（工程热物理专业论文）细胞内水渗透与非平衡相变的研究.pdf

中国科学技术大学博士学位论支( 2 0 0 4 ) 赵剐 摘要 细胞低温保存是组织、器官等生物材料低温保存的基础，对于低温保存过 程中细胞损伤机理的研究是组织、器官等低温损伤机理研究的基础。细胞损伤 机理的“两因素假说”指出，细胞悬浮液低温冷冻过程中，细胞可能遭受两种 损伤，一是“溶液损伤”，一是“胞内冰损伤”。“溶液损伤”指细胞在冷冻 过程中，胞外冰产生后细胞膜内外溶液的渗透压差别导致细胞体积收缩，进而 对细胞造成的损伤：“胞内冰损伤”指的是进一步冷冻过程中细胞内冰晶的产 生与生长对细胞带来损伤。此外，细胞悬浮液冷冻前添加低温保护剂，复温后 去除低温保护剂过程也可能对细胞带来严重的渗透性损伤。 本文首先使用美国贝克曼一库而特公司的最新型颗粒粒度及计数分析仪对 细胞的平衡渗透性进行了详细的研究，确定了细胞外溶液的渗透压变化对细胞 体积的影响，定量确定了细胞内束缚水，研究了其存在形式，指出细胞内束缚 水以结合水和自由水两种状态存在，进一步使用pm a z u r 方程研究了考虑束缚 水与否对于冷冻过程中细胞体积响应的理论预测结果的影响。此外，本文还提 出了一种新的间接测量细胞在慢速冷冻过程中体积变化的方法。 使用k k 方程详细研究了细胞膜的各种渗透性参数大小，细胞个体差异等 因素对于添加和去除低温保护剂过程中细胞体积响应、细胞内组分浓度等产生 的影响。研究了分布添加分步去除低温保护剂对细胞体积响应和细胞内组分变 化的影响，指出了分步法添d n 去除低温保护剂的有效性。提出了平衡时间对于 分步法结果的影响，并由此定义了最佳平衡时间。 将细胞内冰晶的体积项引入pm a z u r 方程，修正了该方程不能正确描述胞 内冰产生与生长过程中透过细胞膜的水的输运这一不足之处。通过耦合修正后 的pm a z u r 方程与k a r l s s o n 模型中的冰晶成核、扩散控制的晶体生长理论，建 立了一个新的扩散控制的胞内冰成核与生长的模型。该模型可以预测细胞内最 终冰晶体积份额与大小分布，克服了原k a r l s s o n 模型对与较低低温保护剂浓度 下冰晶体积预测不合理这一缺陷，完善了胞内冰成核与生长的模型。给出了应 用该模型预测细胞内玻璃化的方法。此外，本文还提出了n a c l 平均水合水分子 数的概念，指出这一参数为一状态函数；同时指出了研究该参数与细胞内组 分、温度的关系对于胞内冰成核与生长模型的重要意义。提出了理论上的局部 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 玻璃化现象，并使用相图对其进行了存在性论证；使用胞内冰成核与生长模型 研究了局部玻璃化的出现对于最终细胞内冰晶体积份额的影响，指出实验确定 局部玻璃化现象的重要意义。 关键词：渗透性；束缚水；胞内冰；均相成核：玻璃化：冰晶生长 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 a b s t r a c t c e l lc r y o p r e s e r v a t i o ni st h ef o u n d a t i o no ft i s s u ea n d o r g a nc r y o p r e s e r v a t i o n ，a n d s t u d yo nc r y o i n j u r yo fc e l li st h eg r o u n d w o r ko fs t u d yo nc r y o i n j u r yo ft i s s u ea n d o r g a n m a z u r st w o - f a c t o rh y p o t h e s i sp o i n t so u tt h a t ，i ) a ts l o wc o o l i n gr a t e s ，f r e e z i n g i n j u r yo c c u r sd u et oh i g hs o l u t ec o n c e n t r a t i o ne f f e c t sc a u s e db yc e l l u l a rd e h y d r a t i o n a n d d e c r e a s i n gu n f r o z e nf r a c t i o no f t h ee x t r a c e l l u l a rs p a c ea n di i ) a th i g hc o o l i n gr a t e s f r e e z i n gi n j u r yo c c u r sd u et oi i f ( i n t r a c e l l u l a ri c ef o r m a t i o n ) a n da d d i t i o n r e m o v a l o f c r y o p r o t e c t i v ea g e n t sb e f o r ef r e e z i n g a f t e rr e w a r m i n gm a y a l s op u tc e l li n t os e v e r e o s m o t i ci n j u r y an e w t y p ee l e c t r o n i cp a r t i c l ec o u n t e r ( m u l t i s i z e r r mi i i ) w a su s e dt os t u d yt h e e q u i l i b r i u mp e r m e a b i l i t yo fh u m a nr b c ，t h a ti st h ev o l u m ec h a n g ec a u s e db yt h e v a r i e t yo f e x t r a c e l l u l a ro s m o l a l i t y t h et r a p p e dw a t e ro fh u m a nr b cw a sd e t e r m i n e d ， a n di t ss t a t ew a ss t u d i e di nd e t a i l i tw a sf o u n dt h a tt h et r a p p e dw a t e re x i s t si n2s t a t e s f r e ew a t e ra n db o u n d i n gw a t e r ，t h e nt h ei n f l u e n c eo f t r a p p e dw a t e ro n t h et h e o r e t i c a l r e s u l t so fpm a z u r s e q u a t i o n w a sd i s c u s s e d i n a d d i t i o n ，an e wm e t h o d f o r d e t e r m i n i n gc e l lv o l u m ed u r i n gs l o wf r e e z i n gp r o c e s sw a sg i v e n t h ek ke q u a t i o nw a su s e dt os t u d yt h ei n f l u e n c eo f i ) m e m b r a n ep e r m e a b i l i t y p a r a m e t e r so f w a t e ra n dc r y o p r o t e c t i v ea g e n t s ，i i ) t h es i z eo ft h ec e l l ，e ta l ，o nt h ec e l l v o l u m er e s p o n s ed u r i n gl o a da n du n l o a dc r y o p r o t e c t i v e a g e n t s t h eg o o d n e s so f “m u l t i s t e pm e t h o dl o a da n du n l o a dc r y o p r o t e c t i v ea g e n t s ”w a si n v e s t i g a t e ，a n dt h e c o r r e s p o n d i n gh i s t o r yo fc e l lv o l u m ea n di n t r a c e l l u l a rs o l u t ec o n c e n t r a t i o nc h a n g e w a ss t u d i e di nd e t a i l t h e nt h eo p t i m a le q u i l i b r i u mt i m ef o rt h e “m u l t i s t e pm e t h o d w a s p u tf o r w a r d ，a n dt h em e t h o d f o rd e t e r m i n i n gi tw a sd i s c u s s e d b yi n t r o d u c i n gt h ei n t r a c e l l u l a ri c ev o l u m ev i c e ( c ，t ) t e r mi n t ot h ec l a s s i c a lp m a z u re q u a t i o n ，t h ef l a wo ft h i sm o d e lt h a ti tc a nn o tb eu s e dt od e s c r i b et h ew a t e r t r a n s f e ra c r o s sc e l lm e m b r a n ea f t e rt h ea p p e a r a n c eo fi n t r a c e l l u l a ri c eh a sb e e nm a d e u p t h em o d i f i e dpm a z u re q u a t i o nw a sc o u p l e dw i t ht h en u c l e a t i o nt h e o r ya n d t h e d i f f u s i o n - l i m i t e dc r y s t a lg r o w t ht h e o r yf r o mk a r l s s o njom sm o d e l ，an e wm o d e l d e s c r i b i n gi n t r a c e l l u l a ri c en u c l e a t i o na n di t sg r o w t hw a sd e v e l o p e d t h en e wm o d e l c a nb eu s e dt o p r e d i c ti n t r a c e l l u l a ri c e v o l u m ea n ds i z ed i s t r i b u t i o nn om a t t e rt h e c o n c e n t r a t i o no fc r y o p r o t e c t i v ea g e n t si sh i g ho rl o w ，a n ds ok a r l s s o n sm o d e lw a s i i i 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 f u r t h e rm o d i f i e dt ob ea b l et od e s c r i b ei n t r a c e l l u l a ri c en u c l e a t i o na n di t sg r o w t h w h i l el o wc o n c e n t r a t i o no f c r y o p r o t e c t i v ea g e n t s i s p r e s e n t t h e v i t r i f i c a t i o n c o n d i t i o no fi n t r a c e l l u l a rs o l u t i o nw a sd e t e r m i n e du s i n gt h en e wm o d e l i na d d i t i o n ， t h ea v e r a g en u m b e r ( h ) o fw a t e rm o l e c u l e si nt h eh y d r a t i o ns h e l l ( s ) a s s o c i a t e dw i t h o n en a c lm o l e c u l ew a sg i v e no u t ，a n di t si n f l u e n c eo nt h en e wm o d e l sr e s u l t sw a s s t u d i e di nd e t a i l i tw a sp o i n t e do u tt h a tt od e t e r m i n et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nha n d t h ec o n c e n t r a t i o nca n d t e m p e r a t u r etb ye x p e r i m e n t a lm e t h o d i sv e r yi m p o r t a n t ，t h e l o c a lv i t r i f i c a t i o np h e n o m e n o nw a sf i r s to f f e r e d ，a n di t si n f l u e n c eo nt h er e s u l t so f t h e n e wm o d e lw a sa l s od i s c u s s e di nd e t a i l a na n a l y s i so ft h es u p p l e m e n t e dp h a s e d i a g r a mo f w a t e r g l y c e r o lh a sg i v e n s o m ei n f o r m a t i o no f t h ee x i s t e n c eo f i t k e y m o r d s ：。p e r m e a b i e t y ；t r a p p e d w a t e r ；i n t r a c e j _ u t a ri c e ；h o m o g e n e o u s n u c l e a t i o n ；v i t r i f i c a t i o n ；i c ec r y s t a lg r o w t h i v 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 符号表 a细胞膜表面积 水分子表观水力半径 曰 降温速率 c v o g e 卜f u l c h e r 关系式指数项前缀系数 c细胞内溶液组分 c 9纯冰罩水的浓度 吒 细胞内溶液中水的浓度 c 。 细胞内c p a 的浓度 c 。 液相线上水的浓度 c 。细胞内溶液中n a c l 的浓度 q 。 初始胞内n a c l 的浓度 c 。胞内水的浓度 d 水分子的扩散系数 西水分子有效扩散系数 e v o g e l f u l c h e r 关系式指数系数 e l 细胞膜水渗透的a r r h h e n i u s 活化能 ，“”单位体积均相成核率 ，细胞内总的成核率 i取样常数 上。 细胞膜的水渗透率 。 参考温度下细胞膜的水渗透率 一个代表性细胞内的冰核数 细胞内c p a 的摩尔数 ，细胞内n a c 的摩尔数 只气体常数 r冰晶半径 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 温度 初始温度 v o g e l f u l c h e r 临界温度 玻璃化转变温度 均相成核温度 纯水的均相成核温度 平衡凝固点 纯水的平衡凝固点 细胞膜水渗透率参考温度 时间 胞内冰的体积 细胞内非渗透性体积 细胞内溶液体积 细胞体积 等渗细胞内水的体积 c p a 的偏摩尔体积 n a c i 的偏摩尔体积 水的偏摩尔体积 胞内冰的体积份额 校正后胞内冰的体积份额 c p a 的摩尔分数 n a c i 的摩尔分数 水的摩尔分数 无量纲化冰晶生长参数 纯冰的融解热 采样时间间隔内生成的冰核数 过冷度 r 瓦i i瓦l， k u 叱 _ “ d 脯 埘。缸 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 粘度 水一甘油二元溶液的粘度 均相成核热力学参数 均相成核热力学参数参考值 n a c l 的离解常数 均相成核动力学参数 均相成核动力学参数参考值 n a c l 的体积分数 溶液的过冷度表征参数 纯水的过冷度表征参数 ，几盛， 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 1 1 研究背景 第一章绪论 1 1 1 低温生物学的诞生及其研究内容 科学技术的发展推动了人类社会的文明与进步，反之，人类社会的文明与 进步进一步促使科学技术事业突飞猛进当今社会的高速发展必然导致一般意 义上原本不相关的各个学科之间纷纷出现相互交叉与结合，从两开辟更广泛、 更新颖的研究领域。低温生物学( c r y o b i o l o g y ) 是在生物学、热物理学、医学 等学科的交叉领域产生的一门新兴学科。低温生物学可定义为研究在低温下， 特别是在纯水冰点( o ) 以下，细胞、组织、器官、机体与环境相互作用的 物理及生物学行为的一门新兴交叉学科。 近年来，该学科与生产实践的结合进一步拓宽了其原有的研究领域。其主 要研究内容包括动植物对寒冷环境的忍耐性、冻伤及其防治，低温酶学，极地 生物学，动物冬眠，生物细胞、组织的低温保存和移植，低温杀伤异常组织， 食品、药品低温冷冻保存和冷冻干燥保存，还包括电镜生物样品的低温制备技 术，以及若干低温医学的方向，如低温麻醉、人的冻伤和低温保护，利用低温 手术器械杀伤异常组织如肿瘤等【1 ，2 】。可见，低温生物学和低温医学所研 究的内容很多是相同的，它们相互依赖、相互补充。 1 1 2 低温保存技术概论 堡墨堡查盟扭佥 低温保存是低温生物学的一个重要研究方向，其主要内容是研究细胞、组织、 器官的低温损伤规律，特别是与细胞内外水结晶相关的损伤，依据物理和生物学 原理，建立生物物理模型，探索细胞低温损伤机理，改进生物材料长期深低温保 中固科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 存的操作程序，设计与优化常用的低温冷冻保存设备，实现生物细胞、组织乃至 器官在液氮温度( 一1 9 6 。c ) 下的长期深低温保存( 数月甚至数年、数十年) ，在 临床上具有重要的应用价值。 低温保存的可行性及其壁鲎依据 将生物体放在低温下长期保存以延续生命，一直是人类的梦想。从上个世 纪起，科幻小说家就描写了人在低温下心脏停止跳动之后又复活的情景。 生物体的低温保存，是指将活的生物体采用特殊的方法冷却至低温( 一般 为一1 9 6 ) 后长期保存。待需要时，将生物体加热至正常温度。真正在科学 意义上实现低温保存是在1 9 4 9 年，两位英国生物学家( c p o l g e 和a u s r a i t h ) 在实验中偶然发现加了甘油的精子可以经历低温而不死亡。他们将这 个发现发表在自然杂志上后，引起极大重视，从此一大批科学家被吸引到 “低温保存”这个课题上来【l 】。1 9 8 0 年，美国纽约血液中心将在液氮中冷冻 保存了1 2 年的红细胞复温后进行检查，没有发现任何生化和功能上的变异， 从而证明了生物体可以在低温下长期存活这一猜想( 至少在细胞这一层次上) 。 生物体之所以能在低温下长期保存，是因为低温能抑制生物体的生化活 动，即生物体内一切代谢过程的化学变化。当温度降到一定程度时，机体的细 胞既不会衰老，也不会退化，而是处于生物学意义上的“时间停止”状态。 因而使生命得以保存。我们知道，水是生物体内的主要成分，对细胞的结构和 功能有着重要的意义。一方面，在极低温度下( 例如在一1 3 04 c 下) ，液态水已 经不可能存在，水只可能以晶体和玻璃态两种物理状态存在，在这两种状态下， 水的粘度都很高( 1 0 ”p o i s e ) ，在通常的时问尺度范围内，扩散过程是不重 要的；另一方面，在一1 9 6 的温度下，已经没有足够的热能来进行化学反应。 所以，在低温下，生物细胞的新陈代谢活动急剧减慢，也可以说低温导致生物 学时间的减慢甚至停止【3 】。这就使得细胞、组织乃至生物体在低温下的长期 保存成为可能。 垡量堡查的塑丛垫墨 生物体虽能在低温下长期保存，但却极易在硷鎏莹运加基亟厦圭隧j 臣鎏 埕垃趔l g 2 ：隆墨复显过猩中遭受损伤而死亡。添加去除c p a 过程细胞 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 主要承受渗透压突变引起的渗透性损伤。典型的降温复温过程包括三个主要 的物理化学过程，即液态溶液的固化过程、固态溶液的融化过程和水分通过细 胞膜的渗透过程。随之产生细胞内外溶液中冰晶的形成和生长、冰晶再结晶、 玻璃化与反玻璃化等，在此过程中，高渗压应力、机械应力和溶液的高浓度毒 性等因素均会损伤细胞。不同的生物体要求的低温处理程序不同，包括特定的 c p a 及其溶液组分，最优化的添加去除c p a 的方式，特定的降温、复温程序。 科学家们针对不同的细胞，通过实验逐渐摸索出不同的低温保存程序。低温保 存人体细胞、组织、器官及胚胎等，为临床医学带来了一些突破性的发展，具 有不可估量的经济效益和社会效益。 垡墨堡查盟童苤： 人的精子和胚胎的低温保存，可使许多患不育症的夫妇喜得子女。低温保 存的精子存活率高、存活时间长，使用方便，为临床人工受精、体外受精奠定 了基础。精予低温保存的成功为低温保存卵子和胚胎提供了经验。1 9 7 2 年，小 鼠受精卵低温保存成功。1 9 8 3 年，用冷冻卵子做体外受精婴儿获得成功。近 2 0 年内，世界上发表了千余篇关于胚胎保存的论文，1 6 种动物的胚胎已成功 保存，出生试管婴儿6 0 0 0 多例。低温保存两性生殖细胞及胚胎的成功，标志 着生殖医学已步入新的时代。人类有望将人卵体外受精、体外发育和胚胎移植 等生殖工程技术与遗传工程结合起来，以改造亚性遗传物质，改善整个人体的 遗传组成，并极有可能真正控制和指导自己的进化方向。 角膜是眼腈的重要屈光介质，因角膜损伤引起的失明是主要的失明原因之 一。虽然通过移植角膜可复明，但直到2 0 世纪，角膜低温长期保存的成功才 使角膜移植成为现实。抢救严重烧伤病人，必须覆盖创面，减少体液的流失并 保护创面不受污染，而这单靠自身皮肤是远远不能满足的。因此，皮肤的低温 保存为其提供了方便。众所周知，缺乏胰岛索会引起糖尿病。人体内胰岛素是 由胰腺的内分泌部及胰岛的乙细胞分泌的，成人胰腺约有1 0 0 万至2 0 0 万个胰 岛，约占胰腺体积的5 。通过移植胰岛细胞或胰腺组织能使病人重新获得胰 岛素，会在定程度上使病情得到缓解或治疗。但此技术需要大量分离的胰岛， 一般每个患者需6 至8 个胎儿的胰岛，而在同一时间内要获得如此多的胰岛十 a 本小节韶分资料来自百联网已经失- z 其文献引用信息。 中囤科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 分困难，因此胰岛的保存就成了胰岛移植的关键问题。在这方面，应用低温保 存技术，就可积累大量胰岛，以供随时使用。 在临床应用中，人类血液成分( 红细胞、血小板、血浆等) 的低温保存， 使得建立血液成分库成为可能，这样可解决供血、输血双方在时间和配型的矛 盾。并且还可以使医院有足够的时间来检验传播性疾病( 如h i v 等) 。骨髓细 胞的低温保存为癌症治疗开创了一种新的途径。此外。对于濒临灭绝的珍稀动 物，例如东北虎、大熊猫等，有可能通过低温保存精子的方法得到物种保存。 人胚胎干细胞、造血干细胞等的低温保存更是具有及其重要的临床应用价值。 低温确实能抑制生物体的生化活动。但科学幻想和科学毕竟是两回事。科 学家们经过艰苦的努力，已能成功地保存人体的多种成份，为细胞、组织甚至 器官的移植做出了重大贡献，可以改善患者的生活质量，延长寿命。但由于整 个人体是由大量的细胞、组织、器官组成的极复杂的生物体。一般说来，生物 体的结构越复杂、体积越大，低温保存就越困难。所以就目前的科学水平而言， 还不能实现整个人体的低温保存。然而，人体的低温保存并非没有可能，随着 科学技术的发展，美好生命的永存也许会在未来成为现实1 1 2 研究现状 低温保存的主要步骤可以概括为【4 】： 1 、冷冻前添加低温保护剂( c p a s ) 至细胞，组织，器官等生物材料中( 该 过程称为灌注低温保护剂) ： 2 、将灌注后的生物材料降温至某一特定终止温度( 比如一1 9 6 。c ，在1 a t m 下液氮的温度) ； 3 、深低温下长期保存生物样品( 一般是液氮温度) ，以各使用； 4 、复温经低温固化的生物材料( 包含冻结和玻璃化两种固化方式) ： 5 、从复温后的生物材料中去除c p a s l 6 、临床使用或实验使用。 本领域的研究主要集中在以上1 ，2 ，4 ，5 几个步骤，亦即添加去除c p a 过程和降温复温过程。由王查塞堡基绳堕堡运堡在迢建壅堑堡壅：固亘丝e 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 1 2 1 添加去除c p a s 过程的研究 一般而言，由于水透过细胞膜的输运比c p a 快，添加c p a 时，细胞体积 先收缩，随后逐渐恢复至接近正常体积( 等渗体积) ；去除c p a 时，细胞体积 先收缩，随后也逐渐恢复至接近正常体积。这里细胞的体积变化分别有一个最 小值和最大值，该数值取决于细胞外溶液成分的突变跨度，以及细胞膜对特定 c p a 和水的渗透系数( 这里仅对渗透性c p a 进行探讨，关于渗透性c p a 与非 渗透性c p a 的概念，详见第二章) 。 j o h n s o n 和p i c k e r i n g 以及j o l y 等研究了对老鼠卵细胞添加c p a ( d m s o 和 1 ，2 丙二醇) 的过程，指出该过程会引起卵细胞的细胞骨架的化学性破坏【5 ， 6 】。w a t s o n 等的研究结果表明许多物种( 如公牛，公猪和人类) 的精子一旦暴 露于甘油环境中会受到破坏【7 】，s h e r m a n 等也报道了人类精子暴露于甘油中， 其活性降低【8 】。w o o d sej 等使用改装的电子粒子计数仪( c o u l t e rc o u n t e r ) 分别研究了在2 2 、1 0 、4 c 下人类血小板添加和去除d m s o 和p g 过程中细胞 体积的变化，并通过对描述该过程的微分方程进行系数拟合，得到人类血小板 对水与两种低温保护齐u ( d m s o p g ) 的渗透系数及其相应的活化能，然后通过 计算机模拟得到其他条件下添加与去除c p a 过程细胞体积变化的极限，通过 己知的体积安全极限值，可预测该过程是否会对细胞造成渗透性损伤及其损伤 程度【9 】。w o o d sej 等的研究为这类研究的典范。j u nl i u 等研究了犬的胰岛 细胞在2 2 ，5 ，一3 ，一1 1 下添加d m s o 过程中细胞体积的变化历程，给出了细胞 膜的渗透性参数及其活化能，并利用实验测定的参数完成了降温冷冻过程和复 温融解过程中细胞胞内水的变化历史【l o l 。g a ody 等给出了对人类精子添 加和去除g l y c e r o l 的优化步骤，使用了分步添加、分步去除的技巧【1 l 】。t h o m a s h p a p a n e k 利用自行设计制作的一套流体光学系统测定了红细胞膜在2 5 一 】0 c 范围内对水的渗透系数【1 2 】。除此之外，还有很多关于温度本身，低温 保存过程，低温保护剂及其浓度等因素对于细胞膜的水渗透系数( l p ) 的影响 的研究【1 3 1 6 】。 这耋班塞基奎壑星筮塑塞坠：型王缝定笪绁墼耋型：垄圣盐量廑工：鎏捶 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 1 2 2 胞外冰的形成溶液的相变 细胞的低温保存，通常是将细胞悬浮于低温保护寿u 溶液中，制备成细胞悬 浮液，将其作为一个整体降温冷冻。细胞外溶液是细胞所处的外环境( 简称胞 外溶液) ，在降温过程中，胞外溶液的相变，溶液温度、浓度的变化，决定了 溶液中细胞的反应( 包括细胞与溶液的相互作用) ，进雨决定了细胞的损伤程 度，直接影响细胞的存活率。为了深入研究低温保存过程中细胞的变化，首先 应该研究降温过程中胞外溶液的相变过程。 由于相变潜热的存在，导致热量的吸收或者释放贯穿整个相变过程，因而 相变问题通常是非线性的，精确的解析解只局限于少数纯物质一维无限大或半 无限大问题【2 5 ，2 6 】。在细胞的低温保存过程中，细胞外溶液通常是以生理盐 水( 0 9 w vn a c | 水溶液) 或磷酸盐缓冲液( p b s ) 为母液的多元系统，例如 h 2 0 n a c i 二元溶液，h 2 0 n a c i c p a 三元溶液，h 2 0 一n a c i c p a s 多元溶液等。 多组分系统的相变与纯物质的相变有着显著的差别。纯物质的相变发生在一个 确定的温度( 即相变温度) 下，而多组分系统的相变则通常发生在一定的温度 范围之内。在纯物质的相变过程中，通常有一个明确的固液交界面而在多组 分系统的相变过程中除了固相区、液相区之外，还存在一个固、液两相共存区 ( 糊状区，m u s h y z o n e ) 。这些特点使得多组分系统的相变问题变得尤为复杂， 对其进行传热、传质分析通常只能依赖于数值计算的方法。 描述多组分系统相变问题的数学模型主要分为两种，分别是单相模型和两 相模型。两相模型是根据两相共存区的物理特点，对每一相建立相应的守恒方 程。再利用两相之间的耦合关系，使方程得以封闭。p r a k a s h 建立了描述二元 一一一一一一一 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 系统固液相变的完整的两相模型，并对一些简单情况进行了求解【2 7 ，2 8 】。然 而，由于在两相模型中，需要交界面交换项的模型，而在实际的二元和多元系 统中，这一交换项的确切模型还没有建立，所以两相模型的实际应用还有赖于 对这一模型的更基础的研究。单相模型是实际应用较广的一类模型，单相模型 是建立在混合理论的基础上，用统一的连续体的守恒方程来代替两相流方程， 这一方程可以应用到整个相变区域，包括固相区、液相区和固液两相共存区。 单相模型也需要一定的补充关系来使方程封闭。t i e n 在忽略传质过程，假定两 相共存区中固相的质量分数与空间变量x 为线性关系的基础上，利用积分的 方法，得到了半无限大二元共晶系统相变问题的近似解析解【2 9 】；v o l l e r 则假 设在两相共存区中，固相所占的质量分数可以用温度的线性函数来表示，将 此作为补充关系，在考虑对流的条件下，建立了两相共存区的模型【3 0 】，该 模型中也没有考虑传质过程，并且实际上与温度的关系应该是局部溶液浓度 的函数【3 1 】；b e n n o n 和i n c r o p e r a 根据局部平衡的假设，应用二元系统的相 图关系，将固相所占的质量分数与温度、浓度联系起来，使方程封闭，从而建 立了二元系统相变的连续体模型，并将此模型成功应用到氯化铵水溶液凝固过 程的计算中【3 2 ，3 3 】。b e n n o n 和i n c r o p e r a 后来又对这一模型的具体求解方 法进行了详细的晚明，包括方程的离散，相图关系的应用等，并分别在有、无 对流的两种情况下，对氯化铵水溶液的凝固过程进芎亍了数值模拟 3 4 】。p r a k a s h 和v o l l e r 又根据此模型中耦合方程的特点，提出了一种能加快收敛的迭代格式 【3 5 】。z e n g 等则在此模型的基础上，用温度方程代替了焓方程，并引入了有 效热系数和有效热源项的定义，建立了显热容法与热源法之闻的联系，使褥对 温度的求解变得简单，并将数值模拟的结果与实验结果进行比较 3 6 1 。 鎏差丛壅塑星堡塞整丝丝叁垫! 量垫丕錾：竖垫窒笺2 ：丕耋盛翅丝叁塾 堕显鏖：鎏鏖丝丞塑銮整猩盟銮丝：丝圭耋廛垫墼丝呈! 厶( 壑堑垫塑荭耋：丞 占签翟出笠2 过渣这丝丝笪毖堕：圭墨量出王篮星工丝整叁垫丝匡至：丝丞銮 塑世焦焦显墼回壁鲍韭垡丝：给塞堡堂壅固蕉： 1 2 3 冷冻过程中细胞的反应 中国科学技术大学博士学, f 立i e 5 l ( 2 0 0 4 ) 赵即 冷冻过程中细胞及其胞内外溶液中发生的主要物理事件如图i 1 所示：当 温度降低至o o c 以下( 典型情况为o 一5o c ) ，由于过冷和细胞内外通常存在 c p a ，溶液的凝固点降低，细胞内外溶液均保持未冻结状态；继续降温至某- 一一 温度值( 典型情况为一5 1 5 。c ) ，由于过冷溶液在容器内表面异相成核，或 者人为种冰( s e e d i n g ，也叫置核，崩液氮浸过的细丝轻轻接触溶液的表面或者 容器的表面，以求在局部点上形成大的过冷度，形成晶核，降低整体水或者溶 图1 1 冷冻过程中细胞反应示意图 液f 勺过冷度) ，首先在细胞外溶液中形成冰晶，而细胞内溶液仍然保持未冻结 状态，这种现象主要是因为细胞膜阻碍了冰晶由胞外向胞内的生长【3 】。冰晶 的析出，导致胞外溶液浓度增大，进而胞内过冷水化学势高于胞外水，这一细 胞内外化学势差将促使胞内水通过细胞膜外渗；当温度继续降低时，降温速率 的不同会导致3 种截然不同的细胞反应：如果降温速率足够低( 慢速降温) ， 胞内水有充足的时间外流，细胞内溶液的浓度增加以保持细胞膜内外溶液的化 学势平衡，最终的结果是细胞严重脱水，没有胞内冰形成( i i f ) ，细胞经历“溶 液损伤”；反之，如果降温速率很快( 快速降温) ，胞内水没有足够的时间外 流而被束缚在胞内，胞内溶液的过冷度增大，将导致i i f ，胞内溶液浓度同样 也会增大以维持细胞内外溶液的化学势平衡，细胞经历“胞内冰损伤”：中 等降温速率f ( 通常也是最优化降温速率) ，细胞失水和胞内冰形成均存在 中国科学技术大学博士学瞰( 2 0 0 4 ) 赵刚 两者共同起作用以维持细胞内外溶液的化学势平衡。 1 9 6 3 年。m a z u r 提出了第一个热力学模型来描述在冷冻过程中细胞的失 水过程，力图定量地预测细胞在溶液冻结过程中的反应 3 7 1 。在m a z u r 的模 型中，细胞被认为是由细胞膜和胞内溶液两部份组成，其中细胞膜为理想半透 膜，即只有水分子可以自由通透，细胞内溶液为理想稀溶液，冻结过程中细胞 的失水主要是由于细胞内过冷液体与细胞外部分冻结的溶液之间蒸汽压的差 别造成，并利用c l a u s i u s c l a p e y r o n 方程来描述蒸汽压的变化。m a z u r 最后得 到一个关于细胞体积的二阶常微分方程，将细胞的体积变化与温度、降温速率 和细胞性质( 如表面积，细胞内溶液中的溶质，细胞膜的渗透系数等) 联系起 来，这个数学模型被广泛地应用于细胞冷冻保存的研究中，并成为以后研究胞 内冰形成机理的基础【3 8 ，3 9 】。 m a n s o o r i 对m a z u r 的模型进行了补充【4 0 】，首先他将细胞内溶液及细 胞外冰的蒸汽压分别用经验公式表示( 在m a z u r 的模型中，利用 c l a u s i u s c l a p e y r o n 方程来描述蒸汽压的变化) ；其次他依次考虑了细胞内溶液 为非理想溶液、细胞膜表面积的变化及细胞内部温度分布不均匀三种因素的影 响。m a n s o o r i 的计算结果表明：蒸汽压方程的改变，只在降温速率较大时 与m a z u r 模型的结果有明显的差别：考虑出于细胞体积变化而引起的细胞 膜表面积的变化是必要的；而细胞内温度分前i 不一致的影响只在冷冻前细胞 内水份较少的情况下是明显的。 f a h y 首先指出m a z u r 方程可以由二阶常微分方程降为一阶，其次，他认 为如果有d m s o 和甘油等低温保护剂的存在，应该考虑溶液非理想性的影响 【4 l 】。f a h y 将渗透压表示为溶液活度的函数，并利用他对三元溶液 d m s o n a c i w a t e r 和g l y c e r o l - n a c l w a t e r 相图研究的结果【4 2 】，将细胞外 溶液中水的活度表示为温度的函数，细胞内非理想溶液的活度可以表示细胞体 积、溶质浓度等的函数，最后得到一个关于细胞体积的一阶常微分方程，并且 提出了- , e e 易于计算的方法来求解这个方程，避免了用r u n g e - k u a a 法数值求 解的繁琐。相同条件下与m a z u r 方程计算结果的比较表明f a h y 所得到的方程 以及计算方法是正确的。 l e v i n 考虑了溶质水合作用的影响，并将其模型成功地应用到对人类红血 球的研究中 4 3 】。k a r l s s o n 在对冷冻过程中胞内冰晶形成和生长的研究中， 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 将m a z u r 方程推广到可用于低温保护剂存在的条件 3 9 】。l u o 计算了大样品 冷冻过程中，不同位置处经历的降温过程及其细胞发应，指出了实际冷冻绌胞 悬浮液过程中，空间位置对冷冻效果产生影向 4 4 】。 些占型旦丝! i 坚直握耍基丝正丝塞笪逝鲎堑丝堡遮堇丝：丝适旦垂墼自鲨 兰竺至笪墼童丞丝自坠笪：逢堡至! 麴堕叁垄堇堡圭垡垄銮些笪塑型： 胞内冰的形成与生长 不同的细胞类型在冷冻过程中的反应迥然不同，经历i l f 的降温速率从1 m i n 1 0 0 0 r a i n ，经历i i f 的温度起点在一5 5 0 【4 5 5 8 】。跨度如此 大的i i f 条件决定了i i f 的复杂机理。 胞内冰形成的机理主要有4 种假说：孔隙理论；膜损伤理论：表面 催化理论：体积催化理论。m a z u r 于1 9 6 5 年提出了孔隙理论，认为细胞外 冰晶的生长穿过细胞膜，是造成细胞内冰晶出现的原因【3 】，然而为使细胞外 的冰晶能够穿过细胞膜的孔隙，冰晶前峰的尺寸必须相当于细胞孔隙的尺寸量 级，即3 8 a ( 1 0 “o m ) 。温度稍高时，如此小的冰晶前峰是不稳定的，细胞膜 的存在会阻碍冰晶向胞内的生长，因而只有温度较低时，细胞外的冰晶才请穿 过细胞膜，于细胞内过冷液体接触，形成胞内冰。膜损伤理论则认为胞内冰晶 的形成是由于细胞膜受到破坏，使得细胞质暴露于细胞外的含有冰晶的溶液造 成的。1 9 6 1 年，a s a h i n a 指出细胞膜的破坏是i i f 的原因【5 9 】。s t e p o n k u s 用 低温显微镜观察到胞内冰形成之i 日的细胞膜损伤【4 5 】。这一实验结果表明由 于细胞膜的损坏导致胞内冰形成，而不是后者导致前者。表面催化理论认为i i f 是由于胞内冰与细胞膜的相互作用，使得细胞膜内表面成为冰晶的成核点而导 致的。该理论并不认为胞外冰与细胞质的接触是i i f 的必要条件【3 8 】。体积催 化理论认为胞内冰的形成是由于细胞内溶液中的不纯颗粒导致【3 8 】。这种形 式的成核在温度较低时出现，通常接近于水的各向同性成核温度。 1 9 7 7 年m a z u r 依据实验结果提出了一个现象学模型来预测胞内冰的形成 ( i i f ) 【6 0 】。随后p i t t 和s t e p o n k u s 通过b i 入统计学信息到m a z u r 的模型中， 改进了这一模型【6 1 】。然而这类模型的预测能力极为有限1 3 8 】并不能提供 胞内结冰过程的相关物理信息【3 9 】。t o n e r 等发展了套胞内异相成核的理论 模型，该模型耦合了冷冻过程中细胞反应1 , 3 8 1 。尽管该模型成功地预烈了好 中国科学技术大学博士学位论文( 2 0 0 4 ) 赵刚 几种细胞的i i f ，但是该模型仅仅适用于不存在c p a s 的情况【6 2 】。以上所述 及的模型，只能用来预测i i f 的起点，而忽略了冰晶的生长过程。m a c f a r l a n e 和f r a g o u l i s 发展了非等温条件下二元溶液中扩散控制的晶体生长模型，并且 用来预测了种l i c i h 2 0 玻璃复温过程中的反玻璃化【6 3 】。b o u t r o n 研究了 c p a s 的水溶液的结晶过程，并且针对这类溶液发展了一套半经验的冰晶生长 模型【6 4 】。这些模型并不能直接用于i i f ，主要是由于冷冻过程中，细胞内溶 液处于一个变温度变组分的过程。1 9 9 4 年k a r l s s o n 等提出了细胞内冰晶生长 的生物物理化学理论，并且建立了套耦合透过细胞膜的水的输运，胞内成核， 胞内冰晶生长3 个过程的理论模型 3 9 1 。该模型将t o n e r 模型扩展至包括c p a 存在的情况，同时将m a c f a r l a n e 和f r a g o u l i s 的模型与水输运方程耦合。k a r l s s o n 成功地使用该模型理论研究了甘油化地老鼠卵细胞在冷冻过程中胞内冰的体 积份额与大小分布【3 9 1 。 k a r l s s o n 的模型初具轮廓，是胞内冰模型中最新最全面的模型，但是尚且 存在很多需要继续完善的地方。该模型的发展主要是c p a 存在且浓度较高的 情况，这种条件下