（运动人体科学专业论文）8周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响.pdf

摘要 目的：心肌蛋白质是心脏结构和功能的基础，长期系统的运动训 练可使心肌结构和功能发生变化，这必然导致心肌蛋白质的表达量和 质发生变化。本研究从蛋白质组学整体、定量的角度，探讨s d 大鼠 在8 周中小强度有氧运动条件下，右心室肌蛋白质组的差异表达及其 规律，初步筛选出在运动应激条件下对心脏重塑发挥重要作用的目标 蛋白质。为深入研究国民体质健康的运动干预，也为慢性心血管疾病 的运动康复提供实验依据。 方法：以2 0 只雄性s d 大鼠为研究对象，按照体重随机分为运 动组和对照组( n _ 1 0 ) 。运动组经8 周中小强度有氧运动跑台训练后 6 h ，与对照组同时麻醉处死，提取右心室肌的全蛋白进行双向凝胶电 泳技术分离；运用b i op dq u e s t 图像分析软件对双向凝胶电泳图谱进 行分析，选取运动后差异表达量5 倍的蛋白质点，用串联飞行时间 质谱蛋白质仪进行质谱鉴定，以逆转录聚合酶链反应( r t - p c r ) 对 目标蛋白质的基因表达进行m r n a 转录水平上的检测。 结果：经过8 周运动后，与对照组相比运动组心脏重量指数增加 3 2 o ，具有显著性差异( p i 5 倍 的点有8 个，下调2 倍的点有2 5 个，下调5 倍的点有8 个。选择 差异表达量 5 倍的1 6 个点为目标蛋白质进行质谱分析，共鉴定出 t 1 1 个蛋白质，这些目标蛋白质点有：心肌肌动蛋白仅1 运动后表达量 上调9 5 倍、膜联蛋白a 6 运动后表达量上调5 4 倍、丙酮酸脱氢酶 e l o t l 运动后表达量上调5 3 倍、原肌球调节蛋白4 运动后表达量上调 5 5 倍、蛋白组氨酸磷酸酶运动后表达量上调9 6 倍、次黄嘌呤鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶运动后表达量下调9 7 倍、线粒体羧甲基烯酰一c o a p 链运动后表达量下调1 4 6 倍、线粒体电子转移黄素蛋白p 亚基运动 后表达量下调1 6 1 倍、线粒体酰基辅酶脱氢酶长链运动后表达量下 调1 6 7 倍、线粒体乌头酸水合酶运动后表达量下调11 3 倍和一个分 子量2 9 k d a 的未知蛋白运动后表达量上调5 3 倍。逆转录聚合酶链检 测结果显示：膜联蛋白a 6 、心肌肌动蛋白o 【1 、蛋白组氨酸磷酸酶、 线粒体羧甲基烯酰c o a1 3 链、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、线粒 体酰基辅酶脱氢酶长链的m r n a 表达量出现下降；线粒体乌头酸水 合酶、原肌球调节蛋白4 的m r n a 的表达量出现上升。 结论：经过8 周中小强度有氧运动后，大鼠右心室肌蛋白质组 发生了显著性差异表达。采用中小强度有氧运动，心肌收缩能力增 强，能量代谢水平和钙离子调节水平发生变化，运动对能量代谢和钙 离子调节的不同过程有不同的影响，其机制有待进一步证实。蛋白 质表达水平与其基因表达水平不完全一致，表明运动对蛋白质表达的 影响可能与上游基因的转录有关也可能与下游的翻译、修饰有关。 关键词：蛋白质组；右心室肌；中小强度有氧运动；双向凝胶电泳； 质谱质谱鉴定；r t - p c r i i a b s t r a c t o b j e c t i v e ：c a r d i a cm u s c l ep r o t e i ni st h eb a s i co fh e a r t ss 仃u c t u r e a n df u n c t i o n ，m y o c a r d i a ls t r u c t u r ea n df u n c t i o nc a nb ec h a n g e dd u et o t r a i n i n go fl o n g t e r ms y s t e m , t h i sw i l li n e v i t a b l yl e a dt ot h ec h a n g e so f c a r d i a cp r o t e i ne x p r e s s i o no fq u a n t i t ya n dq u a l i t y t h i ss t u d yi n v e s t i g a t e t h ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o na n dt h el a wo f f i g h tv e n t r i c u l a rm u s c l ep r o t e i n d u r i n gt h em o d e r a t ea n ds m a l li n t e n s i t ya e r o b i ce x e r c i s ec o n d i t i o n sf r o m t h es i g h to fq u a n t i t a t i v ea n dq u a l i t a t i v ea n dp r e l i m i n a r ys e e k i n go u tt h e t a r g e tp r o t e i nt h a tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc a r d i a cr e m o d e l i n g i nu n d e r t h ec o n d i t i o no fe x e r c i s es t r e s s p r o v i d ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o rs t u d y t h ee x e r c i s ei n t e r v e n t io no fn a t i o n a lc o n s t i t u t i o na n dh e a l t h ，a n df o r e x e r c i s er e h a b i l i t a t i o no fc h r o n i cc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e m e t h o d s ：2 0r a t sw e r ed i v i d e di n t oe x e r c i s ea n dr e s tg r o u pi n r a n d o m t h ee x e r c i s eg r o u pw a ss e tu pt od ot r e a d m i l lt r a i n i n gw i t h m e d i u ma n ds m a l li n t e n s i t ye x e r c i s ea n dt h e nk i l l e dt oe x t r a c tt h et o t a l p r o t e i n o f f i g h t v e n t r i c u l a rm u s c l ef o rt w od i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o n t h es p o t si nd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o nv o l u m e m o r et h a n5t i m e sa r es e l e c t e da sa l t e r n a t i v es p o t sf o rm a s ss p e c t r a ( m s ) i d e n t i f i c a t i o n t h eg e l sm a p sw e r ea n a l y z e dw i t ht h eb i op dq u e s ti m a g e a n a l y s i ss o f t w a r et oc h o o s ev a r i a b l ep r o t e i n sa n dt h ec h o s e np r o t e i n s w e r ei d e n t if i e db yu l g r a f l - f l e x t o f t o f ，d e t e c tt h eg e n em r n a i i i t r a n s c r i p t i o no ft a r g e tp r o t e i nw i t hr t - p c r r e s u l t s ：a f t e r8w e e k s t r m n m g ，t h ei n d e xo fh e a r tw e i g h to f e x e r c i s eg r o u pi n c r e a s e d3 2 c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ec o n t r o lg r o u p i n e l e c t r o p h o r e s i sm a p ，t h ea v e r a g en u m b e ro fd e t e c t e dp r o t e i ns p o ti nr e s t g r o u pa n de x e r c i s eg r o u pa r er e s p e c t i v e l y5 3 0 1 - 1 4a n d5 4 7 + 1 8 t h e r ea r e 58c h a n g e da f t e re x e r c i s e ：33i n c r e a s e de x p r e s s i o n t2 t i m e s ；2 5d e c r e a s e d e x p r e s s i o n i 2t i m e s p r o t e i ns p o t so fd i f f e r e n t i a le x p r e s s e d 75t i m e s w e r es e l e c t e da so b j e c tp r o t e i n u mi nm si d e n t i f i c a t i o na n d11 p r o t e i n s p o t so fw h i c hw e r ea s s e s s ，i n c l u d et h a ta n n e x i na 6 ( u p 5 4 ) 、p y r u v a t e d e h y d r o g e n a s ee 1 a l p h a1 ( u p 5 3 ) 、a c o n i t a t eh y d r a t a s e ，m i t o c h o n d r i a l ( d o w n11 3 ) 、a c t i n ，a l p h ac a r d i a cm u s c l e1 ( u p 9 5 ) 、t r o p o m o d u l i n4 ( u p 5 5 ) 、l o n g c h a i ns p e c i f i ca c y l - c o ad e h y d r o g e n a s e ，m i t o c h o n d r i a l ( d o w n16 7 ) 、e l e c t r o nt r a n s f e rf l a v o p r o t e i ns u b u n i tb e t ( d o w n l6 1 ) 、 m e t h y l c r o t o n o y l - c o ac a r b o x y l a s e b e t a c h a i n ， m i t o c h o n d r i a l ( d o w n l4 6 ) 、h y p o x a n t h i n e g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ( d o w n 9 7 ) 、p h o s p h o h i s f i d i n ep h o s p h a t a s e ( u p 9 6 ) 、a n d 2 9 k d a p r o t e i n ( u p 5 3 ) d e t e c t i o nr e s u l t so fr t - p c rs h o w ：a n n e x i na 6 、a c t i n ， a l p h ac a r d i a cm u s c l e1 、p h o s p h o h i s t i d i n ep h o s p h a t a s e 、l o n g c h m n s p e c i f i ca c y l c o ad e h y d r o g e n a s e、h y p o x a n t h i n e g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e 、e l e c t r o nt r a n s f e rf l a v o p r o t e i ns u b u n i tb e t m r n aw a sd e c l i n e ；p y r u v a t ed e h y d r o g e n a s ee1 a l p h a1 、a c t i n ，a l p h a c a r d i a cm u s c l e1m r n aw a si n c r e a s e i v c o n c l u s i o n ：q t h ep r o t e o m eo ft h er i g h tv e n t r i c u l a rm u s c l eh a da n o t a b l ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o nc h a n g e a f t e rt h em e d i u ma n ds m a l l i n t e n s i t yt r a i n i n g e n e r g ym e t a b o l i s ma n dc a 2 + r e g u l a t i o nl e v e lh a s c h a n g ea n dc o n t r a c t i l i t yw a se n h a n c e m e n td u r i n gt h em o d e r a t ea n ds m a l l i n t e n s i t ya e r o b i ce x e r c i s ec o n d i t i o n s ，d i f f e r e n tp r o c e s s e so fe n e r g y m e t a b o l i s ma n dc a l c i u mi o n sa d j u s t m e n th a v ed i f f e r e n te f f e c t so nt h e m o v e m e n t p r o t e i ne x p r e s s i o ni sn o te x a c t l yc o n s i s t e n tw i t ht h eg e n e e x p r e s s i o n ，s h o wt h a tt h ei n f l u e n c eo fe x e r c i s et op r o t e i ne x p r e s si s c o n c e r n e dw i t ht h et r a n s c r i p t i o no fu p s t r e a mg e n eo rt h et r a n s l a t i o n 、 d e c o r a t eo fd o w n s t r e a m k e yw o r d s ：p r o t e o m e ；r i g h tv e n t r i c u l a rm u s c l e ：m e d i u ma n ds m a l l i n t e n s i t ya e r o b i ce x e r c i s e t w od i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ；m s m s ； i m p c r v 8 周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 a c n a c r a p s b i s b s a c h a p s d d h 2 0 2 d e d t t e d t a i a a 狂澄 d g m r n p 4 0 p a g e p p m s f p i s d s s s p t e m e d 啊s m a i d i t o f t o f m s 缩略词表( 中英文对照) 乙腈( a c e t o n i t r i l e ) 丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) 过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) 甲叉丙烯酰胺 n ，n m e t h y l e n e b i s 一( a r y l a m i d e ) 】 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u _ ma l b u m i n ) 3 ( 3 一胆酰胺丙基) 一乙二胺】一1 一丙磺酸 双蒸水( d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r ) 双向凝胶电泳( t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 乙二胺四乙酸( e n t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d ) 碘乙酰胺( i o d o a c e t a m i d e ) 等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ) 固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t ) 相对分子量( r e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t ) 非离子去垢剂( n o m d e tp 4 0 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ) 肽指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ) 蛋白酶抑制剂( p h e n yl e m t h a n s u l f o n y lf l u o r i d e ) 等电点( i s o e l e c t r i cp o i n t ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 标准点编号( s t a n d a r ds p o tn u m b e r ) 四甲基乙二胺( n ，n ，n ，n ；一t e t r a m e t h y l - e t h l e n ed i a m i n e ) 三羟甲基氨基甲烷( t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ) 基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱 ( m a t r i x a s s i s t e dl a s e rt w o s t a g ed e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f - f l i g h tt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ) 4 9 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果：对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的彦律结果由本人承担。 学位论文作者签名：铉囊l 勿1 t , 年5 - 月加日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囱。 ( 请在以上相应方框内打“ 竹) 作者签名：名衫扔日期：力z 9 年歹月2 口日 锄麟：燃 嘲埘啤刚烈日 8 周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 1 前言 心肌蛋白质构成心脏结构中最重要的部分，是完成泵血功能的直 接执行者。大量的研究表明，经过长期系统的运动训练后，心肌结构 和功能发生变化，如心脏的体积增大、室壁增厚、室腔扩大、每博输 出量增加、静息心率减慢等。同时，这种变化因不同的运动应激条件 而表现不同，耐力训练使肌细胞中收缩结构的能量代谢产生了良好的 适应性改变，有利于心肌的功能代谢；大强度训练后肌细胞能量代谢 相对薄弱；力量训练使心肌收缩成分增多，有利于心脏收缩性的增强， 保证了运动时的收缩性和射血功能n 1 。 右心室作为整个心脏重要的结构和功能单位，其主要功能是在不 同的循环和负荷情况下维持肺灌注以便输送静脉血进行气体交换堙3 。 与左心室相比，右室壁较左室薄而相对容积较大，其顺应性较大，与 其容量泵功能相适应。当右心室舒张功能不全时，静脉回流受阻，中 心静脉压增高。当右心室收缩不全时，其排出量减少，肺循环血量减 少，肺泡通气血流比值增大，妨碍有效的气体交换，导致机体缺氧 和二氧化碳潴留，同时可导致左心室前负荷不足，心排出量减少。左 右心室在循环系统中是串联排列，一侧的变化会影响另侧的表现。此 外，两室壁心肌的解剖特点使得右心室的结构和功能变化不仅出现在 累及右心室或肺循环的疾病中，也见于影响左心室或体循环的疾病当 中3 。右心室功能正常与否直接影响整个循环系统的功能，也是决定 l 硕士学位论文 心脏疾病预后的重要因素，在临床上对于许多心脏疾病的危险性分级 以及患者的随访有着重要的作用。 在运动医学领域中，国内外有关蛋白质组学的研究，国内目前有 史绍蓉、刘田、龚丽等对力竭运动和递增负荷运动大鼠心室肌和心房 肌蛋白质组进行了研究h 刮；袁爱国、刘建荣、王娟对长时间中等强 度有氧运动心脏重塑过程中心室和心房进行了蛋白质组学研究睁“1 ， 共鉴定了差异表达量在5 倍以上的蛋白质点4 0 多个，其主要涉及与 线粒体a t p 合成酶及其相关蛋白；心肌糖代谢、脂肪代谢相关酶； 心脏结构蛋白：热休克蛋白家族等。并对其功能、所出现的部位、不 同运动对其表达的影响做了详细阐述。以常芸等为代表的科研工作者 们对运动心脏这一问题发表了不少综述和研究论文，从细胞学和分子 生物学角度对运动心脏和高血压等病理心脏在结构、功能和代谢方面 的变化和异同进行了新的探索n 2 。1 引。国外，y u a n n 8 3 等用蛋白质组学 的研究方法研究遗传性肥胖小鼠和野生型小鼠运动后血清蛋白质组 的差异性表达；r o g e r s n 明等应用差异蛋白质组技术对安静状态和运动 训练大鼠左心室肌蛋白进行了研究，发现有显著性差异表达的一组是 热休克蛋白和3 a - 羟基类固醇脱氢酶；b o l u y t 乜们等发现，运动组经过 6 周递增运动负荷的耐力运动后诱导的肥大心肌中，有2 6 个蛋白质 点的表达量发生了改变，有1 2 个点是新增的。 有研究者将蛋白质组学运用到心血管疾病研究中，用来观察心肌 缺血、高血压、心肌肥大、心力衰竭、心肌梗死导致的心肌蛋白质表 达水平和翻译后修饰的改变，以进一步研究疾病的发病机理堙卜2 刳。近 8 周有氧运动对人鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 几年来有关心肌病尤其是扩张型心肌病蛋白质组学研究最受关注，主 要是分析病变心肌与正常心肌组织或细胞的差异蛋白质，包括结合蛋 白等细胞骨架蛋白、肌球蛋白轻链2 ( m l c 2 ) ，肌酸激酶、a t p 合成酶、 泛素c 末端水解酶等与线粒体能量产生相关蛋白以及热休克蛋白 h s p 6 0 、h s p 7 0 等应激相关蛋白乜3 屯引。对心肌缺血保护机制的研究主 要集中在对蛋白激酶c ( p k c ) 功能蛋白质组学的探讨瞳心钊。在应用蛋 白质组学技术研究心脏衰老保护机制的性别差异中，发现心脏中糖酵 解和线粒体的代谢改变可能是心肌衰老的机制眨引。k a n s k i 3 等鉴定了 衰老大鼠的整个心脏组织匀浆液和心脏线粒体的4 8 个蛋白，其中包 括负责能量产生和代谢以及参与维持细胞结构完整的蛋白质。 项目组前期已采用不同运动强度实验动物模型进行了心肌不同 部位的目标蛋白质筛选，本研究通过复制中小强度有氧运动的动物模 型，探讨在中小强度有氧运动过程中右心室肌蛋白质差异表达的动态 变化及其规律，初步筛选出对运动应激具有重要意义的右心室肌目标 蛋白质，采用r e a l t i m e p c r ( r t - p c r ) 的方法对部分目标蛋白质的基 因表达进行m r n a 转录水平上的检测进行定量分析，为了解中小强 度有氧运动对心脏的影响，为深入研究国民体质健康的运动干预，也 为慢性心血管疾病的运动康复提供实验依据。 硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 研究对象和分组 2 0 只雄性s p r a g u e - d a w l e y 大鼠购于湖南农业大学实验动物部，2 月龄，体重为2 3 2 - - l 8 3 9 ，i i 级试验动物。室温2 0 - - , 2 4 。c ，相对湿度 4 5 - - - - 5 5 ，光照时间为7 ：0 0 - - 一1 9 - 0 0 ，按国家标准啮齿类动物饲料 分笼喂养，自由进食和饮水， 适应性喂养一周。2 0 只大鼠按体重配对随机分为运动组和对照 组，每组1 0 只。 2 2 实验动物建模方案 实验动物模型参考常芸的运动心脏动物模型n 钉。进行跑台适应性 训练5 天，运动强度分别为：第一天是1 0 x 1 0m m i n 1 、第二天是1 0 x 1 5 m m i n l 、第三天是1 8 x 1 5m m i n 一、第四天是2 1 x 2 0m m i n 、第五天 是2 4 x 2 0m m i n 1 ，此后运动组每天以速度为2 4 m m i n 1 训练4 0 分钟， 负荷强度相当于6 0 一- 7 0 v 0 2 m a x ，共训练8 周。整个运动过程中， 每周运动6 天，周六休息l 天。 2 3 仪器设备和试剂 2 3 1 仪器设备 p t 动物电动跑台( 购自杭州立泰科技有限公司) ，玻璃注射器及 注射针头，大剪刀，手术剪，眼科剪，镊子，玻璃分针，滤纸，碾钵， 不锈钢勺，e p 管，电子天平，自动取液器( 5 0u l ，1 0 0 u l ，2 0 0u l ， 8 周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 l m l ) ，冷冻离心机，7 2 2 分光光度计，解剖镜，i p g p h o r 等电聚焦电 泳系统( 购自a m e r s h a np h a r m a c i a 公司) ，聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直 平板电泳槽( 购自b i o - r a d 公司) ，脱色小摇床，循环水浴箱，图像扫 描仪( 购自中晶科技) ，u l g r a f l f l e x t o f t o f 质谱仪( 购自美 国布鲁克道尔顿公司) ，切胶仪和自动酶解仪( 均购自美国p e 公司) ， p c r ( 仪德国b i o m e t r a 公司) ，冷冻台式高速离心机，超净工作台 ( 上海智城分析仪器有限公司) ，t a n n o n 凝胶图像处理系统( 上海天 能科技有限公司) ，d y y - i o 三恒多用电泳仪( 北京六一厂) 。 2 3 2 试剂 b r a d f o r d 试剂盒，固相p h 梯度等电聚焦干胶条( i m m o b i l i z e dd r y s t r i pp h 3 - - 1 0l 、长度1 8 c m ，购自a m e r s h a m 公司) ，胰蛋白酶、 t e m e d 、i a a 、d t t 、硫脲购自s i g m a 公司；尿素、n p 一4 0 、载体两 性电解质( p a r m a l y t e3 - - 1 0 ) 、p m s f 、c h a p s 、s d s 、溴酚蓝、丙烯 酰胺、b i s 均为a m e r s h a mp h a r m a c i a 公司；硫代硫酸钠购自f l u k a 公 司；a p s 、标准蛋白混合物( p 一半乳糖苷酶l1 6 0k d a ，牛血清白蛋白 6 6 2k d a ，卵白蛋白4 5 0k d a ，乳酸脱氢酶3 5 0k d a ，r e a s e b s p 9 8 1 2 5 0 k d a ，p - 乳球蛋白1 8 4k d a ，溶解酵素1 4 4k d a ) 购白b i o r a d 公司；考马斯亮蓝g 2 5 0 、p 巯基乙醇、甘氨酸、乙腈、碳酸氢铵、 甲醇、硫酸铵、磷酸、乙酸、异丙醇、氯仿、冰乙酸、e d t a 来自国 产；r t 试剂盒( 购于f e r m e n t a sl i f es c i e n c e s ) ，d e p c 、e b 、t r i z o l 、 琼脂糖( 购于长沙丽欣生物公司) ，p c r 引物( 购于上海捷瑞生物工 程有限公司) 。 硕士学位论文 2 4 样品制备 2 4 1 取材 运动组于训练第8 周末次运动6 小时后与其平行对照组同时称 重，做麻醉处理后固定于手术板上，打开胸腔，暴露心脏，在主动脉 升部进行插管，用生理盐水对心脏进行灌流，待心脏颜色变淡后，迅 速摘取心脏放入4 0 c 生理盐水中进行冲洗，按心脏正常体位摆放，然 后在解剖镜下小心地剔除心包和心外膜，仔细辨认出冠状沟和前后室 间沟后，用小剪刀剪取冠状沟以下、前后室间沟以右部位的右心室肌 组织，用小剪刀剪碎后，置液氮中贮存备用。 2 4 2 称重 取材前用台式秤称取各周训练后两组大鼠( 实验和对照组) 的体 重；取材后，先用滤纸吸干心脏水分，后在电子天平上称心重。 2 4 3 蛋白提取 从液氮中取出右心室肌组织，放入碾钵中用液氮碾成粉末状，准 确称重后按质量与体积比1 ：4 ( m g ：l x l ) 加入组织裂解液( 8 m 0 1 l j u r e a ，4 c h a p s ，2m 0 1 l t h i o u r e a ，i n p 4 0 ，6 5 mm 0 1 l d t t ， o 5 mm 0 1 l p m s f ，0 5 ( v a v ) p h a r m a l a t e ( p h 3 - 1 0 ) ，4 c 振匀3 0 m i n ， 使组织充分裂解后，组织悬液1 2 0 0 0 r m i n ，4 c 离心3 0 m i n ，取出样 品，小心的避开上层漂浮的脂质层，吸取上清液后，组内合并上清。 用b r a d f o r d 法对样品进行蛋白定量，依蛋白浓度按每管约l m g 分装 后，8 0 。c 超低温冰箱中保存待用。 2 4 4 蛋白含量测定 8 周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 用b r a d f o r d 法对样品蛋白含量进行定量，测得对照组蛋白质含量 为3 1 6 5 l _ t g 山，运动组蛋白含量为3 2 1 3 1 x g p l 。样品每管l m g 分装后， 8 0 。c 冰箱保存待用。 2 5 固相p h 梯度一s d s 双向凝胶电泳方法与图像分析 主要参考g o r g 等1 1 的方法和i p g h o r t m 等电聚焦系统操作指南 进行。具体操作步骤如下： 2 5 1 试剂配制 水化液：u r e a l 2 9 ( 终浓度为8m 0 1 l 。) ，c h a p so 5 9 ，i p g b u f f e r ( p h 3 0 - - 一1 0 0l ) 5 0 0 此，1 的溴酚蓝5 0 皿，加双蒸水至2 5 m l 。 每管7 5 0 止分装后，2 0 。c 保存。 平衡储液：t r i s h c l 缓冲液( p h6 8 ) 1 0 m l ，u r e a3 6 9 ，甘油3 0 m l ， s d sl g ，加双蒸水定容至1 0 0 m l ，避光保存。 平衡液a ：取平衡储液2 0 m l ，) j n ad t t4 0 m g 。 平衡液b ：取平衡储液2 0 m l ，加入碘代乙酰胺6 0 0 r a g 。 3 0 凝胶储液：丙烯酰胺( a r c ) 7 3 9 ，甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 2 9 ，加双蒸水定容至2 5 0 m l ，避光保存。 分离胶b u f f e r ：t r i s h c l 缓冲液( p h8 8 ) 4 5 4 2 7 5 m l ，s d slg ， 加双蒸水定容至2 5 0m l 。 浓缩胶b u f f e r ：t r i s h c l 缓冲液( p h6 8 ) 6 0 5 7 m l ，s d slg ，加 双蒸水定容至1 0 0m l 。 8 分离胶( 7 0 m 1 ) ：3 0 凝胶储液1 8 7 m l ，分离胶b u f f e r l 7 5 m l ， 双蒸水3 3 8 m l ，1 0 过硫酸铵( a p s ) 2 0 0 “l ，t e m e d5 0 此。 7 硕士学位论文 4 8 浓缩胶( 8 r r d ) ：3 0 凝胶储液1 2 8n l l ，浓缩胶b u f f e r2m l ， 双蒸水4 6 6 4m l ，1 0 过硫酸铵( a p s ) 4 8 l al ，t e m e d8ul 。 电极缓冲液：t r i s9 9 ，s d s3 9 ，甘氨酸4 3 2 9 ，双蒸水定容至3 l 。 o 5 琼脂糖溶液：低熔点琼脂糖o 5 9 ，加电极缓冲液定容至 1 0 0 1 1 1 1 。 考马斯亮蓝g 2 5 0 染色溶液： ( 1 ) 固定液：乙酸6 0 m l ，甲醇2 4 0 m l ，加双蒸水定容至6 0 0 m l 。 ( 2 ) 染色液：硫酸铵6 0 9 ，考马斯亮蓝g 一2 5 00 7 2 9 ，磷酸6 9 6 m l ， 甲醇1 2 0 m l ( 用时再加入甲醇) ，加双蒸水定容至6 0 0 m l 。 2 5 2 固相p h 梯度等电聚焦( 第一向) 具体操作步骤如下： ( 1 ) 用酒精清洗i p gp h o r 等电聚焦仪的平板电极，除去覆盖液及 氧化层，自然晾干或吹干。 ( 2 ) 准备胶条盒：用专用洗涤剂清洗胶条盒，用水冲洗干净后， 再用双蒸水漂洗，然后用滤纸吸干，用电吹风将水分充分吹干。 ( 3 ) 取事先配制好的，储存于2 0 。c 的水化液7 5 0 9 l ，室温下溶解； 取出干胶条，在室温下平衡半小时后使用。 ( 4 ) 准备d t t 水化液：在称好的2 m gd t t 中加入7 0 0 9 l 水化液， 充分混匀后，12 0 0 0 r m i n 。1 离心5 m i n ，以除去不溶物。 ( 5 ) 准备样品液：取出事先分装好的样品液a ( 实验组) a n 样品液b ( 对照组) ，每管加入准备好的水化液，至总体积为3 5 0 9 l ，振荡混匀， 样品管1 2 0 0 0r m i n 。离心1 0 m i n 。 8 周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 ( 6 ) 把胶条盒放在i p g p h o r 的平板电极上，将处理好的样品均匀 地加入到胶盒中，取平衡好的胶条，揭去干胶条的保护膜，胶面向下 放入胶条盒中，胶条的酸性端接触胶条盒的正极，然后慢慢的后压， 把胶条放入胶条盒中，防止胶条与样品液之间出现气泡，并与胶条盒 的电极紧密接触，来回慢慢的拖动胶条，使样品在胶条盒中均匀分布， 加上覆盖油，盖上胶条盒盖。最后检查胶条盒下端的电极是否与i p g p h o r 的平板电极接触紧密。 ( 7 ) 设置程序：按i p gp h o r 操作说明连接电源，并按以下程序设 置水化及聚焦有关参数： 2 5 3 平衡 ( 1 ) 配制胶条平衡缓冲液a ( 平衡储液2 0 m l ，用时现加d t t 4 0 m g ， d t t 的主要作用是打开蛋白质的二硫键) 。 ( 2 ) 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的 厚滤纸上，将另一份厚滤纸用m i l l i q 水浸湿，挤去多余水分，然后 直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这可以减少 凝胶染色时出现的纵条纹。 ( 3 ) 将胶条转移至平衡管中，每根管中放一根胶条( 标记好对应 的组别) ，在有胶条的平衡管中加入1 0 m l 胶条平衡缓冲液a ，将平 衡管放在水平摇床上缓慢摇晃1 5 r a i n ，注意1 5 m i n 要精确。平衡时间 o 硕士学位论文 过短，会出现高分子量蛋白纹理现象，时间过长会导致蛋白质的丢失。 ( 4 ) 配制胶条平衡缓冲液b ( 平衡储液2 0 m l ，现用时加碘代乙酰胺 6 0 0 m g ，i a a 的主要作用是封闭蛋白质的二硫键) 。在平衡液b 中加 入碘乙酰胺，可以排除非蛋白相关点的纹理现象。 ( 5 ) 第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡管中的胶条平衡缓冲液a ， 并用滤纸吸干多余的平衡液a ( 将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或 损坏凝胶表面) 。再加入胶条平衡缓冲液b ，继续在水平摇床上缓慢 摇晃1 5 m i n ，注意1 5 m i n 要精确。 2 5 4 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) ( 第二向) 平衡后的胶条进行第二向电泳。具体操作步骤如下： ( 1 ) 清洗、干燥并安装玻璃板。 ( 2 ) 灌胶及凝胶：将配置好的已抽气的8 的分离胶用玻璃棒引 流，沿长玻璃板的内面缓缓倒入，胶液面距玻璃板上缘约4 - - 5 c m 时 停止，轻轻在胶面上加上一层约0 5 c m 厚的用水饱和的正丁醇，以隔 绝空气，并使胶面平整。约3 0 - 4 0 m i n 后，当正丁醇和凝胶面出现明 显界面时，即表示凝胶已经聚合完全。用注射器将正丁醇吸掉，并以 滤纸吸干多余液体，用双蒸水冲洗几次胶面。然后沿玻璃夹缝加入己 抽气的浓缩胶。当浓缩胶加到距短玻璃板上缘l c m 处停止，轻轻覆 盖一层用水饱和的正丁醇，等待聚合。 ( 3 ) 浓缩胶完全聚合后，吸掉胶面覆盖的正丁醇，用双蒸水冲洗 胶面数次，用滤纸吸干水分。 ( 4 ) 用滤纸吸去s d s p a g e 聚丙烯酸胺凝胶上方玻璃板间多余的 8 周有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异表达的影响 液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板 朝上，凝胶顶部对自己。将琼脂糖进行加热熔化，并把m a r k e r 用开 水煮沸5 分钟。将煮沸的m a r k e r 用专用滤纸吸附后，从两玻璃板的 最左侧加入，靠近隔条并紧贴胶面。 ( 5 ) 将i p g 胶条从样品平衡管中移出，用镊子夹住胶条的一端使 胶面完全浸没在电泳缓冲液中，然后将胶面朝上放在凝胶的长玻璃板 上。在凝胶的上方先加入一层低熔点琼脂糖，琼脂糖的温度不能太高， 热的琼脂糖会加速平衡缓冲液中尿素的分解。 ( 6 ) 用镊子、压舌板或是平针的针头，轻轻将胶条向下推，使之 与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，注意不要在胶条下方产生任何气 泡，在用镊子、压舌板或是平针的针头推胶条时，要注意推动胶条背 面的支撑塑料片，不要碰到胶面。然后在胶的上端封上一层琼脂糖。 ( 7 ) 放置5 m i n ，使低熔点琼脂糖彻底凝固。 ( 8 ) 琼脂糖凝固后，取下胶架，装进电泳系统，并将电泳系统放 入电泳槽中，加入适量的电极缓冲液，赶尽气泡，以保证电流的畅通， 加满上槽液，盖好电泳槽盖，接好冷凝管( 调1 0 ) ，设置参数，进 行电泳。 ( 9 ) 电泳：开启电源，设置电泳程序。( 恒流：浓缩胶2 5 m a ；分 离胶5 0 m a ) 待溴酚蓝迁移至距末端1 c m 时，停止电泳，关闭电源。 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角做记号。 2 5 5 剥胶、染色 ( 1 ) 取下凝胶置固定液中振摇1 h 。 硕士学位论文 ( 2 ) 小心地倒掉固定液，用双蒸水漂洗4 次，每次1 5 m i n 。 ( 3 ) 倒掉双蒸水，加入染色液，振摇过夜。 ( 4 ) 倒掉染色液，用双蒸水漂洗，直到背景比较干净为止。 2 5 6 图像扫描与分析 运用清华紫光d 3 0 0 0 图像扫描仪透射扫描凝胶。所得图谱借助 图像分析软件b i o r a dp d q u e s t 进行详细分析、比较蛋白质斑点差异。 蛋白质分子的等电点和分子质量根据m a r k e r 和i p g 胶条p h 标识范 围和标准蛋白质用软件自动计算。对照组和实验组各重复电泳三次， 都选取第一张胶为参考胶进行匹配。以对照组心房肌的蛋白质2 - d e 代表图谱作为参考胶进行软件分析。 2 6 质谱分析 2 6 1 切胶、酶解 切割差异蛋白点，置于1 5m le p p e n d o r