（化学工艺专业论文）色谱法纯化三七叶甙及其指纹图谱的方法学研究.pdf

摘要 摘要 本论文采用反相高效液相色谱法，对三七叶甙的纯化进行了研究，得到适宜 的色谱制备工艺参数。同时建立三七叶甙及其色谱纯化样品的指纹图谱，实现运 用药材规范化标准来进行有效的质量控制。 反相高效液相色谱制备技术是分离纯化天然药物的研究热点，本文以三 七茎叶提取物为原料，考察了各项制各色谱参数及产品的纯化途径，最终确 定了制备色谱适宜的流量、流动相、上样量。采用本实验中的制备工艺，所 得纯化样品中指标成分r b 。的含量达8 0 9 0 ，质量收率在7 0 左右，可作 为三七叶甙纯品的实验室制备工艺或放大作为工业生产工艺。 中药指纹图谱研究是近年来兴起的对其质量进行控制的有效方法，是实现中 药现代化的首要一环。本实验利用高效液相色谱和液相色谱质谱联用技术构建 三七叶甙及其色谱纯化样品的化学成分指纹图谱，并由质谱解析结果与对照品的 色谱保留时间、紫外光谱的对比，确定其含有人参皂甙r b 。有效成分。实验得到 全面反映三七叶甙及其色谱纯化样品内在质量，稳定、均一的高质量指纹图谱， 建立了三七叶甙有效的质量评价标准。 关键词：三七叶甙，人参皂甙r b 。，反相高效液相色谱，制各工艺，指纹图谱 液相色谱质谱联用技术 垒呈! ! 坠g ! a b s t r a c t i nt h i sd i s s e r t a t i o n , p r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h ym e t h o do fp u r i f y i n gs a p o n i n si n p a n a xn o t o g i n s e n g l e a v e sw a sd e v e l o p e d t h eo p t i m a lt e c h n i c a lp a r a m e t e ro f p r e p a r a t i o np r o c e d u r e w r sd e t e r m i n e d t h ef i n g e r p r i n t so fs a p o n i n si np a n a x n o t o g i n s e n gl e a v e sa n dt h ec h r o m a t o g r a mp r e p a r a t i o nw e r ee s t a b l i s h e dt oc o n t r o l c r i t e r i o nf o r 也em o d e r n i z a t i o no f t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e r e v e r s e p h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yh a db e e nh o ti s s u e si ns e p a r a t i o no ft h en a t u r e p r o d u c t s u s i n gt h ec r u d ee x t r a c t so fs t e m sa n dl e a y e s a sm a t e r i a li np r e p a r a t i v e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yc o l u m n ，t h ee f f e c t so f t h ef l o wr a t e ，t h ec o n t e n t s & t h em o b i l e p h a s ea n dt h es a m p l eq u a l i t yi nt h es e p a r a t i o np r o c e s sw e r ei n v e s t i g a t e dr e s p e c t i v e l y t h u s ，t h es u i t a b l ec h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h ec o n t e n to f g i n s e n o s i d er b 3i nt h ep r o d u c tw a sa b o u t8 0 9 0 a n d t h er e c o v e r yy i e l dw a s7 0 t h i sm e t h o dw a se f f e c t i v et op u r i f ys a p o r d n si np a n a x n o t o g i n s e n g l e a v e s t h ef i n g e r p r i n t sw e r eo n eo ft h ea v a i l a b l et e c h n i q u e st ot h eq u a l i t yc o n t r o lo fi t h p l ca n dl c m sw e r eu s e dt oe s t a b l i s ht h ef i n g e r p r i n t so fs a p o n i n si np a n a x n o t o g i n s e n gl e a v e sa n dt h ec h r o m a t o g r a mp r e p a r a t i o n t h ea n a l y s i so fm a s ss p e c t r u m s h o w e dt h a t ：t h e c h r o m a t o g r a mp r e p a r a t i o nh a dg i n s e n o s i d er b 3 t h ee x p e r i m e n t m a d et h eh i g h q u a l i t y , c o n t r o l l a b l e ，s t a b l ea n du n i f o r mf i n g e r p r i n t st oo v e r a l lr e f l e c t t h e q u a l i t yo fs a p o n i n s i n p a n a xn o t o g i n s e n gl e a v e s a n dt h ec h r o m a t o g r a m p r e p a r a t i o n k e yw o r d ：s a p o n i n si np a n a xn o t o g i n s e n gl e a v e s ，g i n s e n o s i d er b 3 ，r e v e r s e - p h a s e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , p r e p a r a t i o np r o c e d u r e ，f m g e r p r i n t s ，l c m s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：茜，盔乙 签字日期： 御垆年，一月。眵日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨注盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：茄，瓤 签字日期：a 卯聋年触月够日 导师签名 绋金皇、 签字日期：夕优巧绎肛肖二舶 前言 前言 三七作为一种第三纪古热带的残遗植物，可能是现存人参属植物中最原始的 代表，主要分布在云南省东南部的文山、蒙自和广西壮族自治区西部的田东j 田 阳、靖西等地。三七叶甙为其茎叶提取得到的总皂甙，随着中药药剂学的发展， 三七叶甙的作用与功效日益受到瞩目，临床应用越来越广泛，使其相关制剂、剂 型得到不断增加和更新，因而对三七叶甙的提取、分离、纯化工艺技术提出了更 高的要求。 三七作为我国传统的名贵中药材，其疗效不容置疑，但由于质量不稳定及缺 乏科学的质量评价体系，严重地制约其在国际市场的竞争力。明确中药质量标准 成为中药现代化、国际化的前提。采用中药指纹图谱方式，能够有效地把表征中 药的质量。中药指纹图谱由予可以全面反映中药所含化学成分的种类与数量，一 旦将指纹图谱技术作为中药的检测手段，中药质量的最终检测标准将更为有效。 同时指纹图谱也为国际社会所认可，有利于中药及其产品进入国际市场。目前中 药指纹图谱已成为天然药物辨别真假的最有力的武器。因此建立与现代科技相结 合，适应现代社会需要的三七叶甙的指纹图谱，具有重要意义。 本论文采用反相高效液相色谱法，对三七叶甙单体的制备工艺进行了研究， 得到最优的色谱制备工艺参数。同时建立三七叶甙及其色谱纯化样品的指纹图 谱，得到全面反映其内在质量、稳定、均一的高质量指纹图谱，建立了三七叶甙 有效的质量评价标准，为运用药材规范化标准来对其进行有效的质量控制提供依 据。 第一章文献综述 第一章文献综述 三七叶甙为从五加科人参属植物三七的茎叶提取的总皂甙，经化学成分分析 证明其单体均是以原人参二醇为甙元的系列皂甙”1 。现代药理研究表明三七叶甙 具有明显的镇静、镇痛、消炎等作用，且毒n 用d , t 2 j 。随着现代色谱技术的发 展，对三七叶甙单体的提取、分离和鉴定的研究取得了较大进展，从而为开发新 药所需的药理研究和临床应用奠定了基础。 1 1 三七叶甙的研究进展 1 1 1 三七叶甙单体的组成 三七叶甙的单体主要为极性较大的人参皂甙( g i n s e n o s i d e ) r b 3 、r e 、r b l ，七 叶胆甙( g y p e n o s i d e ) i x 及= 七皂甙( n o t o g i n s e n s i d e ) f a 、f c 、f e ，均为2 0 ( s ) 一原人 参二酵达吗烷型皂甙，其中以人参皂甙r b 3 含量最高，各皂甙组成如表1 1 。 皂甙的基本结构如下图所示： i t l 0 图1 1 皂甙的基本结构 f i g u r ei - 1t h eb a s i cs t r u c t u r eo f g i n s e n o s i d e s 第一章文献综述 袁1 - 1 三七叶甙单体州 t a b l el - lt h es a p o n i n si np a n a xn o t o g i n s e n gl e a v e s 1 1 2 三七叶甙的药理研究 1 对神经系统的作用 三七叶甙对神经细胞损伤具有明显的保护作用，此外还具有镇静、镇痛， 促智和保护脊椎神经细胞的作用，八十年代开发的新药“七叶神安片”的原 料就是i 七茎叶总皂甙，l 艋床用于神经衰弱、偏头痛、失眠等症的治疗。研 究发现三七叶甙的作用部位可能在神经中枢”1 。一般认为，其对中枢有抑制 作用，表现为镇静、安定和催眠作用。 。 2 对心血管系统的作用 文献提示三七叶甙及其单体皂甙具有保护心脏的作用”。研究发现三 七叶甙能抑制大鼠离体左心房异丙肾上腺素诱发的心率加快，对去甲肾上腺 素( n k ) 诱发的张力增加具有钙拮抗作用。其单体皂甙r b 、r b 。抑制正常心 肌细胞动作电位及自发性搏动，具钙通道阻滞作用。1 。效力为r b 。 r b 。同 时三七叶甙可明显降低大鼠急性心肌梗死后在灌注心律失常的发生率，并对 几种实验性心律失常模型有明显的对抗作用”3 。 几种实验性心律失常模型有明显的对抗作用”1 ”1 。 第一章文献综述 3 对免疫系统的作用 对巴豆油致小鼠耳炎症的实验：注射剂量为7 5 m g k g 的三七叶甙，炎症 抑制率为4 7 6 。注射剂量1 5 0 m g k g 三七叶甙，炎症抑制率为6 9 8 1 。对 二甲苯致炎实验：注射剂量为7 5 m g k g 三七叶甙，炎症抑制率为4 9 1 ，而 剂量1 5 0 m g k g 炎症抑制率为6 4 2 “。对大鼠蛋清性大鼠足跖肿胀和角叉菜 胶足肿胀有明显的抑制作用“，以上研究表明三七叶甙具有直接的抗炎作 用。 4 抗衰老、抗氧化的作用 三七叶甙能显著延长果蝇的平均寿命、半数死亡时间及雄果蝇的最高寿 命，也可抑制小鼠体内组织过氧化脂质( l p o ) 含量和提高小鼠血、脑细胞 超氧化物岐化酶( s o d ) 的活性。其延寿、抗衰老的机制可能通过直接减少 自由基形成，抑制体内脂质过氧化及激活s o d 活性，从而加速自由基清除， 降低自由基对机体结构与功能的损害有关。 5 毒性研究 近年来对三七叶甙的急性“、亚急性毒性“”实验结果说明三七叶甙毒性极低 并且安全范围较大。 1 1 3 三七叶甙单体的提取分离方法 制各三七叶甙单体通常先从人参属植物三七的茎叶原料制各三七叶总皂甙： 然后将三七叶总皂甙分离制备出三七叶甙单体。 1 三七叶总皂甙的提取分离方法n 6 l 常用的三七叶总皂甙的分离提取方法可大致分为五种；冷渍法、有机溶剂萃 取法、酸水解法、大孔吸附树脂法、超声波提取法。其中，冷渍法为药典方法， 但较为费时。超声提取法省时省力，适用于工厂生产检验。大孔吸附树脂法提取 三七叶总皂甙的提取率在9 8 以上，且用该法能除去糖类等水溶性杂质及大部分 脂溶性杂质，降低了提取物的吸潮性，色泽好，同时纯度高，质量稳定。 因此综合考虑溶剂用量、乙醇浓度、加热时间对三七叶总皂甙的影响，现行 三七口 总皂甙的提取分离工艺为：提取溶剂用量为药材重量的1 3 倍，乙醇浓度 第一章文献综述 为3 0 ，提取温度为7 0 c ，加热时间为4 0 分钟。用乙醇加热回流提取，再用正 丁醇萃取或大孔吸附树腊纯化等，同法提取2 次，平行操作3 份，三七叶总皂甙 的平均提取率为9 4 9 2 。本法具有耗醇量少、提取率高、生产成本低的优点， 更适合工业生产。 2 三七叶甙单体的提取分离方法 切 ( 1 ) 硅胶柱层析 硅胶柱层析是最常用的皂甙单体分离方法。常采用的溶剂为不同比例的氯 仿一甲醇一水，水饱和乙酸乙酯与不同比例的甲醇混合物，以及正丁醇一乙酸乙脂一 水，氯仿一甲醇一乙酸乙脂一水，氯仿一甲醇等不同比例的混合溶剂，经过反复层析 可获得皂甙单体。 硅胶柱层析常用的还有低压柱层析，即用薄层层析展开的吸附剂和展开剂， 在装紧的柱子上，l s k g c m 2 的压力下进行柱层析，以分离皂甙单体纯品，如三 七皂甙b 1 ，b 2 ，b 3 的分离“。低压柱层析法优点是省时间及溶剂，每操作1 次， 约3 6 小时，分离效果也优于一般硅胶柱层析。 硅胶柱层析还有干柱层析“”，即用薄层层析条件，在装紧干柱上以展开剂展 开，溶剂展开完全后，按一定长度分段切割，各切割部分以乙醇洗脱后浓缩，再 以薄层层析检查其纯度或色点。 ( 2 ) 离心薄层层析法 利用离心薄层层析仪分离纯化皂甙单体，其分离周期短，效果好，还节省溶 剂和吸附剂，对需求小量纯品皂甙是有效的分离纯化手段。张新郁应用北京青 云仪器厂出品的l b c 一1 型离心薄层层析仪分离纯化三七总皂甙中的人参皂甙r g 。、 r b ，及r e 。文献中精制三七果梗中的三七皂甙f e ，也是使用薄层离心层析仪进行 离心薄层层析。 ( 3 ) 反相柱层析 在硅胶载体上涂敷非极性固定相，十八烷基硅烷键台硅胶( o d s ) ，常用有 l o l o rr p 一8 ，r p 一1 8 反相层析，以梯度甲醇洗脱，极性大的成分先出柱，一般用 于硅胶不易分离的极性皂甙，如三七叶中绞股蓝i x 部分的精制，人参皂甙r c 的 分离精制。熟三七皂甙的成分分离中”“，柱层析用硅胶，以氯仿一甲醇一水( 5 0 ： 1 0 ：l 2 0 ：1 0 ：1 ) 系统梯度洗脱，有的部分以m c ig e l ，c h p - 2 0 作填料，进行 第一章文献综述 反相柱层析，6 5 8 5 甲醇洗脱，分得人参皂甙r g 。r g 。，r e ，r d 和三七皂甙 r ，如及r 。的单体皂甙。 ( 4 ) 高效液相色谱法( h p l c ) 此方法需要高效液相色谱仪，适用于定量分析及分离一般方法难以分离的皂 甙，其中也有反相的h p l c 。如三七根中的三七皂甙r 及人参皂甙r e 混合物的分 离。“。该混合物通过t o y as o d ah i c8 0 2u r 液相色谱仪，t s k g e l s - 4 1 0 柱( 7 5 m m x3 0 c m ) ，流动相为甲醇一水( 5 5 ：4 5 ) ；流速，2 0 m l m i n ，折光仪检测，上样量 为i m l ( 2 0 m g m 1 ) 。可分离出人参皂甙r e 和三七皂甙r i 。 ( 5 ) 乙酰化衍生物分离法 用于一般方法难于分离的皂甙，如三七果梗中的人参皂甙r b l 及人参皂甙 r b 3 的分离，混合皂甙以醋酐、毗啶进行乙酰化，所得乙酰化衍生物通过硅胶柱 分离，以石油醚- 丙酮( 6 5 ：3 5 ) 冲洗，分离的人参皂甙r b l 乙酰化衍生物及人参皂 甙r b 3 的乙酰化衍生物以三乙胺进行脱乙酰基，产物再通过硅胶柱层离，以氯仿 - 甲醇水( 6 5 ：3 5 ：l o ) 冲洗，可得人参皂甙r b l 及r b 3 的纯品。 ( 6 ) 薄层层析： 用于鉴别皂甙及其纯度，常用硅胶一g 板，以蒸馏水调和铺板，或用硅胶一c m c n a 板，以硅胶和0 5 1 的羧甲基纤维钠调和铺板，羧甲基纤维素钠溶液吸取上 层透明澄清供用。用于分组皂甙分离的展开剂为c h c l 3 m e o h h 2 0 ( 6 0 ：4 2 ：1 ) 均 相。 反相薄层层析：用高效薄层层析板- r p 一8 f 2 5 4 和r p 1 8 f 2 5 4 ( m e r c k 公司) ，展 开剂为6 0 8 0 的甲醇等。薄层板上极性大的皂甙r f 值大，而极性小的皂甙r f 值小。 显色剂：常用1 0 硫酸乙醇液或饱和硫酸氢铵乙醇溶液，1 0 5 * c 力n 热1 0 分钟 或1 1 5 1 2 0 加热5 7 分钟，呈红紫色点。但在紫外光灯3 6 5 n m 下观察，原人 参二醇皂甙呈亮紫色，原人参三醇皂甙呈橙色”。 ( 7 ) 分离流程实例：三七茎叶中皂甙单体的制各“1 利用上述这些分离方法相结合，可以使三七单体皂甙分离，现用流程图具体 说明如下：粗皂甙加入其2 0 4 0 倍含5 h 。s o 。的5 0 7 , 醇一水溶液，水浴上回流6 小时以上为宜( 即检查总皂甙水解完为止) ，减压回收乙醇，水液以氯仿萃取皂 第一章文献综述 甙单体，氯仿溶液水洗至中性，加无水硫酸钠脱水，回收氯仿，所得粗皂甙上硅 胶柱，以石油醚一丙酮( 9 5 ：5 1 ：1 ) 梯度洗脱，得各种皂甙单体，在乙醇，甲 醇，丙酮或乙酸乙脂中重结晶。 f - - c 瑚c i , s - 自0 噍 l b o o i - 埯0e 4 盘- 3 ：4 ) 一- - - - - e - 牲- f e 广麟眺。二l_c翟ilc-m。,or搿一 k o 一警黼撞一鳝t o r 一口忙b l 一螂t 吐c 一 一雀辞鬣暑麓8 黾氍 l - e a c - ，肚盘：4 ：1 ) i 竹x 铆 帆 l 翟c t i , c 等妒眦唧一譬髅。 毛慧析i 干c 。拄；l 层i - 忻。e 。0 艋1 b - 牲i 晨( 6 , 掂5 , i ( 。o x - i t , o。，0 ，一琶群；：紫挂一盎篓，甙七牡j 壹忻i 3 乳1 )层忻7 帽警群 一功3 茎c 胁l h i - 一- v 口a o h 1 粗o 案嚣器l _ 一量髓啸一譬燃一墨毳蒜曼黼5 ，一答瓣邺一奈絮 卜低压- ，t t 0 雠1 c - 帅 k o ( 4 喇：15 ) - 船辫拯。一群臻蟹垃一辫 l 低c l o 压t 拄* - 磊l t k * c 睡 - 掩。一曩相低压挂屡饼f 辎甲醉一! 七毫呔一f 图1 - 2 三七茎叶中皂甙单体的制备流程图 f i g u r e1 - 2 t h e p r e p a r a t i o n f l o wc h a r to fs a p o n i n s i np a n a xn o t o g i n s e n g e a v e s 1 1 4 三七叶甙的分析方法 1 三七叶甙的总含量测定。4 三七皂甙总含量般用分光光度法测定。样品以冰乙酸( 含5 香荚兰醛) 和高氯酸的混合液在7 0 c 热水浴中显色( 蓝紫色) ，再加入冰乙酸定容至适量 体积，于5 6 0 n m 波长测定吸收度，依标准曲线计算含量。 由于显色的作用部位是甙元的脂环结构，凡是具有三萜结构的化合物， 如三七皂甙元等，均能显色，测定的专属性不强，测定结果要在检识合格的 第一章文献综述 基础上分析，才有质量判定的意义。例如，一批产品在提取时控制不好，部 分水解生成一些甙元，含量测定时却因为甙元的分子量相对较小，测定结果 往往很高，甚至超出1 0 0 。 2 三七叶甙单体的含量测定 对同系列类似化合物组成的混合物，个别组分的含量测定，必须选择有专属 性的方法，先进行分离，然后结合不同的方法进行含量测定。常用的三七叶甙单 体的测定方法如下： ( 1 ) 薄层层析法( t l c 法) 用正相或者反相t l c ，不同的吸附剂( 如硅胶g ，h 或8 f 2 5 4 ，r p 一8 f 2 5 4 ) ， 不同的展开剂和不同的显色剂( 如1 0 硫酸水溶液) ，可基本上分开三七的主要 单体皂甙。李吉来“”等将三七粗皂甙甲醇提取液经硅胶薄层层析( 展开剂：氯仿 一甲醇一水= 7 0 ：5 5 ：1 0 ) ，将总皂甙与杂质分开，所的总皂甙以香草醛一高氯酸为 显色剂进行比色测定。此方法测定结果虽然较为准确，但步骤较繁琐且层析易受 湿度影响。经薄层层析后测定三七单体皂甙的方法有以下几种：( 1 ) 目测法，在 薄层上观察斑点大小比较各皂甙的相对含量的方法称为目测法，其相对量用“+ ” 号多少来表示，由于影响斑点大小的因素很多，这种方法只能用来粗略的估计各 个皂甙的含量，误差很大：( 2 ) 光密度计扫描法：将三七粗皂甙样品点于硅胶薄 层板上，以1 ，2 一二氯乙烷一正丁醇一甲醇一水( 3 0 ：4 0 ：1 5 ：2 5 ) 下层为展开剂， 显色后，用光密度计进行扫描可计算出各三七皂甙含量。用此法测定了市售三七 各种规格和冠心宁浸膏中4 种主要单体皂甙( c 1 ，d 1 ，1 3 2 和e 1 ) 的含量。 ( 2 ) 液滴逆流层析法( d c c c 法) 1 9 7 7 年o t s u k a 等采用d c c c 法分离人参及其亲缘植物中单体皂甙结合比色 法测定含量。初步测定了三七中人参皂甙r b 。r e ，r d 和r g ，的含量。此法可用 于皂甙半微量制备与定量分析，优点是可避免皂甙易起泡的麻烦，但费时、程序 较繁，不适用于微量测定与常量分析。 ( 3 ) 高效液相色谱法( h p l c 法) 瞄1 高效液相色谱用于三七皂甙的分析测定，方法精确、灵敏，回收率高，结果 准确、可靠，重现性好，分析时间短，是目前优先发展的方法，也是三七皂甙的 现行法定标淮所规定的方法。高效液相色谱测定三七皂甙，常用固定相是各种键 第一章文献综述 合硅胶( r p 一1 8 、o d s 、氨基键合柱、腈基键合柱等) ，流动相可用水一甲醇、水一 乙腈等，也可在流动相中加入适量的磷酸。 与h p l c 联用的通用型检测器有示差检测器( r i ) 、质谱( m s ) 和蒸发光散射检 测器( e l s d ) 。前两者应用于人参及制剂中皂甙分析较多，少见于三七分析。r i 灵敏度低，基线受温度影响大，并与梯度洗脱不相容；m s 灵敏度高，且能提供 分子量、糖苷配基等信息，这在药物代谢及药代动力学研究中有独持的优势，但 设备昂贵，运行成本高复杂，相比之下，作为常规质控手段，e l s d 则以其高效、 方便、可靠的特点，在三七皂甙分析中更有发展前景。目前，已有人用h p l c e l s d 法对多种中草药中皂甙成分进行分离分析，并取得了很好的效果，进一步推动了 高效液相色谱在皂甙分析中的应用。 ( 4 ) 超临界色谱法 超临界色谱可用于皂甙元的测定，采用s b c y a n o p r o p y l - 5 0 石英毛细管柱， 柱温9 0 。0 ，f i d 检测器，流动相为c 0 2 ，分流进样，起始压力为1 0 0 m p a ，程序 升压1 0 1 m p a m i n ，至3 5 5m p a ，以胆固醇为内标物，对三七及云南白药中的人 参二醉和人参三醇进行含量测定，s f c f i d 法具有很高的灵敏度，人参二醇检测 限为3 9 7 1 0 1 2 9 ，人参三醇为4 1 7 1 0 。1 2g 。 1 2 制备型高效液相色谱理论雎町 最初液相色谱是作为一种制备工具而出现的。因无在线检测工具，样品 的分析只能在分离制备以后进行。这样，为了得到混合物样品组成的信息必 须首先对其进行分离制备。2 0 世纪6 0 年代以后，随着色谱技术的飞速发展， 尤其是检测设备的发展，人们可以在对样品进行色谱分离的同时联机检测， 直接得到样品组成的信息，分析色谱走上了历史的前台，并成为色谱技术发 展的主流，而制备色谱技木发展逐渐受到了忽视“。近年来，由于生物技术 和医药工业的发展，传统的分离手段己经不能满足对大量样品高纯度分离的 要求，使得人们开始重新考虑发展液相制各色谱，同时也开始了对液相制各 色谱的深入研究，以期不断解诀实际应用中出现的问题。 第一章文献综述 1 2 1 制备色谱分离过程原理。” 色谱柱内填充吸附剂，在填充状况良好的情况下，当含有溶质的流动 相流过此床层并和固定相接触时，相互作用。在一定时间内溶质在两相内达 到动态平衡，对于液固色谱，溶质在两相间的分配取决于吸附等温方程的吸 附平衡常数。此平衡常数表征溶质在一定的温度和浓度下，与固定相( 以及 流动相) 的亲和力大小，反映各组分在固定相中的保留能力。流动相在床层 内不断流动，溶质组分在床层固定相内不断地达到平衡，这种动态的平衡过 程，使色谱峰( 或流出曲线) 不断地移动。移动速度除需考虑流动相的流速 外，相平衡常数( 表征亲和力的大小的常数) 是决定性的因素，可以说溶质 组分在床层内滞留时间的长短与亲和力有关，亲和力小的组分，保留时间短； 亲和力大的组分保留时间长，从而使亲和力不同的溶质组分得到分离。分析 型色谱由于进样浓度低，处于吸附等温线的线性区域，得到的色谱峰是对称 的高斯曲线。制备色谱往往进样浓度高。组分浓度落在吸附等温线的非线性 范围内，平衡常数随流动相中溶质浓度的改变而改变，使所得的色谱峰不对 称，甚至导致峰形重叠。 制备液相色谱与分忻液相色谱相比，最突出的特点是进样量很大。进样 量的变化会对色谱分离参数如分离度，容量因子k ( 定义为溶质在固定相和 流动相中的分配量之比) ，保留值和理论塔板当量高度h e t p 等产生较大的 影响”“。 每一种色谱柱的固定相都有一定的样品线性容量。线性容量是指在线性 等温线的范围内，单位重量的固定相上能够负载样品的量“1 。s n y d e r 提出， 吸附剂的线性容量用o 。表示。o 。定义为样品的容量因子k 下降1 0 ( 相 对于小进样量下测定的一定k ) 或理论塔板当量高度增加两倍以上时的样品 量。在线性容量的范围内，谱带的高度随进样量的增大而增加，而k 、保留 值和分离度都保持不变。当样品超过线性容量范围时，随着进样量的增加， 容量因子下降，理论塔板当量高度增大，此时样品量与柱效之间已失去线性 关系，当样品量大于线性时被定义为样品过载( o v e r l o a d ) ”。 第一章文献综述 制备色谱要在保证产品纯度和回收率的前提下，尽量提高色谱柱的原料 处理量和产品的产率。工业上还要考虑溶剂回收的能耗和设备操作费。“。为 了达到在定的分离条件下，加大色谱柱处理量的要求，可以在每单位时间 内增加原料容积进料量或者提高原料中组分的浓度值，使色谱柱在超载下操 作( 超载是指对分析色谱柱的工作条件而言) 。同时适当地分割部分馏分， 用循环进料的方法，提高产品的产量。除了上述几个因素，还要注意色谱出 峰要快，使色谱柱的操作周期缩短，得以提高生产能力。 色谱分离效能指标常用分离度r 。表示，定义为；r 。= 2 ( v 。一v 。) ( 乳+ w ，) 式中v n 。和v t 为相邻两个组分的保留体积，w 2 和w 。为两相邻组分色谱峰的峰 宽。当风1 5 时两个组分可以完全分开，凡1 0 时两个组分可以分离。制 备液相色谱分离的目的是要得到大量的单一纯品，分离过程是在样品过载下 进行，s n y d e r ”用r s 值表示这种过载，样品过载的r s 值将低于1 2 5 。但在 实践中，为了提高设备的生产能力，r s 都大大低于这个数值。r s 值至少应 该取多少，应综合考虑产品纯度的要求和生产能力等各方面的因素，并不是 r s 值越大越好。 分离度的大小是由热力学平衡和动力学因素两种效应决定的。影响分离 度的主要因素是容量因子k 、分离因子a 和色谱柱的理论塔板数n 。其中k 和n 反映了溶质的保留性质和色谱峰的相对位置，其取决于溶质、流动相、 固定相的性质以及温度等条件。但是仅从热力学平衡来考虑色谱分离是不充 分的。即使在热力学认为可行的色谱分离，由于色谱峰在通过柱子时的扩展， 溶质有可能分不开。谱峰扩展反映了色谱柱中的动力学因素，导致分离度下 降。理论塔板数n 控制了色谱峰的扩展程度，主要是由色谱柱本身的特性和 色谱操作条件诀定的”。 色谱分离理论指出，评价色谱分离有三个主要的指标：分离度，分离速 度和分离样品量，这三者相互关联和制约。对于一个特定的色谱分离系统改 善任何一项指标都必须依靠牺牲另两项指标来实现，或者任何两顶指标也可 以靠牺牲其余一顶而得到改善。对于分析液相色谱，其目的是对样品中的各 组分作出定性和定量的分析，分离度和分离速度是其主要要求，应尽量降低 第一章文献综述 样品量。而制备色谱的目的在于大量分离以取得一定回收率和一定纯度的单 一产品，不得不损失分离度和分离速度。 判断制备型色谱使用结果的三个重要参数是：产品的纯度、产量和生产 效率。三个参数相对独立，很难同时使用三个参数来优化制备色谱”。 1 2 2 反相高效液相色谱 固定相的类型，决定了色谱分离的机理，我们可以按分离机理将色谱分 为正相、反相、凝胶、离子交换、疏水相互作用及亲和色谱等不同的种类。 1 反相高效液相色谱的含义 反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料做固定相，以可以和水混溶的 有机溶剂作流动相的液相色谱，是应用最广的液相色谱方法。 2 反相高效液相色谱的分离机理“” 一般认为有以下几种作用： ( 1 ) 溶质在填料表面的烃类和流动相之间进行分配： ( 2 ) 溶质在吸附于填料表面烃类上的“改性固定相”和流动相之间进行分配， 这一过程在添加了有机改性剂的情况下发生； ( 3 ) 溶质在吸附于填料表面烃类分子上，类似于吸附色谱。 3 反相高效液相色谱的色谱柱 色谱柱一直是液相色谱主要研究和发展的重要内容。 ( 1 ) 以硅胶为基质的反相高效液相色谱柱：常见的是用常规硅胶键合c 1 8 c 8 等填料； ( 2 ) 以其他氧化物为基质的反相高效液相色谱柱； ( 3 ) 以聚合物为基质的反相高效液相色谱柱。 4 反相高效液相色谱的流动相 第一章文献综述 极性溶剂或他们的混合物用作反相高效液相色谱的流动相，例如水、甲 醇和乙腈。为了提高检测的灵敏度，要求溶剂达到光谱纯。 5 反相高效液相色谱的应用 反相高效液相色谱是h p l c 中应用最为普遍的一种模式，从一般小分子 有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量不大的蛋白质( 5 0 k d ) 的分析与分离均可应用。 1 2 3 正相高效液相色谱 1 正相高效液相色谱的概念 所谓正相高效液相色谱是指以亲水性的填料做固定相( 如在硅胶上键和 羟基、氨基或氰基的极性固定相) ，以疏水性溶剂或混合物作流动相( 如己 烷) 的液相色谱。 2 键合固定相 键合固定相多半是在硅胶表面上通过化学反应以化学键结合的各种分 子，形成像刷子一样的分子层。由于在硅胶表面原子之间结合方式的不同， 键合固定相有四类： ( 1 ) 形成硅一氧一碳键的固定相： ( 2 ) 形成硅一氮一碳键的固定相； ( 3 ) 形成硅一氧一硅一碳键的固定相； ( 4 ) 形成硅一碳键的固定相。 3 正相高效液相色谱的流动相 正相高效液相色谱的固定相是具有一定极性的填料，其流动相是不同极性 的混合溶剂，常以已烷或环己烷为基础溶剂，为了洗脱极性较强的溶质，往 基础溶剂中加入极性溶剂，如二氯甲烷、短链醇、四氢呋喃等。 4 正相高效液相色谱的分离机理和应用 第一章文献综述 一般来说正相高效液相色谱的分离是决定于溶质和固定相及流动相之 间的分子作用力，其中氢键力和静电力起着重要的作用。例如溶质是极性分 子它和固定相( 比如是带羟基的基团键合到硅胶上) 有很强的作用力，于是 保留时间就很长，要把它洗脱出来就要用极性较强的流动相。 正相高效液相色谱主要应用于分离甾醇类、类脂化合物、磷脂类化合物、 脂肪酸以及其他有机物。 1 2 4 制备型高效液相色谱在皂甙分离中的应用” 从天然产物中寻找生物活性成分和先导物以研究创制新药，是世界各国 新药研究公认的有效途径之一，己取得许多重要成果。仅从不完整的资料统 计，在美国出售的药品中，有近l 4 的药品至少含有一种来自植物的活性 成分。在1 9 8 4 1 9 9 5 年间，世界各国来源于天然产物( 主要是植物) 的抗癌药 和抗炎免疫药占6 0 以上“，可见天然产物化学研究对新药的研究与开发的 重要意义。 高压液相色谱与其它液相色谱相比，其最大的优点是分离效率高，可达 2 万理论塔板数。高效液相色谱不象气相色谱那样受样品的沸点、挥发度和 热不稳定性的限制，故特别适合于那些沸点高、极性大、热稳定性差的化合 物“，因此，对于天然药物的分离纯化具有重要作用。近十年来，随着色谱 填料技术的进展，以及对填充技术、设备上的重大改进，制备液相色谱( p l c ， p r e p a r a t i v e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) 也得到了迅速发展。制备型高效液相色谱在 天然产物的分离上应用十分广泛“。 将制备型高效液相色谱应用于三七皂甙的分离提取，具有产品纯度高、 操作简便和分离快速等优点，是制备单体皂甙的必要手段。 下表归纳了最近有关高压液相色谱分离的报道，在这些报道中，高压液 相色谱仪一般是作为最后的纯化手段 第一章文献综述 表1 2 用h p l c 对皂甙进行的制备型分离“3 1 t a b l e1 2a p p l i c a t i o no fh p l ci ng i n s e n o s i d e ss e p a r a t i o n 1 3 中药化学成份指纹图谱 1 3 1 中药化学成份指纹图谱的概念叫 中药化学成份指纹图谱是指采用光谱、色谱和其他分析方法所建立的体现 中药所含化学成份特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光语( i r ) 。色谱最常用 的是薄层色谱( r l c ) 、气相色谱( g c ) 、高效液相色语( h p l c ) 和毛细管电泳( c e ) 。 其他方法包括波谱 质谱( m s ) 和核磁共振谱( n m r ) 】和联用技术4 6 4 7 4 8 】。 1 3 2 构建中药化学成份指纹图谱的主要技术手段呻5 岫 中药化学指纹图谱的技术手段首推色谱方法和联用技术。t l c 法简便易行， 但提供信息量有限，很难反映几十种、上百种化学成分组成的复杂体系。g c 适 用于挥发性化学成分。h p l c 适用于非挥发性成分，中药中大部分化学成分均可 用h p l c 法得出良好的指纹图谱。c e 适用于大部分化学成分，特别是生物大分 子一肽和蛋白的分离，但其重现性有待提高。联用技术是最有效的建立指纹图谱 的方法，如g c m s ，h p l c m s ，h p l c m s m s 等可提供大量各种信息， 符合解决中药复杂体系的要求，但仪器价格昂贵，不易推广使用。总之，目前使 用最多的中药化学指纹图谱是用h p l c 方法。 第一章文献综述 1 高效液相色谱指纹图谱( h p l cf i n g e r p r i n ts p e c t r u m ) 高效液相色谱( h p l c ) 具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、选择性高 的特点。与薄层色谱相比，它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重 现性好，其分离、鉴别能力远远高于薄层色谱。在中药指纹图谱中首推高效液相 色谱指纹图谱。2 0 0 0 年国家药品监督管理局制定的中药注射剂指纹图谱研究 的技术要求( 暂行) 5 1 1 对已批准的中药注射剂和申报的新中药注射剂的药材和制 荆大都采用高效液相色谱指纹图谱。 粟晓黎等【5 2 l 运用h p l c 指纹图语法对中药鬼臼的毒性成分进行分析，指出 利用鬼臼的h p l c 指纹图谱可以鉴别鬼臼( 桃儿七) ，龙胆、威灵仙。高增平等【5 3 1 以人参皂芬r 幽为对照，建立了三七药材的h p l c 的指纹图谱。翟为民等1 5 4 l 建立 了人参、西洋参及三七的h p l c 指纹图谱用以鉴别区分三者。邹忠梅等 5 5 】用h p l c d a d 法，梯度洗脱，测定了1 0 批芍药总苷，结果表明，芍药总甙的指纹图谱 特征性及专属性强，结合含量测定可用于全面控制芍药总苷的质量。a r e i a s 等【5 6 】 采用r p - h p l c 对胡椒薄荷叶不同有机溶剂提取液进行了分析，鉴定了1 0 种酚性 化合物，对1 4 个样本分析对比发现其酚性成分具有相似的图谱模式，由此可建 立胡椒薄荷酚性成分的指纹图谱。 2 质谱指纹图谱( m sf i n g e r p r i e n ts p e c t r u m ) 例 将中药提取物置于质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取物中化学成分的 e 1 m s 图。不同中药提取物所含成分不同，所得质谱图显示的分子离予峰及进一 步的裂解碎片峰亦不一致，可用于鉴别。m s 法灵敏度及准确度高，指纹特征性 强，常与h p l c 、g c 联用。袁湘林等饽鄙利用一种新的质谱分析技术一基体辅助 激光解吸电离飞行时间质谱对黄蓖及其伪品进行研究，通过多个样本的 m a l d i t o f m s 分析可确定黄蓖药材的特征峰，从而对真伪黄蓖进行鉴别。 3 多维多息特征谱 所谓多维是指采用多种分析仪器联用的模式，所谓多息是指中药的特征谱应 包括化学和药效两方面的信息。单一的分析方法难以反映中药的复杂性，近年来 采用多种现代分析仪器联用方式得到的多维多息特征谱的应用在增加。例如： h p l c m s 、h p l c m s m s ，h p l c n m r 等联用技术为中药指纹图谱的研 究应用提供大量的信息。目前最常用的是高效液相色谱( 或毛细管电泳) 二极管 阵列检测器质谱质谱联用方式( h p l c 或c e d a d m s m s ) 得到的指纹 图谱。 第一章文献综述 ( 1 ) 液相色谱一质谱联用技术” 液相色谱一质谱联用( l c m s ) 技术是以质谱为检测手段的色谱技术，它 既有液相色谱的高分离能力，又有质谱的高灵敏度，高选择性。 液相色谱一质谱联用仪主要由液相色谱系统，连接接口，质量分析器和 数据处理系统组成。使用液相色谱一质谱联用仪分析样品的基本过程是：样 品通过液相色谱系统进样后，经过色谱柱进行分离，然后进入连接接口，在 这里样品由液相中离子或分子转变为气相中的离子，其后离子被聚集于质量 分析器中，根据质荷比分离，最后离子被转变为电信号，由电子倍增器检测， 电子倍增器的信号被放大并传至数据处理系统加以处理和显示“”。 液相色谱一质谱联用仪对流动相的要求有别于普通液相色谱。一般认 为，低浓度的电解质和高比例有机相容易获得较好的离子化效率。但是，在 有些物质特别是极性化合物的测定中，色谱分离所用的流动相可能不适用于 e s i 检测。因为接口中高速喷射的液流会产生制冷效应，使液流中的不挥发 组份极易遇冷析出，形成堵塞，影响分析的稳定性和仪器的使用寿命。同时 l c m s 接口多禁止在流动相中加入不挥发组分如磷酸盐缓冲液、离子对试剂 等。 ( 2 ) 质谱质谱联用的基本原理： 选择一定量的离子通过一级质谱( m s l ) ， 使其进入碰撞室，与室内充 有的碰撞的气体( 常用的气体为h e 、a r 、x e 和c h 4 等) 进行碰撞诱导裂解( c i d ) 发生离子一分子碰撞反应，产生子离子，再经过第二级质谱( m s 2 ) 进行分析。 m s m s 仪主要有3 种数据采集方式：a 子离子扫描，选择一定的母离子 经c i d 活化，m s 2 记录产生的子离子。该方式特别适用于软离子( 如e s i 、 c i 、f d 、f a b ) 得到的分子离子进一步裂解以获得分子的结构信息。b 母离 子扫描，选择m s 2 中的某一离子， 测定m s l 中的所有母离子。该方式能帮 助追溯碎片离子的来源，能对产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速 筛选。c 中性丢失扫描，m s l 和m s 2 同时扫描，但m s 2 与m s l 始终保持质量 差，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通