e s t h eh y d r o p h o b i er e g i o no fp s lw a st i g h t l yw r a p p e du p t op r e v e n tt h ea t t a c ko fw a t e rm o l e c u l e s ，w h i c hm a y b ep a r t l ye x p l a i nh o wp e p t i d es u r f a c t a n t s t oe n h a n c et h et h e r m a ls t a b i l i t yo fp s i t h i sp r o c e s sw a sa l s os i m u l a t e di nt h i sp a p e r k e yw o r d s ：p h o t o s y s t e mi ，s p e c t r aa n a l y s i s ，t h e r m a ls t a b i l i t y ，d y e - s e n s i t i z e ds o l a rc e l l ， d e t e r g e n t 关于学位论文的独创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在指导教师指导下独立进行研究工作所取得的 成果，论文中有关资料和数据是实事求是的。尽我所知，除文中已经加以标注和致谢外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得中国石油 大学( 华东) 或其它教育机构的学位或学历证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对研究所做的任何贡献均己在论文中作出了明确的说明。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：二基蕾。 日期：叼年乡月乒日 学位论文使用授权书 本人完全同意中国石油大学( 华东) 有权使用本学位论文( 包括但不限于其印刷版 和电子版) ，使用方式包括但不限于：保留学位论文，按规定向国家有关部门( 机构) 送交学位论文，以学术交流为目的赠送和交换学位论文，允许学位论文被查阅、借阅和 复印，将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，采用影印、缩印或其他 复制手段保存学位论文。 保密学位论文在解密后的使用授权同上。 学位论文作者签名：塑啤 指导教师签名：狴泠卜 日期：彳年 日期：7 , r 力7 年 ， 月髟日 6 , e j 牛e t 中国石油大学( 华东) 硕上学位论文 1 1 研究背景及意义 第一章前言 人类生活的水平依赖于能源的利用能力l 。目前世界能源结构中，人类所利用的主 要是石油、天然气和煤炭等化石能源。1 9 9 8 年世界一次能源( 包括生物质能) 消费总量 为1 4 0 5 0 亿吨标准煤( 1 吨标准煤发出热量为2 9 2 6 x 1 07 焦耳) ，其消费构成为：石油占 3 3 9 ，天然气占1 9 6 ，煤炭占2 2 7 ，核电占6 1 ，大中型水电站占3 9 ，新可 再生能源占2 o ，传统生物质能占1 1 8 。随着经济的发展，人口的增加，社会生活 水平的提高，预计未来世界能源消费量将以每年3 的速度增长，到2 0 2 0 年，世界一 次能源消费总量将达到2 0 0 亿 2 5 0 亿吨标准煤以上1 2 。 我国的能源资源储量不容乐观。现已探明可开发能源超过8 2 3 0 亿吨标准煤，探明 经济可开发剩余可采总储量为1 3 9 2 亿吨标准煤，约占世界总量的l o 1 。我国能源剩 余可采总储量的结构为：原煤占5 8 8 ，原油占3 4 ，天然气占1 3 ，水能占3 6 5 。 能源经济可开发剩余可采储量的资源保证程度仅为1 2 9 7 年，其中原煤仅为1 1 4 5 年， 原油仅为2 0 1 年，天然气仅为4 9 3 年。由此可见我国的能源形式严峻。 同时，近年来全球气候变暖是当前国际社会普遍关注的重大全球问题。它主要是发 达国家在其工业化过程中燃烧大量化石燃料产生的c 0 2 等温室气体排放所造成的。观测 资料表明，在过去的1 0 0 年中，全球平均气温上升了o 3 - - 0 6 ，全球海平面平均上 升了1 0c m - 2 5c m 。如果不对温室气体采取减排措施，在未来几十年内，全球平均气温 每1 0 年将可升高o 2 ，到2 1 0 0 年全球平均气温将升高1 3 5 。联合国政府间气 候变化专门委员会( i p c c ) 预测，2 1 世纪全球平均气温升高的范围可能在1 4 5 8 之间，实际上升多少取决于2 1 世纪化石燃料消耗量和气候系统的敏感程度。 太阳能的利用，可以从根本上解决以上两个问题。地球上绝大部分能源最终来源于 太阳热核反应释放的巨大能量，但太阳能也有两面性。太阳能的优点：光照覆盖范 围广；绿色环保；储量巨大。缺点：光强度弱；昼夜光照有间歇性；易 受季节天气的影响。为了充分的利用太阳能，人们开发了太阳能电池。 太阳能电池最早于1 9 5 4 年由c h a p i n 等人用s i 的p - n 结制成的，现在实际使用的太 阳能电池大都是以晶体硅做原材料制成的。太阳能电池发展至今，已经种类繁多，形式 各样。按照材料的不同，可分为：硅太阳能电池；无机化合物太阳能电池；敏 第一章前苦 化纳米晶太阳能电池；有机化合物太阳能电池；塑料太阳能电池1 3 1 。 1 1 1 硅基太阳能电池 硅基太阳能电池是以硅材料作为基体的太阳能电池。分为：单晶硅电池；多 晶硅电池；非晶硅电池等。单晶和多晶硅电池的光电转化效率达2 5 和1 8 ，但对 硅的纯度要求很高，制造成本高。而非晶硅电池的光电转化效率较低，达5 石。这 些因素影响了硅基太阳能电池的发展。 1 1 2 染料敏化太阳能电池 自1 9 9 1 年瑞士g r a t z e l l 4 教授研制成功纳米晶t i 0 2 光敏太阳能电池( d y e s e n s i t i z e d s o l a rc e l l ，d s s c ) ，这种电池近二十年得到快速的发展。纳米晶t i 0 2 光敏太阳能电池是 由一种在禁带半导体材料修饰、组装到另一种大能隙半导体材料上形成的，窄禁带半导 体材料采用过渡金属钌( r u ) 以及锇( o s ) 等有机化合物敏化染料，大能隙半导体材料 为纳米多晶t i 0 2 并制成电极，此外这种电池还选用适当的氧化还原电解质。这种电池 的工作原理：染料分子吸收太阳光能跃迁到激发态，激发态不稳定，电子快速注入到紧 邻的t i 0 2 导带，染料中失去的电子则很快从电解质中得到补偿，进入t i 0 2 导带中的电 于最终进入导电膜，然后通过外回路产生电流。纳米晶t i 0 2 光敏太阳能电池的优点在 于它廉价的成本和简单的工艺及稳定的性能。其光电转化效率稳定在1 0 以上，制作成 本仅为硅太阳能电池的1 5 - - 1 1 0 ，同时它的寿命能达到2 0 年以上，被认为是未来太阳 能电池的主导产品。此类电池开发刚刚起步，各方面研究还不够成熟。 其中，光敏染料的选择非常重要。一般认为用于d s s c 的理想染料敏化剂应满足以 下条件：具有宽的光谱响应范围，即应能在尽可能宽的范围内吸收可见太阳光谱； 应可以与氧化物半导体表面牢固的结合，并以高的量子效率将电子注入到其导带中； 具有高的稳定性，可经历1 0 8 次氧化还原循环，相当于在太阳光下暴露2 0 年：具 有足够高的氧化还原电势，使其能迅速结合电解质溶液或空穴导体中的电子给体而再生 【5 1 。目前研究最多的有两类染料：一类是过渡金属l 沁有机化合物敏化染料；另一类是 以卟啉为结构单元的染料。 过渡金属钌有机化合物敏化染料的稳定性高，光电转化效率高( 1 1 = 1 1 ) f 6 j ，具有 超常的电子注入效率，暗电子转移少，是目前d s s c 所使用的最好的敏化剂。但是它价 格昂贵，合成复杂，限制了其应用前景。 从光合角度看，卟啉类配合物有很大的发展潜力，但是这种配合物分子结构不稳定， 2 中国石油人学( 华东) 硕上学位论文 容易光氧化。此外卟啉类配合物有效地光谱吸收在5 0 0l l n l 7 0 0n m ，不能覆盖整个可见 光区以及红外区，不能充分的利用太阳光可见区的能量。目前光电转化效率最高的卟啉 类光敏剂是z n p 1 ，光电转化效率为5 。6 ，是钉类敏化剂光电转化效率一半。 1 1 3 光合膜蛋白基太阳能电池 众所周知，光合作用是地球上最重要的化学反应。它是人类赖以生存的粮食、能源 以及生态环境的基础；是维持地球上所有生命活动最根本的反应，对于一切生命生存、 繁衍和发展起着非常重要的作用i _ 7 1 。光合作用的第一阶段，叶绿体中捕光色素蛋白复合 体可以高效吸收几乎太阳光可见区的能量，并将其高效传递到光合反应中心，吸收传递 效率达到9 0o 旷9 8 。而光合反应中心能量转化的量子效率几乎能达到1 0 0 。如何模 拟自然界这种高效光合作用，并将光合作用同太阳能电池相结合，开发一个新型的生物 光伏元件引起了科学家们的广泛兴趣。 植物、藻类及光合细菌中具有光合作用所需的捕光蛋白复合物：光系统i ( p h o t o s y s t e mi ，简称p s i ) 和光系统i i ( p h o t o s y s t e m1 i ，简称p s i i ) 。p s i i 通过利用太 阳光能，光解水释放出氧，并把释放的电子导入p s i 。p s i 吸收光子并将得到的电子激 发，注入电子传递链，二者很好的协同作用将太阳光能高效转变为电势能。 图1 - 1 生物基太阳能电池原理图 f i g l - 1 p r i n c i p l eo fo p e r a t i o no f t h eb i o l o g i c a ln a n o c r y s t a i l i n es o l a rc e l l 如果把p s i 与电子供体连接，光照p s i 将驱动电子注入到电器元件，再接入外接电 路，形成个闭合回路如图1 1 ，即可研制出p s i 基太阳能光伏元件。可见此种生物基太 阳能电池与光敏染料敏化电池的原理相同，只是光敏化剂由p s i 代替。基于这种想法 第一章前言 2 0 0 4 年m i t 的张曙光等【8 】将菠菜p s i 固定于纳米t i 0 2 电极上，制成了p s i 基生物光伏 元件并检测到了具有开发前景的光伏电流。2 0 0 7 年日本学者n a o t e r a s a k i 等【9 】成功的 将p s i i 固定在涂有金纳米颗粒的电极上，产生电流的同时分解了水分子，研制成了第一 个p s | i 基太阳能电池。目前国内外许多科研机构正在从事此类电池的研究。 与1 1 2 所述的两类光敏化染料相比，p s i 具有以下优点：转化效率很高；捕 光范围几乎覆盖了整个可见光区( 3 8 0n m - 7 5 0 衄) ；环保，可自然降解。可见，生 物基太阳能电池具有重要的开发前景。 1 2p s i 的研究进展 1 2 1 p s i 结构与组成 光合作用是光合生物( 包括绿色植物、藻类和细菌) 将光能转化为化学能，并同时 将无机物转变成有机物贮存在生物体内的过程，是地球上绝大部分生命的能量和物质基 础。 光合作用包括一系列的光化学步骤和物质转变过程，可分为原初反应，电子传递， 光合磷酸化和c 0 2 固定四个过程。光合作用的光能吸收、传递和转化过程是在具有一定 分子排列和空间构象的色素蛋白复合体以及有关的电子载体中完成的，因此在分子水平 上揭示各种膜蛋白复合体的结构与功能及其相互关系对于揭示光合作用光能转化的机 理具有重要意义f 1 0 1 。这些复合体大多数都镶嵌在类囊体膜中，它们中最主要的膜蛋白复 合体有4 种：p s l i ，p s i ，细胞色素b j f ( c y t b d f ) 复合体以及a t p 合成酶复合体( c f 们f 1 ) 。 在这4 个色素蛋白复合体共同参与下，光合作用的光反应完成电子从h 2 0 到n a d p + 的 传递并产生a t p 和释放出0 2 。而其中p s i i 和p s i 都含有各自的捕光天线色素蛋白复合 体( l h c i i 和l h c i ，蓝藻例外) ，它们的主要功能是捕获光能并将其迅速传至反应中心 引起光化学反应。 4 中国i 油大学c 华东) 目 学位谚文 圈t 蓝藻类囊件膜上的光台膜蛋白复台体 f i g l - 2t h e p o s i t i o no f d i f f e r e n t m e m b r a n ep r o t e i a s i n t h y i o k o i d 在进行光合作用时( 如图1 - 2 ) p s i 催化从它的原初电子供体p 7 0 0 ，经过一系列的 中间电子受体到达束端电子受体f a f e 的跨膜电子传递。还原态的末端受体( f ，f b ) 在 生理条件下，将电子传递给位于光合膜基质侧的水溶性铁硫蛋白f d ( f e r r e d o x i n ，简称 f d ) ，在f d ：n a d p + 氧化酶( f n r ) 的作用下电子最终被传递给n a d p + ，同时，氧 化态的p t 0 0 + 经过细胞色素b d f 复合体和类囊体囊腔侧的水溶性电子供体质体兰素 ( p l a s t o c y a n i n ，简称p c ) 从p s i i 获得电子还原态的n a d p h 以及a t p 为后面c 0 2 的固定储存能量，最后利用水和c 0 2 合成有机物。另外p s i 还可以驱动环式电子传递 过程和假环式电子传递过程i 2 1 3 j 。 p s i 由光能吸收、传递和转化所需要的一系列蛋白质和结合在这些蛋白上的色素分 子及电子传递链组成。p s i 相对较多地分布在叶绿体类囊体膜的基质膜区而p s i i 则在基 粒膜区比较富集。2 0 0 1 年，p a t r i c k 等【l ”将嗜热蓝细菌s y n e c h o c o c c u se l o n g a t u s 的p s i 三聚体的结晶结构解析出来。2 0 0 7 年，a l e x e y a m u n t s 等将菠菜的的p s i 的结晶结构 解析出来，发现高等植物的p s i 进化程度比蓝藻的高，形成了独特的捕光天线复合物， 在亚基的组成卜也有所差别。 蓝藻的p s i 含有9 个跨膜的膜内周蛋白亚基，分别是：p s a a 、p s a b 、p s a f 、p s a l 、 p s a j 、p s a k 、p s a l 、p s a m 和p s a x ，3 个外周蛋白p s a c 、p s a d 和p s a e 。p s a a 和p s a b 绑定着绝大部分叶绿素a ( c h l a ) ，其中电子传递链有6 个c h l a ，2 个叶绿醌分子，2 个 第一章前苦 【4 f e 4 s 簇，分在p s a a 、p s a b 两条支路对称排列。p s a f 、p s a i 、p s a j 、p s a k 、p s a l 、p s a m 和p s a x 围绕在p s a a 和p s a b 周围，避免p s a a 和p s a b 遭受破坏l l 4 1 。 p s a a 和p s a b 在类囊体膜上以弄二聚体状态结合。这两个高度疏水的蛋白具有很高 的同源性和保守性，p s a a 和p s a b 蛋白约有4 5 的氨基酸残基相同，并且有10 的残基 是保守替换。分析两个蛋白亚基的氨基酸序列可以发现几个特点：p s a a 和p s a b 分 别含有1 1 个疏水区域，长度为1 9 2 5 个氨基酸残基，这些疏水区域在膜上形成跨膜螺 旋；大多数的带电荷残基都位于类囊体膜基质侧，从而参与了一些小亚基的结合， 如，p s a c 、p s a d 和p s a e ；在跨膜螺旋中存在大量组氨酸残基，它们可能参与了与叶 绿素分子的相互作用；在p s a a 和p s a b 中分别存在两个保守的半胱氨酸残基，可能 参与结合中间电子传递体f x ；p s a a 和p s a b 中存在亮氨酸拉链结构，通常参与蛋白 质与d n a 的相互作用，但它存在于p s i 反应中心部位显示它可能参与了p s a a 和p s a b 的结合1 1 6 】。p s a c 是一个由8 1 个氨基酸残基组成的位于类囊体膜基质侧的酸性亲水蛋白， 它含有两个0 【螺旋，结合两个 4 f e 4 s 簇中的f a 和f b 铁硫中心。p s a d 形成四个标准的 反平行b 折叠，p s a d 通过与带有负电荷的f d 之间的静电相互作用而为f d 提供必要的 结合位点，同时将电子从f x 传递到f a f b 上。p s a e 由五个标准的反平行p 折叠组成， 主要起维持p s a a 和p s a b 构象的作用。p s a l 可能是p s i 形成三聚体结构的必需成分， 它易受蛋白酶的降解，而在三聚体中则不易受到攻击【1 7 1 。 1 2 芝p s l 分离的方法 蛋白质提纯的目标是设法增加制品纯度或活性，对纯化的要求是以合理的效率、速 度、收率和纯度，将目的蛋白质从细胞的全部其它成分特别是不想要的杂蛋白中分离出 来，同时仍保留这种多肽的生物学活性和化学完整性1 1 8 1 。 能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质是因为不同的蛋白质在它们的 物理、化学和生物学性质上有着极大的差异，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和 数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可以是正电荷的、负电荷的、极性的或 非极性的、亲水的或疏水的。利用待分离蛋白质与其它蛋白质之间在性质上的差异，能 设计出一组合理的分级分离步骤。 蛋白质的纯化有许多种方法，作为膜蛋白的p s i ，其方法也基本适用。下面介绍几 种根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法1 1 8 】：分子的大小；溶解度； 吸附性质；对配体分子的生物学亲和力等。 6 中国石油大学( 华东) 硕上学位论文 1 2 2 1根据分子大小的不同 蛋白质分子最明显的特征就是颗粒大，并且不同的蛋白质的分子大小是不同的，因 此可以利用一些较简便的方法使蛋白质和小分子的物质分开，并使蛋白质混合物也得到 分离。 ( 1 )透析 透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质与其它小分子物质如无机 盐、单糖等分开。 ( 2 )密度梯度( 区带) 离心 如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密 度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时， 即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，分成区带的蛋白质 可以吸出收集。这种方法最适合于p s i 等较大的蛋白质复合体间的分级分离。 1 2 2 2 利用溶解度的差别 ( 1 ) 等电点沉淀和p h 控制 蛋白质是带有正电荷和负电荷基团的两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量则 因p h 不同而变化。当蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间 没有静电斥力而趋于聚集沉淀。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点 时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。 ( 2 )蛋白质的盐溶和盐析 中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的 溶解度，这种现象称为盐溶。当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始 下降，可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称作盐析。 ( 3 )有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质沉 淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。水是高介电常数物质，有机溶剂是低介电 常数物质，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，即增加了两个相反电荷之间 的吸引力。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此 促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 7 第一章前言 1 2 2 3 利用选择性吸附 吸附过程涉及范德华相互作用和氢键这些非离子吸引力。吸附层析就是利用待纯化 的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。 ( 1 ) 羟基磷灰石层析 吸附剂羟基磷灰石，可用于分离蛋白质或核酸。其吸附机制尚不完全清楚，但认为 与其表面上的钙离子和磷酸根有关，涉及偶极。偶极相互作用，可能还有静电吸附。 ( 2 ) 疏水作用层析 疏水作用层析就是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。 1 2 2 4 利用对配体的特异生物学亲和力 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建 立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从 复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。 p s i 的分离不外乎以上几种方法。一般说，p s i 的分离包括以下三个步骤：从植 物或藻类中获得粗类囊体膜；用表面活性剂将p s i 增溶到缓冲溶液中；p s i 的迸 一步纯化。p s i 的分离已经有了2 0 年 3 0 年的历史，其分离方法也有所不同，密度梯度 离心是最为常用的p s l 分离方法。 1 9 4 0 年，s m i t h 和p i c k e l 在菠菜中分离出叶绿素蛋白质复合物。b o a r d m a n 和 a n d e n s o n 在1 9 6 4 年首次分离出了代表p s i 和p s i i 的叶绿素蛋白质复合物颗粒，从结 构上证实了两个光合系统是独立存在的。第一个具有活性的p s i 复合物是由j e m u l l e t 等【2 0 1 采用蔗糖密度梯度离心的方法从豌豆中分离出来的。这种方法后来被视为分离和纯 化p s i 的经典方法。从此以后，许多学者采用相似方法分离p s i 。1 9 8 7 年，b d b r u c e 和r m a l k i n 2 1 1 首次从浮萍中分离出内源p s i 。1 9 9 0 年m r o e g n e r 等【2 2 】从嗜热蓝细菌中 分离出p s i 。1 9 9 3 年，vec h i t n i s 和r ec h i m i s 等【2 3 1 从蓝藻6 8 0 3 中分离出了p s i 三聚 体。1 9 9 4 年，j u ns u n 等【2 4 】将该方法进行了改进，简化了n a b r 反复清洗类囊体膜的过 程。同年，d r a g a n a 等【2 5 1 克服了大型藻类中含有大量多糖的限制，首次在海带中分离出 p s i 。2 0 0 2 年h e i l r i k 从拟南芥中分离出p s i 。国内的陈敏阳在刺松藻中分离出了p s i ， 刘洪艳等渊从裙带菜中分离出p s i 。杨劭1 2 9 1 从鱼腥藻7 1 2 0 中分离出来p s i 。 随着色谱技术的发展，学者们又开发出利用柱层析分离p s i 的方法：离子交换柱法 ( i e c ) 。1 9 9 2 年vv s u b i n 等【3 0 】采用d e a e t o y o p e a r l 离子交换柱成功的从钝顶螺旋藻 r 中国石油人学( 华东) 硕1 二学位论文 中分离出p s i 的单体和三聚体，随后n a v a s s a r d 等川对s h u b i n 的方法进行了改进。j k r u i p 3 2 1 用p o r o s 5 0h q 离子交换柱成功从钝顶螺旋藻中分离出p s i 。j k r u i p 和d b a l d 等吲用m o n o q 柱成功分离出p c c 6 8 0 3 的p s i 。此外，也可以将膜蛋白的亚基加以修饰， 连接上固定的靶点，通过亲和柱层析分离p s i 复合体。 相比于蔗糖密度梯度离心，柱层析方法简单，但对柱子的损害性较大，往往大大减 短柱子的使用寿命。 随着p s l 分离技术的成熟，近几年，p s i 的分离技术尚未有突破性进展，主要是沿 用以前固有的分离方法。学者们利用该技术分离各种植物以及藻类的p s i ，分离新型p s i 的报道不断出现。 1 2 3 影响p s l 分离的因素 影响p s l 分离的因素有很多，比如：离心速度的影响；增溶表面活性剂的影响；盐 的影响；其它混合介质的影响；操作温度的影响等。其中表面活性剂的影响最为关键， 因为p s i 作为一种膜蛋白，表面有大量的疏水区域，在水环境中容易聚集，增加了蛋白 的分离难度，而加入表面活性剂，表面活性剂的疏水基团可以覆盖p s i 的疏水区域，其 极性基团可以伸展在水中，形成氢键，加大p s i 的溶解性，从而为p s i 的分离提供了可 能。 1 2 3 1 表面活性剂的影响 随着溶液浓度的增加，溶液的表面张力先是急剧下降，到了一定浓度后，表面张力 趋于恒定值，起作用的这种物质称为表面活性剂。表面活性剂的分子具有共同的结构特 征它是由两种不同极性的原子基团组成，一种是亲水基团，与水分子的作用力较强； 另一种是疏水基团，它与水分子不易接近，却容易与“油，性分子接近【3 5 】。 表面活性剂在水溶液中形成胶束后，能够使不溶于或微溶于水的物质的溶解度显著 增大，这种现象叫做表面活性剂的增溶作用。增溶作用有以下几个特点：表面活性 剂浓度大于其临界胶束浓度( c m c ) ；增溶的发生是个自发过程，增溶后被增溶物的 化学势降低，使体系更趋稳定；体系是透明的均相溶液，没有明显的界面存在；通 常溶解过程中会使溶液的依数性有很大变化，但增溶体系的依数性变化很小，这说明增 溶过程中溶质没有分解成分子或离子，而以团簇或碎片形式分散在表面活性剂胶束的某 一部位。 增溶是膜蛋白分离的重要一步。整合膜蛋白本身大部分包裹在磷脂双分子层中，通 o 第一章前言 过表面活性剂的增溶，使表面活性剂逐渐代替磷脂，从而将提取蛋白分散在溶液中。1 9 4 0 年，s m i t h 和p i c k e l 用十二烷基硫酸钠( s d s ) 增溶菠菜的叶绿体，再用离心法分离得 到叶绿素蛋白复合物。b o a r d m a n 和a _ n d e n s o n 1 9 1 在1 9 6 4 年首次用毛地黄皂苷( d i g i t o n i n ) 增溶并分离出了代表p s i 和p s i i 的叶绿素蛋白质复合物颗粒。自此之后，人们对增溶条 件和分离技术进行了大规模改进，2 0 世纪6 0 年代前后，温和的两性离子表面活性剂n ( 2 羧乙基) - n 十二烷基p 丙氨酸二钠( d e r i p h a t l1 6 0 ) 和非离子型表面活性剂曲拉通( t r i t o n x 1 0 0 ) 、辛基p d 葡萄糖苷( o g ) 、十二烷基d d 麦芽糖苷d m 等糖苷衍生物被广泛 使用。 ( 1 ) 表面活性剂的分类 表面活性剂按溶于水后亲水基团是否解离、解离成何种离子，分为阴离子型表面活 性剂( 如s d s ) ，阳离子型表面活性剂( 如十六烷基三甲基溴化铵c t a b ) ，非离子型表 面活性剂( 如t r i t o n x - l o o ) ，两亲型表面活性剂( 如月桂基二甲基氧化胺l d a o ) 。 表面活性剂的类型对膜蛋白具有非常重要的意义。由于膜蛋白表面电荷的不同对表 面活性剂的要求也不同。例如阴离子型的胆酸( c h o l i ca c i d ) 和脱氧胆酸( d e o x y c h o l i ca c i d ) 对线粒体膜中的蛋白溶解能力很强，但对类囊体膜上的蛋白却没有很好的作用。阴离子 型表面活性剂，有很强的水溶性，自身带的电荷能很好的将p s i 溶于溶液中，但同时又 破坏了蛋白本身的结构，使蛋白失活。阳离子型表面活性剂极性基团的水溶性较弱，对 某些表面带负电荷的膜蛋白具有一定的保护作用。而两亲型l d a o 向来是学者们溶解膜 蛋白的理想试剂，已被成功应用于多种膜蛋白的增溶和结构生物学研究中 3 6 l 。随着对表 面活性剂研究的深入，人们发现非离子型表面活性剂对光合膜蛋白有很好的溶解能力， 其中洋地黄皂苷( d i g i t o n i n ) 和曲拉通( t r i t o nx 一1 0 0 ) 的应用最为广泛。后来人们又开 发出来了糖苷衍生物o g 、d m 等，都能很好的溶解稳定光合膜蛋白。这类表面活性剂 由于极性基团和疏水基团的不同对膜蛋白的增溶能力也有所差别，研究表明极性基团大 而疏水基团链短而柔软的活性剂更容易取代磷脂【3 7 1 ，而对膜蛋白具有较好的增溶效果。 ( 2 )表面活性剂的浓度 选定了表面活性剂，浓度的控制也很重要。膜蛋白大部分是由多个亚基组