原核表达调控3分子生物学ppt课件.pptx

7.6转录水平上的其他调控方式,转录过程涉及转录机器附着于DNA，识别启动子序列，起始RNA的合成，延伸和终止。转录的任何一步都受到调控。转录水平上以下其它调控方式：因子的调节作用组蛋白类似蛋白的调节作用转录调控因子的作用抗终止因子的调节作用,7.6.1因子的调节作用,不同的因子可以独立地起作用，但是，为了保证细胞准确地响应不同的环境信号变化，因子之间常常交互作用构成网络调控模式，使得原核基因的表达稳定而平衡。因子本身的活性受蛋白水解酶的调控，也能被同源的抗因子失活。抗因子能够与特定的因子结合，阻止它们与RNA聚合酶组装。,原核生物RNA聚合酶,2,亚基（factor）的功能是帮助核心酶识别启动子，它不是RNA链延伸必需的。能提高RNA聚合酶与特异启动子的亲和力，也能降低与非特异启动子的亲和力。新生RNA链达到6-9个核苷酸，形成稳定的酶-DNA-RNA复合物时，因子释放。Thefactor通过降低核心酶与非特异序列的亲和力,和增加其与启动子的亲和力来帮助核心酶识别启动子。无factor的核心酶也能在DNA模板上合成RNA，但不能正确地起始转录。,E.coli有不同的factor分别转录不同类型的基因。这在基因表达调控中起重要作用。,连续置换,7.6.1.1噬菌体spo1基因的表达,7.6.1.2枯草杆菌的孢子形成过程中的级联调控,芽孢的形成与释放,芽孢形成过程中的因子激活级联,F激活早期芽孢形成基因的转录,E激活母细胞前期分化基因的转录,隔膜,G激活晚期芽孢形成基因的转录,K激活母细胞后期分化基因的转录,级联保证了芽孢形成过程中各个步骤按正确的顺序发生。在级联中每一因子控制着芽孢形成的一个阶段，并且控制着在下一阶段发挥作用的因子合成。并且在母细胞和芽孢之间存在着信息交换，使前芽孢和母细胞中的基因表达相互协调。,抗因子与抗抗因子,7.6.1.3热激蛋白的表达,大肠杆菌的最适生长温度是37。当温度上升至46时，大肠杆菌几乎停止生长。在46下细胞合成的蛋白质大约30为一组相当保守的热激蛋白（heatshockprotein,HSP）。很多热激蛋白是分子伴侣（molecularchaperones）和蛋白酶。分子伴侣的作用是介导蛋白质正确折叠；蛋白酶的作用则是降解受到热损伤而又不能修复的蛋白质。,热激蛋白的表达调控主要发生在转录水平上。热激蛋白基因的启动子被32而不是通常的70识别。32也不能识别70启动子，因为这两种因子识别的启动子序列不一样,HSP的诱导合成是由于细胞内的32水平瞬间升高引起的。在热激条件下，32的合成会增加，热激诱导32合成发生在翻译水平。另一方面，在热激条件下32的稳定性也增加了。,7.6.2组蛋白类似蛋白的调节作用,细菌中存在一些组蛋白类似蛋白，能非特异地结合DNA，维持其高级结构（例如H-NS）。H-NS先结合到DNA上，然后通过Pr-Printeraction形成多聚体以帮助维持DNA的高级结构；H-NS与大肠杆菌基因组上分散的大量基因的调控区有较高的亲和性，这些基因大都与环境条件的变化有关，H-NS的结合能抑制这些基因的转录。,7.6.3转录调控因子的作用,大肠杆菌中大约有300多个基因编码与启动子区结合的蛋白，它们能激活或抑制转录，称为转录调控因子。它们大多是序列特异性的DNA结合蛋白，能与特定的启动子结合。有些转录调控因子能调控很多基因的表达（如CRP,FNR,IHF,Fis），有些只能调节一两个启动子。许多基因的启动子区有多个转录调控因子的结合位点，共同作用才能使RNA聚合酶顺利起始基因转录。,7.6.4抗终止作用,抗终止蛋白阻止转录的终止作用，因此RNA聚合酶能够越过终止子继续转录DNA。抗终止因子在RNAP到达终止子之前与之结合。主要见于噬菌体和少数细菌。,噬菌体是以E.coli为宿主的温和病毒。它一旦感染细菌就会以2种方式繁殖。溶源途径：噬菌体感染E.coli后，将其基因组整合到细菌染色体上，随着细菌染色体的复制而复制。整合有噬菌体基因组的细菌称为溶源菌，这一过程称为溶源途径。溶菌途径：噬菌体感染宿主后也可以利用细菌细胞内的养料进行繁殖，最终使宿主裂解而死亡，这一过程称为溶菌途径。溶菌途径需要噬菌体DNA的复制和病毒外壳蛋白的形成。,噬菌体裂解周期中的级联调控依赖于抗终止作用,噬菌体裂解周期中的级联调控依赖于抗终止作用,溶源性细菌在正常情况下非常稳定；但在细菌受某些外界物理或化学因素(如紫外线、丝裂霉素C等)的作用，就会有效的转向溶菌途径。原噬菌体便脱离细菌染色体而进行自主复制，于是细菌裂解，游离出大量的噬菌体，这一过程称为溶源性诱导。对繁殖途径的选择依赖于细胞对2种选择性基因表达程序的选择。,BacteriophageLambda,7.7转录后调控,基因表达的转录调控是生物最经济的调控方式。但转录生成mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行“微调”，是对转录调控的补充，它使基因表达的调控更加适应生物本身的需求和外界条件的变化。调控方式有：mRNA自身结构元件对翻译起始的调控mRNA稳定性对转录水平的影响调节蛋白的调控作用反义RNA的调节作用稀有密码子对翻译的影响重叠基因对翻译的影响翻译的阻遏魔斑核苷酸水平对翻译的影响,7.7.1mRNA自身结构元件对翻译起始的调控,大肠杆菌有14%的基因起始密码子是GUG、3%为UUG，另有两个是AUU，这些密码子与fMet-tRNA的配对能力比AUG弱，从而导致翻译效率下降。,mRNA的二级结构也是翻译起始调控的重要因素。因为核糖体的30S亚基必须与mRNA结合，要求mRNA5端有一定的空间结构。SD序列的微小变化，往往会导致表达效率成百上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成mRNA5端二级结构的自由能，影响了30S亚基与mRNA的结合，从而造成了蛋白质合成效率上的差异。,RBS的结合强度取决于SD序列的结构及与AUG的距离。SD与AUG相距一般以410核苷酸为佳，9核苷酸最佳。,核糖开关(riboswitch):mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象，这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子、离子浓度或温度等，从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的。调控机制1：转录水平的调控：主要是控制终止子和抗终止子的形成，达到调控的目的2：翻译水平的调控：控制剪切功能,GlcN6P与核酶结合，有活性的核酶会切割glmSmRNA，阻止蛋白质翻译。,7.7.2mRNA稳定性对转录水平的影响,所有细胞都有一系列核酸酶，用来清除无用的mRNA。一个典型的mRNA半衰期为2-3min。mRNA分子被降解的可能性取决于其二级结构。,7.7.3调节蛋白的调控作用,细菌中有些mRNA结合蛋白可激活靶基因的翻译。相反，mRNA特异性抑制蛋白则通过与核糖体竞争性结合mRNA分子来抑制翻译的起始。大肠杆菌中的核糖体蛋白就存在翻译抑制现象。,与mRNA起始区结合抑制翻译的阻抑蛋白,7.7.4反义RNA的调节作用,RNA调节是原核基因表达转录后调节的另一种重要机制。细菌响应环境压力的改变，会产生一些非编码小RNA分子，能与mRNA中的特定序列配对并改变其构象，导致翻译过程的开启或关闭等作用。,1983年Mizuno、Simous、Kleckner同时发现反义RNA（antisenseRNA）。反义RNA(antisenseRNA)是与mRNA互补的RNA分子。,7.7.4.1反义RNA的作用,反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合，从而抑制该mRNA的加工与翻译。可调控原核细胞中基因表达、控制噬菌体溶菌-溶源状态以及抑制转座子的转位作用等。在真核细胞中也存在反义RNA，但功能尚未全部搞清楚。通过人工合成反义RNA的基因，并将其导入细胞内转录出反义RNA，即能抑制特定基因的表达，阻断该基因的功能，有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也有对肿瘤实施基因治疗的可能性。,7.7.4.2反义RNA的作用机制,反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和（或）编码区，引起翻译的直接抑制或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNase的敏感性增加，使其降解。反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合，从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后阻止了核糖体的结合。反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。反义RNA和mRNA有不完全的互补序列，可以形成双链的RNA杂交体。而在mRNA上紧随杂交区之后的是一段U丰富区。其结构类似于终止子结构，从而使转录开始不久后即终止。,7.7.4.3人工合成构建反义RNA,通过人工设计在天然状态下不存在的反义RNA，可调节靶基因的表达。由于对靶mRNA的SD序列上游区的结构了解甚少，因此，很难设计用于和靶mRNASD序列上游区结合的反义RNA。在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA的作用可能更有效。在真核生物中，对应于5端非编码区的反义RNA比针对编码区的反义RNA更有效。也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效。如果在靶mRNA上找到一段连续的U序列，就可以设计出反义RNA，与该U序列上游的mRNA链互补，以形成类似终止子结构。在转录水平上抑制靶基因的表达。,RegulationoftargetRNAsbyOxySandDsrA.TheleftboxshowsaschematicsofinhibitionmechanismsofOxySandtherightboxinhibitionbyDsrA.,7.7.5稀有密码子对翻译的影响,dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内50个拷贝的DnaG蛋白，2800个拷贝的RpoD蛋白；40000个拷贝的RpsU蛋白。基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。,细胞可通过翻译调控不同蛋白含量的高低。即使对于同一操纵子上不同的基因，其产物在数量上也可大不相同。,许多调控蛋白在细胞内含量很低，编码这些蛋白的基因中高频率地使用了很多稀有密码子，稀有密码子对应次要（低丰度）的tRNA。因此，翻译速度受tRNA供应的限制，影响了蛋白质合成的总量。而其它基因中利用这些稀有密码子频率很低。,7.7.6重叠基因对翻译的影响,正常情况下，trp操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trpD产量比下游trpBA产量要低得多。研究trpE和trpD以及trpB和trpA两对基因中核苷酸序列与翻译的关系，发现trpE基因的终止密码子和trpD基因的起始密码子共用核苷酸。trpE-ThrPheSTP.ACUUUCUGAUGGCU.MetAla-trpDtrpB-GluIleSTP.GAAAUCUGAUGGAA.MetGlu-trpA,偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。,galT的终止密码子与K的起始密码子相隔3个核苷酸，但K基因的SD序列却位于T基因的终止密码子之前。当T翻译终止时，核糖体覆盖了SD序列和K基因的起始密码子，还没有脱落就开始了K的翻译。,7.7.7翻译的阻遏,转录水平的调控一般都是蛋白质或某些小分子物质对基因转录的阻遏或激活，而在翻译水平上也发现了类似的蛋白质阻遏作用。大肠杆菌RNA噬菌体Q包含有3个基因，当噬菌体感染细菌，RNA进入细胞后，这条称为(+)链的RNA可直接作为模板指导RNA复制酶的翻译，并与宿主中已有的亚基结合行使复制功能。但是Q(+)RNA链上已结合有许多核糖体，它们从5向3方向进行翻译，这必将会影响复制酶催化的从35端方向进行的(-)RNA链的合成。这一矛盾的解决就需要QRNA复制酶作为翻译阻遏物进行调节。,基因A外壳蛋白RNA复制酶,翻译,+RNA,复制受阻,阻遏翻译起始,翻译结束开始复制,+RNA-RNA,噬菌体Q,细菌在葡萄糖缺乏时可产生报警物质cAMP；可保证其利用其它糖类，如lac（乳糖）操纵子、gal（半乳糖）操纵子和ara（阿拉伯糖）操纵子等。细菌在饥饿条件下，缺乏各种氨基酸使得蛋白质合成受阻，将采取关闭大量的代谢过程来抵御不良条件，保存自己的一种机制。当氨基酸缺乏时，tRNA成为空载体，就触发ATP和GTP合成