实验室基本知识.ppt

1,第三章实验室基本知识,水玻璃仪器实验方法选择与评价,2,第一节实验用纯水,一、纯水制备方法,蒸馏法：离子交换法：Na+、Ca2+与H+交换Cl-、SO42-与OH-交换电渗透法：炭吸附法：超滤膜法：混合纯化系统：,3,二、水的纯度检查,电阻率：1s=1欧姆-1菌落计数：纯水标准：I级：10兆欧姆；II级：2兆欧姆,4,第二节实验用玻璃仪器,容器：反应、贮存量器：计量体积,5,普通玻璃仪器的使用,量筒：不做反应器，不装热液体，不加热容量瓶：与瓶塞配套，不一次加到刻度，不加热移液管和吸量管：使用的注意事项自动加样器：,6,普通玻璃仪器的使用,试管：烧杯：漏斗：干燥器：凡士林密封；开启时将盖推向一侧；CaCl2,CaO,NaOH,硅胶等,7,玻璃仪器的清洗,新仪器：肥皂刷洗-稀盐酸浸泡过夜-自来水洗-蒸馏水洗-烤干,8,用过仪器：,容器类:自来水冲-肥皂刷洗-自来水洗-蒸馏水洗-烤干,量器类:用后浸入冷水-冲洗附着物-浸铬酸液过夜-自来水冲-蒸馏水洗-晾干,9,第三节实验方法的选择,一、目的：按原则结合自身条件，确定合适方法对方法分析性能、误差进行评价,二、方法分类：决定性方法：参考性方法：常规方法：,10,三、标准试剂分级：（一）一级标准品（二）二级标准品（三）控制物,11,选择原则,实用性：微量快速；方法简便；安全可靠；成本低廉,可靠性：较高精密度、准确度和较大检测能力,12,选择步骤,查阅文献,选定候选方法,初步试验：标准曲线和重复性质控血清、新鲜标本的重复实验分析不同浓度标本，与参考方法对比,13,实验方法评价的过程就是对实验误差的测定。根据评价实验所测得的结果和方法性能的判断标准，决定该方法是否可以接受。,第四节实验方法的评价,14,一、实验误差,概念：指量值与真值之差。（真值：严格条件下最准确精密方法，多次测得结果的平均值）,分类：系统误差恒定系统误差比例系统误差随机误差,15,16,系统误差：是指一系列测定值对真值存在同一倾向的偏差。单向性而没有随机性。一般由恒定因素引起的，在一定条件下多次测定中重复出现。找出原因后，采取一定措施可纠正,17,恒定系统误差：是指由于干扰物引起的，使测定值与真值存在恒定大小的误差，误差的大小与被测物浓度无关，而与干扰物的浓度有关。,比例系统误差：是指相对于被测物浓度有相同的百分比误差，误差的绝对量与被测物浓度成正比。,18,随机误差是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时出现的误差。其特点是：误差没有一定的大小和方向、可正可负，数据呈正态分布。不可预测、不可避免，分析步骤越多，造成这种误差的机会越多。随测定次数增加，其算术平均数就越接近于真值。,19,引起系统误差的主要原因,方法误差：即由于该方法的分析性能本身固有的缺陷所致，如特异度不高、标本中干扰物的存在等。仪器和试剂存在问题,20,引起随机误差的主要原因,测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变。分析人员的操作习惯等条件的变化。还应指出的是引起系统误差和随机误差的原因在一定条件下能相互转化。,21,实验误差的表示方法,因误差的性质不同，实验误差采用不同的表示方法，它们是：平均误差（算术平均偏差）标准差（标准偏差）绝对误差和绝对偏差相对误差和相对偏差变异系数,22,是指一组测定值中，测定值与均值之差的平均值。即算术平均偏差。,平均误差（dm),23,是方差（S2）的平方根值。它是表示精密度的较好的指标，测定次数一般要求在10次以上。,标准差（S）,24,是指测定值与真值间的差值。绝对误差=测定值（X）真值（T）绝对偏差是指测定值与测定均值的差值。绝对偏差=测定值（X）测定均值（）,绝对误差,25,相对误差是指绝对误差与真值的百分比值。,26,相对偏差是指绝对偏差与测定均值的百分比值。,27,变异系数（coefficientofvariation,CV）是指样本标准差与样本均数的百分比值。,CV用于比较各组数据间的变异情况，CV值越大，就表明测定值的离散度越大，说明该方法的精密度越差。,28,二、方法评价的基本内容,是通过实验途径，测定并评价方法的精密度和准确度。评价实验的过程就是对误差的测定。,29,方法评价的步骤,根据方法选择的要求确定某方法（即侯选方法），在使用前最好经本实验室进行评价实验，步骤如下：评价前实验初步评价最后评价评价后实验方法应用,30,方法评价的指标,实验方法评价的指标包括：精密度准确度特异度和干扰检测能力等,31,精密度,精密度（precision)是指同一标本，在一定条件下多次重复测定所得到的一系列单次测定值之间的符合程度。它表示测定结果中随机误差大小程度的指标。,32,精密度的大小可用标准差（S）或变异系数（CV%）来表示。当用S和CV%表示精密度时，通常应指出实验重复的次数（n）及其平均值（）,33,连续测定精密度是指在相同条件下，对同一标本连续进行n次重复测定结果的符合程度。,34,重复性精密度又称室（批）内精密度是指相同的条件下（同样方法、同种试剂和标准品、同样的仪器、同一实验室由同一人操作，并要保持实验期间准确性不变）对同一标本，在尽可能短的时间内进行m轮n次重复测定结果之间相互接近的程度。,35,用变异系数表示时则表示连续测定精密度表示重复性精密度,36,准确度,准确度（accuracy）是指测定结果与真值接近的程度。准确度主要受系统误差支配。准确度一般用偏差和偏差系数来表示。,37,偏差为重复测定的均值（）与真值之差。,38,特异度和干扰,特异度（specificity）即特异性或专一性，是指在特定实验条件下分析试剂只对待测物起反应，而对其它结构相似的非被测物质不发生反应。分析方法的特异度越高，则测定结果越准确。,39,干扰（interference）是指标本中某些非被测物质本身不与分析试剂反应，但以其它形式使待测物测定值偏高或偏低，这些非被测物质称为干扰物，这种现象称为干扰。,40,例如：用邻甲苯胺法测定葡萄糖时，标本中的甘露糖、半乳糖等也能与邻甲苯胺反应，并产生与葡萄糖反应相似的吸收光谱，引起正偏差，这就是特异度欠佳的表现。,41,GOD-POD法测定血糖时，尿酸可和GOD催化葡萄糖产生的H2O2反应，使部分H2O2不能参加POD的第二步反应，造成显色程度下降，引起负偏差。此过程尿酸本身并未与试剂直接反应，但对GOD-POD法测定血糖有干扰。,42,检测能力,检测能力，即检测限度或检出限（detectionlimit）是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小值。空白读数是指由基质、试剂所得的读数。常用“空白读数+3S”表示检出限,43,评价实验,评价实验包括：重复性实验回收实验干扰实验分析比较实验,44,重复性实验,所谓重复性试验就是将同一材料分成数份试验标本进行多次分析测定，并计算其均数（）、标准差（S）、和变异系数（CV）。目的是检测侯选方法的随机误差。,45,重复性试验按其进行的形式不同分为：批内重复性试验日内重复性试验日间重复性试验病人标本的平行双份测定,46,批内重复性试验,用同一份标本在短时间内用侯选的方法作多次（一般20次）重复测定。一般要求CV应小于5%，精密的分析或多次平行测定要求CV小于2%。,47,日内重复性试验,在一天内对同一个或数个标本作数批重复测定，观察变异结果。因在一天内重复测定数批，所受影响因素比批内多，所得CV值可能比批内稍大些。,48,日间重复性试验,将同一标本分成数份，用侯选的方法每天测一次，连续测20天，观察变异结果。日间重复性试验的CV可能比日内重复性的大，但它可反映工作的实际状况。,49,病人标本的平行双份测定,在不易得到含有合适基质的稳定标本的情况下，常选择一批病人标本（20100份），其待测物浓度不超过方法的分析范围，作一批或数批测定，每标本均平行做两份，用双份测定结果之差（d）来计算S。,50,回收试验,将已知浓度的被测物标准液加入到常规标本中，然后用侯选的方法，测定标本加入前后的结果，观察其对加入物的回收能力，称为回收试验。通常用回收率表示。本试验的目的是检测侯选方法的比例系统误差。,51,回收试验的方法,将被测物标准液加入到病人标本中，成为分析标本；原病人标本中加入等量的无被测物的溶剂作为基础标本，然后用侯选的方法测定并计算各自的结果。基础标本：血清2ml+蒸馏水0.1ml分析标本：血清2ml+30mmol/L葡萄糖标准液0.1ml,52,回收试验的计算,回收浓度=分析标本测得浓度基础标本测得浓度,53,回收试验的注意事项,准确吸量加入标准物的量一般占标本总体积的10%以内标准液的浓度比所要增加的浓度至少高10倍,54,加入标准物后，最好使分析标本的浓度达到医学决定水平，而总浓度必须在该方法的分析范围内。最好作高、中、低不同浓度标准液的回收试验，再计算平均回收率。最好重复测定23次,55,举例标本制备基本标本：血清2ml+蒸馏水0.1ml分析标本1血清2ml+30mmol/L葡萄糖标准液0.1ml分析标本2血清2ml+50mmol/L葡萄糖标准液0.1ml,56,按操作要求测定上述标本，并将结果填入下表,回收试验检测结果,测定浓度加入浓度回收浓度mmol/Lmmol/Lmmol/L,回收率（%）,基础标本5.88分析标本16.800.950.9296.8分析标本28.682.862.8097.9,57,回收率理想值为100%，实测值与理论值之差为比例系统误差的估量值，上例中平均回收率97.4%，说明比例系统误差为2.6%，表明一个标本葡萄糖浓度为6.67mmol/L，用该法测定值为6.5mmol/L，误差为0.17mmol/L（即6.67mmol/L2.6%）,58,干扰试验,加入某些干扰物，观察不同浓度的干扰物对候选方法的影响而造成的误差，这种试验方法称为干扰试验。干扰物浓度不同，误差大小也不同。干扰试验是用来检测侯选方法的恒定系统误差。,59,干扰试验的方法,将可能引起干扰的物质配成一定浓度加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加入相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本；然后用侯选方法对些两样本同时测定，两者之差即表示该干扰物质产生干扰所引起之误差，即干扰值。干扰值=分析样本测得值基础样本测得值,60,举例尿酸对GOD-POD法测定血糖的干扰,样本制备基础样本：血清0.9ml+蒸馏水0.1ml分析样本1：血清0.9ml+4mmol/L尿酸0.1ml分析样本2：血清0.9ml+8mmol/L尿酸0.1ml尿酸样本：蒸馏水0.9ml+8mmol/L尿酸0.1ml,61,用GOD-POD法测定，结果填入下表,葡萄糖测得值加入尿酸值干扰值（mmol/L）(mmol/L)(mmol/L),基础样本6.50分析样本16.200.400.30分析样本25.950.800.55尿酸样本0,62,表明正常血清尿酸为0.4mmol/L，由于干扰作用，使血糖测定结果减少0.28mmol/L,63,注意事项,参照回收试验的注意事项。本试验的误差包括干扰物及方法特异度不高所引起的误差。被试的干扰物质根据方法的原理提示何种物质可能引起干扰，一般应考虑胆红素、溶血、脂血，某些代谢物、抗凝剂、防腐剂、药物、食物等。干扰物的浓度及确定，使分析结果影响临床应用价值的最低干扰物浓度。,64,消除干扰的常用方法,设立试剂空白和标本空白管，以校正标本中被测物以外的其它物质干扰。采用各种物理、化学等方法，除去干扰物的影响。采用双波长或多波长检测，以排除干扰。,65,方法比较试验,对一组病人的标本，用候选取的方法和比较的方法同时进行分析测定，观察对比两种方法测定结果的差异。比较试验又称对比试验。它是考验侯选方法是否可采用的重要措施。,66,注意事项,试验的标本数和分析物浓度一般要做40100例。最好包括各种疾病的标本，所得结果应包括在常规工作中可能遇到的整个分析范围。重复分析一般每个标本用两种方法各测定一次，最好能分批测定两次。两种方法及两批测定，须在同一天内，最好是在4小时内进行。实验的时间间隔每天测定25个标本，约20天完成整个比较（对比）试验。,67,比较（对比）试验的结果以图表示,68,结果的统计学处理,方法比较试验所得的结果是配对资料，可进行配对资料的统计学处理，包括t试验F试验相关系数（r）直线回归分析等。,69,第五节诊断性能评价,一、参考值和参考范围：选取一群健康人测定某项指标。计算平均值和标准差。均值做为参考值，上述结果的95%分布区间（2S）做为参考范围,70,注意事项,正确选择标本，消除有影响的因素合理规定参考人群条件受检人数一般100测定方法标准化确定单双侧位界,71,二、医学决定水平,对临床诊治疾病有决定性作用的物质浓度，是临床按不同病情给予不同治疗方案的阈值,72,三、诊断灵敏度、特异度、预测值和似然比,诊断实验：常规检测方法金标准：活检、尸检、手术、随访等做决定性诊断,73,有病,无病