（微生物学专业论文）产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定.pdf

山东农业大学硬士学位论文符号及缩略词说明英文缩写英文名称中文名称a m pa m p i c i l f m氨苄青霉素b pb a s e i r碱基对丑s “b t i l i sb a c i l l u ss u b t i l i s枯草芽孢杆菌d d h 2 0d f pd n ae be d t aec o l ie l i s al bn kp ap a g ep c rp f g ep m s fp 队p r o - u kr e ar p ms a ks d ss ks o dt et e m 瞳dd i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e rd i i s o p r o p y lf l u o r o p h o s p h a t e sd e o x y r i b o n u e l e i ea d de t h i d i u mb r o m i d ee t h y l e n ed i 锄i 蕾c 缸雹蛇e t i ca c i de s c h e r i c h i ac o l ie n z y m e - l i n k e di m m t m o s o r b e n ta s s a yl u r i a - b e a a n im e d i u mn a t t o k i n a s ep l a s m i n o g e na c t i v a t o rp o l y a e r y l a m i d eg e le l e e l x o p h o r e s i sp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np u l s c d - f i d dg e le l e c f f o p h o r e s i sp h e n y lm e t h a n es u l f o n y lf l u o r i d ep l a s m i dp r o f i l ep a t t e r na n a l y s i sp r o u r o k i n a s er e v o l u t i o n sp e rm i n u t er e s t r i c t i o ne n z y m ea n a l y s i ss t a p h y l o k i n a s es o d i u md o d e e y ls u l f a t es t r e p t o k i n a s es u p c r o x i d ed i s n l u c a s et r i s - h c l ，e d t ab u f f e rt e t r am e t h y le t h y l e n ed i a m i n e重蒸水二异丙基氟磷酸盐脱氧核糖核酸溴化乙锭乙二胺四乙酸大肠杆菌酶联免疫吸附l b 培养基纳豆激酶，纤溶酶原激活剂聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶链式反应脉冲场凝胶电泳苯甲基磺酰氟质粒图谱分析尿激酶原制性核酸内切酶分析法辕| 分钟葡激酶十二烷基硫酸钠链激酶超氧化物歧化酶r i f f s h c i ，e d t a 缓冲液四甲基乙二胺一主苎皇堂堕堂堕堕堡堕坌塑塑墨皇鳖塞t - p at i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r组织型纤溶酶原激活剂u ku r o k i n a s e尿激酶u p au r o k i n a s ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r尿激酶型纤溶酶原激活剂a 2 一a pa 2 - a n t i p l a s m i n砣抗纤溶酶1 - p g a1 , - p o l yg l u t a m i ca c i d1 , - 多聚谷氨酸6关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：日期：盟登删一盟趔山东农业大学硕士学位论文摘要血栓性疾病严重危害人类的健康和生命，对个人、家庭和社会都造成了巨大的物质和精神损失。但目前临床治疗血栓性疾病最常用的溶栓剂却不尽如人意：或特异性差有严重副作用；或作用时间短、溶栓能力弱，需长时间、大剂量使用；或者生产不易，物稀价昂。纳豆( n a t t o ) 在日本是一种历史悠久的传统食品，系由蒸煮后的大豆接种纳豆芽孢杆菌发酵制得。纳豆芽孢杆菌在发酵过程中产生的纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n k ) 是一种具有强烈纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶。与传统溶栓剂相比纳豆激酶具有纤溶作用强，药效时间长，可通过静脉与口服两种途径给药以及不引起出血的副作用等优点，使其具有开发成新一代溶栓药以及新型保健产品的潜力。本研究从五株出发菌株中分离筛选出纳豆芽孢杆菌并进行发酵培养，通过发酵产物的纤溶活性测定纳豆激酶的酶活，筛选出一株产酶活力较高，酶活稳定的菌株n 3 9 1 。主要结论如下：l 对能产生纳豆激酶的菌群进行了筛选，经纤维蛋白平板复筛多次，分离得到了2 4 株高纤溶活性有效菌株，经鉴定均为革兰氏阳性细菌，其纳豆激酶相当于尿激酶的酶活均大于1 0 0 0u m l2 经过遗传稳定性实验以及纳豆固体发酵感官评价最终得到菌株n 3 9 1 ，其纳豆激酶相当于1 7 2 2 4u m l 尿激酶酶活。3 对分离得到的菌株n 3 9 1 进行常规的形态、生理生化特征以及与枯草芽孢杆菌的比较，初步判断该菌株为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l e )4 利用细菌1 6 sr d n a 通用引物对其1 6 sr r n a 进行p c r 扩增，得到1 5 1 1 b p 的片段，该p c r 产物序列通过b l a s t 软件在n c b i 网站中进行同源性比较，通过d n a m a n 和m a g e 3 1 软件绘制系统发育树，结果表明：菌株n 3 9 1 的1 6 sr r n a 序列( d q 9 0 6 1 0 0 ) 与枯草芽胞杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s )的1 6 sr r n a 序列的同源性在9 9 以上，在系统发育树中，菌株n 3 9 1 与b a c i l l u ss u b t i l i s 在同一分支，且遗传距离最短。结合常规的形态、生理生化鉴定，n 3 9 1 的形态及大部分生理生化特征与b a c i l l u ss u b t i l i s 极为相似，表明菌株n 3 9 1 属于b a c i l l u ss u b f f l i s 的一个菌株，由此初步确定该菌在微生物系统发育学上的地位。产纳豆激酶激酶菌株的分离筛选与鉴定关键词纳豆，纳豆激酶，筛选，1 6 5r d n a ，鉴定，枯草芽孢杆菌2山东农业大学硕士学位论文a b s t r a c tt h r o m b u sd i s e a s es e v e r e l yt h r e a t e n st h el i f ea n dh e a l t ho fh u m a nb e i n g sa n dc a l l s e se n o r n l o u sm a t e r i a la n dm e n t a ll o s s e st 0i n d i v i d u a l s ，f a m i l i e sa n dt h es o c i e t y i o w e v t h r o m b o l y t i c s ，w h i c hi sm o s tc o m m o n l yu s e dt oc u r et h r o m b u s ，d o e sn o tw o r km f i s f a c t o f i l y ，d u et 0s e r i o u ss i d ee f f e c t ，s h o r t 砌n gt i m e ，i n s u f f i c i e n tt h r o m b o l y t i ca c t i v i t ya n dd i f f i c u l t i e si np r e p a r a t i o n t h u st h et h r o m b o l y t i e si se x p e n s i v ea n dr e q u i r e sal a r g ed o s et a k e ni nal o n gt i m e n a t t o ak i n do ft r a d i t i o n a lf o o di nj a p a n , i sm a d eb yf e r m e n t i n gb o i l e ds o y b e a ni n o c u l a t e dw i t hb a c i l l u ss u b t i l i s n a t t o k i n a s ei sa na l k a l i n es e r i n ep r o t e a s ep r o d u c e db yb a c i l l u ss u b t i l i sd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w h i c hh a sah i g ht h r o m b o l y t i ea c t i v i t ya n dl o n ga c t i n gt i m e i tc a nb ea d m i n i s t e r e do r a l l yo rt h r o u g hi n t r a v e n o u s 埘e c t i o n , a n dc a u s e sn os i d ee f f e c ts u c ha sb l e e d i n g t h em e r i t sa b o v em a k en a t t o k i n a s eap r o s p e c t i v es o b s t i m t eo ft h r o m b o l y t i c sa n dn e wh e a l t hp r o d u c t i no u rs t u d y , s l r a i nn 3 9 1w i t hh i g hn a t t o k i n a s ep r o d d i n ga c t i v i t ya n ds t a b l ee n z y m a t i ca c t i v i t y , w a si s o l a t e af r o mf i v es t a r t i n gs t r a i n so fb a c i l l u ss u b t i l i st h r o u g hf e r m e n t a t i o na n dn a t t o k i n a s ea c t i v i t ya s s a yo f t h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t s w ed r a wt h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ：1 a r e rp r i m a r ys c r e e n i n gf o rt h en a t t o k i n a s ep r o d u c i n gs l z a i na n dr e p e t i t i o u ss e c o n d a r ys c r e e n i n go nf i b r i np l a t e ，2 4s t r a i n sw i t hh i g hn a t t o k i n a s ep r o d u c i n ga c t i v i t yw e r ei s o l a t e d t h e ya r ei d e n t i f i e da sg r a mp o s i t i v ea n dt h en a t t o k i n a s ea c t i v i t ya r ea l la b o v e1 0 0 0 ij 如i “u s i n gs t a n d a r dc u r v eo f u r o k i n a s ea c t i v i t y 2 s t r a i nn 3 9 1w a so b t a i n e dv i ag a n c t i es t a b i l i t yt e s ta n do r g a n o l e p t i ce v a l u a t i o no fn a t t os o l i df e r m e n t a t i o n i t sn a t t o k i n a s ea c t i v i t yi se q u i v a l e n tt o1 7 2 2 4 u m lu r o k i n a s ea c t i v i t y 3 r o u t i n et e s t so fn 3 9 1 ，i n c l u d i n gm o r p h o l o g y , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a n dc o m p a r i s o nw i t hb a c i l l u ss u b t i l i s ，p r e l i m i n a r i l ys u g g e s tt h a ts t r a i nn 3 9 1i sb a c i l l u ss u b t i l i s 4 a1 5 1 1 b pf r a g m e n to f1 6 sr i b o s o m a lr n aw a so b t a i n e df r o mt o t a l3产纳豆激酶激酶菌株的分离筛选与鉴定d n ao fs u a i nn 3 9 1b yp c ra m p l i f i c a t i o n , u s i i 坞t h eu n i v e r s a lp r i m e ro fb a c t e r i a l1 6 sr i b o s o m ed n a s e q u e n c ea n a l y s i sw a sc a r r i e do u tb yb l a s to nn c b lw e b s i t ea n dt h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e db yd n am a na n dm 回g a 3 1s o f t w a r e 耶1 er e s u l t ss h o wt h a tn 3 9 1s h a r e d9 9 6 0 1 6 sr i b o s o m a lr n as e q u e n c eh o m o l o g yw i t hb a c i l l u ss u b t i l i s ( a b 0 6 5 3 7 0 ) s t r a i nn 3 9 1a n db a c i l l u ss u b t i l i sw e r ei nt h e $ a n l eb r a n c ho ft h ep h y l o g e n e t i ct r e ea n dt h e i rg e n e t i cd i s t a n c ew a st h es h o r t e s t c o m b i n i n gt h es i m i l a r i t yo fm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，s t r a i nn 3 9 1w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss u b t i l i s ，a n dt h ep o s i t i o no f t h es t r a i ni nm i c r o b i o l o g i c a lp h y l o g e n yw a ss e tu p k e yw o r d s ：n a t t o ，n a t t o k i n a s e ，s c r e e n i n g ，1 6 sr d n a ，i d e n t i f i c a t i o n ，b a c i l l u ss u b t i l i s4山东农业大学硕士学位论文1 引言1 1 关于纳豆( h a l o )1 1 1 纳豆的历史日本关于纳豆的历史相当久远，据民间的传说，在绳文时代的末期( 约2 3 0 0 年前) ，大豆由中国进入日本。根据历史文献记载，公元7 5 3 年中国唐代高僧鉴真和尚东渡日本传经时，在其东征传一书里记载着他带着甜豆豉三十石到日本，这种甜豆豉可能是日本纳豆的前身。在日本有关纳豆的记录是公元1 2 8 6 年，有一个叫藤原明衡的人写了一本叫新猿乐记的书，书中第一次出现了“纳豆”二字，按书中的记载，纳豆就是“纳所之豆”，纳所指的是寺庙的厨房，所以纳豆也被称为“寺纳豆”。他们将大豆煮熟后，使用稻草包起来( 称为苞) ，使其保持一定的湿度，由于稻草上生长的细菌等微生物起了作用，充分发酵后便成为带有黏性物质与独特气味的大豆发酵食品。而为一般民众的普及食品则始于公元1 6 0 0 年左右的江户时代( 李平兰，2 0 0 5 ) ，由于其味道鲜美，保存性良好，经过不断完善终于形成今天的纳豆。在我国，豆豉在汉朝的史记中即有记载。很多人认为纳豆就是豆豉，严格的地讲，纳豆是我国细菌型豆豉的孪生姐妹，因为，我国的豆豉可分为霉菌型豆豉和细菌型豆豉两大类。霉菌型豆豉中有根霉型豆豉、米曲霉型豆豉及毛霉型豆豉。细菌型豆豉是利用枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss 曲饼妇) 在较高温度下，繁殖于蒸熟大豆上，借助其较强的蛋白酶生产出风味独特、具有特异功能的食品，其最大特点是产生粘性物质，并可拉丝。1 1 2 纳豆的制作工艺纳豆的传统制作方法是将精选的黄豆浸泡煮熟，然后用稻草包扎起来，维持一定的温湿度，培养l 2 d 。发酵过程中，豆粒会被一种粘稠状的聚合物所覆盖，这种粘稠状的物质能拉成细长丝。通过对纳豆黏液中水分、蛋白质、氨基氮、还原糖、水溶性总糖、多糖含量的分析与测定可知，纳豆黏液中主要的营养物质为蛋白质和糖类物质，糖类物质中多糖为主要成分( 周建平等，2 0 0 3 ) 。现已发展成为纯培养接种、以现代工艺为基础的生产方法。纳豆的发7产纳豆激酶激酶菌株的分离缔选与鉴定酵生产一般工艺流程为：精选的大豆流水浸泡1 4 h 浸泡大豆蒸煮( 1 3 0 c 、5 5 r a i n ) 一蒸煮大豆接种发酵( 3 8 、l l h ，湿度8 5 ) 一发酵纳豆保热( 5 、l d ) 一成熟纳豆。1 1 3 纳豆的营养价值纳豆的原料是大豆，大豆本身就是含高蛋白和人体必不可少的8 种氨基酸的营养食品，而纳豆则比没发酵的大豆更具营养价值，见表1 - 1 ，1 - 2 。纳豆富含氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的营养成分，同时还含有多种生理活性物质，如纳豆激酶、超氧化物歧化酶、异黄酮、皂苷素、生育酚、维生素( 维生素b 2 高出蒸煮大豆六倍以上，维生素k 是煮鸡蛋的2 0 倍) 等。因此大豆加工成纳豆后营养价值倍增。纳豆的维生素a和维生素c 的含量几乎为零，但和其他食品一起吃可以补充纳豆这方面的缺陷。自古以来，纳豆在民间一直作为药食兼用食品( 齐凤兰等，2 0 0 4 ) 。表l - 1 纳豆中的营养成分t a b l e l - in u t r i t i o nc o m p o s i t i o no f n a t t o注：每1 0 0 9 食品可食部分的营养含量8山东农业大学硕士学位论文表1 2 纳豆中的氨基酸含量t a b l e l - 2t h e a m i n oa c i dc o n t e n to f n a t t o氨基酸是组成蛋白质的单位，它们在人体的生理调节上起着非常重要的作用。从表2 可以看出，纳豆中含有1 8 种氨基酸，其中有8 种是人体必需的氨基酸。经过发酵的纳豆，不仅可以保持大豆必需氨基酸含量，而且可使大豆的消化率提高。据报道，纳豆芽孢杆菌发酵大豆后，在蛋白酶的作用下，促进了蛋白质的水解。有5 0 6 0 的大豆蛋白转化为肽和氨基酸。在人体中，任何一种必需氨基酸含量不足都会影响其它氨基酸的充分利用。按照人体的需要，比例关系相对不足的氨基酸为限制性氨基酸，在食物中最主要的限制性氨基酸是蛋氨酸和赖氨酸，而纳豆中这两种氨基9产纳豆激酶激酶菌株的分离筛选与鉴定酸的含量分别占总氨基酸的1 3 5 和6 3 4 。氨基酸除了具有营养功能外，还具有里味和增加纳豆特色的作用。其中纳豆中的谷氨酸有3 2 7 m g g ，占氨基酸总量的2 0 1 4 。纳豆中的谷氨酸经聚合后生成纳豆所特有的粘丝中最主要的的成分十多聚谷氨酸( 齐风兰等，2 0 0 4 ) 。1 1 4 纳豆的保健功能作用1 1 4 1 溶血栓1 9 8 7 年，日本富崎医科大学须见洋行等( s u m ih ，e t a l ，1 9 9 0 ) 首先发现纳豆激酶( n a t t o k i n a s e ，n k ) 提取的纳豆激酶应用于狗的血栓作用，证明是一种有纤溶活性的酶制剂，所以定名为纳豆激酶。其活性为每克湿纳豆含有相当于现在临床使用的尿激酶1 6 0 0i u 。若临床上治疗血栓病一次使用2 0 0 0 0 01 u ，与食用一盒湿纳豆具有同等功效。随之将提取出的纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验，及健康人群的体内研究，证明除具有直接的溶栓作用外，同时发现纳豆溶纤酶还能将纤维蛋白溶酶原、尿激酶原激活成纤维蛋白溶酶和尿激酶，激活内源t p a 的产生，促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂，从而表现出f 刚妾的溶栓效果。人体实验表明，纳豆溶纤酶可明显缩短优球蛋白溶解时间、增加血栓溶解面积和血栓分解产物。此酶作用可维持在2 8 h ，表现出较长的酶作用时闻，有利于临床应用。目前常用及有待开发的治疗血栓病的药品有( 付正纲等，2 0 0 5 ) ：链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) 、尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) 、组织型纤溶酶原激活剂( t i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ，t - p a ) 和尿激酶原( p r o u r o k i n a s e ，p r o - u k ) 等，但它们均在不同程度上存在一定的缺陷，如毒性强、副作用大；在体内溶栓特异性不高、半衰期短：来源紧缺、价格昂贵；应用范围有限，推广受到严重制约，而n k 有望弥补这些不足，具有较大的开发潜能，成为新一代抗栓药物( f u j i t am ，e ta l ，1 9 9 5 ) n k 做溶血栓药物具有以下优点：纳豆菌被f d a 认证为食品工业的安全性细菌；n k 分子量小，更易为人体吸收( f u j i t am ，e ta l ，1 9 9 3 ) ：可以由消化道吸收，因此可以成为第一个口服性溶血栓药物( f u j i t a m ，e t a l ，1 9 9 5 ) ；直接作用于纤维蛋白，且作用迅速；可以利用细菌发酵生产，因此造价低廉，有望开发为一种安全的食用血栓预防剂。1 0山东农业大学硕士学位论文1 1 4 2 降血压纳豆周围的粘往物质中有血管紧张肤转化酶抑制剂，这种抑制剂分为水溶性和醇溶性两种，其中水溶性抑制剂为高分子量的蛋白质，抑制5 0 酵素活性所需要的药物浓度( i c 5 0 ) 为1 2r a g m e ；酵溶性抑制剂为低分子量物质，具有两种形态，抑制作用强于水溶性抑制剂，i c 5 0 分别为o 5 3r a g m e 和o 9 5m g m l ，其p h 和温度稳定性都很好。这两种形态的醇溶性抑制剂的抑制模型是不同的，一种是竞争性抑制，一种是非竞争性抑制。1 9 7 7 年，帝国女子大学营养学教授林的研究小组在2 0 年前就进行了纳豆预防高血压的实验。他们使有遗传性高血压的老鼠每天摄入纳豆，与摄入等量大豆的老鼠作为对照。其结果是，食用大豆的鼠血压逐渐升高，4 月内平均波动达到0 0 3 3m p a ；而食用纳豆的鼠血压4 个月内波动最高值达到0 0 2 7m p a ( 须见洋行等，1 9 9 0 ) 。1 1 4 3 杀菌、纳豆可产生许多抗菌素，如杆菌肽、多黏菌素、2 ，6 吡啶二羧酸等，这些物质对痢疾杆菌、原发性大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l d0 1 5 7 、ec o l i0 1 1 1 、ec o l i 0 1 4 4 、伤寒菌、沙门氏菌等，都有强烈的抑制作用。1 9 8 3年，日本学者小泽恭辅通过一系列实验证实，食用纳豆后，其纳豆芽胞的活体能在肠道内增殖，并且对病原性ec o l i0 1 5 7 和沙门氏菌有抗菌作用。同时发现纳豆菌可抑制不同血清型的ec o l i0 1 1 1 、ec o l i0 1 4 4 等致病性大肠杆菌。另外，小泽恭辅又将ec o l i0 1 5 7 和纳豆菌混合在一起培养，结果发现在培养瓶的纳豆菌长得很好，并且明显地抑制了ec o l i0 1 5 7 的增殖。其后，至培养时间进行到第4d 时候，ec o l i0 1 5 7 就形迹全无了。由此证明，纳豆菌能杀灭ec o l io - 1 5 7 ，亦即纳豆可以防治ec o l i0 1 5 7所引起的疾病，与日本民间常年用以治病的效果相互一致。同时国内学者钟青萍等人研究了纳豆菌对常见的污染食品微生物的拮抗作用，结果表明纳豆菌具有广谱抗菌作用，对细菌、酵母菌和霉菌都有拮抗作用。同时纳豆菌对大肠杆菌也同样有效( 钟青萍，2 0 0 1 ) 。1 1 4 4 抗氧化纳豆中含有的抗氧化物质，如卵磷脂、异黄酮、舡生育酚( v t ) 、超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 。其中卵磷脂经常食用可有产纳豆激酶激酶菌株的分离筛选与鉴定效降低血脂、胆固醇及清除脑组织细胞中过氧化脂质色素，调节皮肤细胞和皮肤表面水和脂肪的平衡。另外，纳豆对由过氧化物所引起的细胞伤害也有疗效。并且无论是对不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸，还是对受伤细胞，纳豆的抗氧化作用都等同于甚至好过小生育酚的效果。1 1 4 5 调整肠功能促进消化大豆中约有2 8 碳水化合物，其中2 3 是半纤维素、纤维素和木质素等食物纤维。这些食物纤维在食用后可防止便秘、预防大肠癌和直肠癌、还可起到防止甘油三酯的增加和降低血清胆固醇等效果。大豆经过纳豆菌发酵积蓄了大量的酶，如蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶和纳豆激酶等酶系，这些生物酶在消化系统中作为消化酶能够有效地发挥作用，因此有助于消化吸收。另外，食用纳豆后，纳豆菌在肠中发芽增殖，作为营养物质能在肠内生活几周，分泌各种酶和维生素，促进小肠粘膜细胞的增殖，同时纳豆中的纤维素类物质可以与寡藉耦合，从而促进双歧杆菌增殖，对肠道菌群的微生态平衡起重要调节作用，保证肠功能的正常。1 1 4 6 其他功能经纳豆菌发酵后的大豆含有丰富的维生素k 2 ，因骨质疏松而骨折的人恰恰是血液中维生素k 2 的含量过低。维生素k 2 可协助生成骨蛋白质，这种骨蛋白质能与钙共同生成骨质，增加骨密度从而有效地防止骨质疏松症。日本医生在研究中发现纳豆不仅能减缓小肠对糖分的吸收，而且还能防止食后血糖迅速上升。纳豆中含有氨基酸诱导体的有效成分能使小肠中的洳葡萄糖苷酶的活力下降，从而使人体食入的淀粉和蔗糖由消化酶生成的单糖减少，所以只能吸收单糖的小肠无法快速吸收糖分，从而起到防治糖尿病的作用。除上述功能外，因为纳豆含有丰富的亚油酸、亚麻酸、植物雌激素、异黄酮、卵磷脂等，因此还具有抗衰老、美容护肤、健脑、提高记忆力、减肥等健康保健功能。1 2 关于纳豆激酶1 9 8 7 年，日本人须见洋行等首先发现纳豆中含有一种高纤溶活性的酶( s t m l ih ，e t a l ，1 9 8 7 ) ，可治疗和预防血栓病，并可激活体内的纤溶酶山东农业大学硕士学位论文原，从而增加内源性纤溶酶的量与作用，于是将其命名为纳豆激酶( 【) 。纳豆激酶是在纳豆发酵过程中由丑s u b 鼢产生的一种枯草杆菌蛋白激酶，属丝氨酸蛋白酶( 周新萍等，2 0 0 5 ) 。它主要存在于纳豆的粘稠物中，活性大小与菌株及发酵过程有很大关联( y o 幽k a my u k i ，e ta l ，1 9 9 4 ) 。纳豆的粘稠物是纳豆菌作用大豆后产生的果糖和巾多聚谷氨酸( 7 - p o l yg l u t a r a i c a c i d ，p g a ) 的混合物。其中p g a 是粘性物质的主要成分。纳豆激酶具有引人注目的强烈的纤溶活性。用纤维蛋白平板测定，结果显示，每克湿重纳豆约相当于1 6 0 0u 尿激酶或者4 0u 纤溶酶。在体内外，n k 都有明显的溶栓活性。在纤维蛋白平板上滴加酶提取液，短时间内( 1 7 t 8 h )即可出现清楚的溶圈。通过动物血栓模型研究，发现n k 不仅可抑制血栓形成，同时还有很强的溶栓作用，并在一定范围内呈量效关系，即酶活性越大，溶解圈越大。在小鼠颈总动脉中注射醋酸引起血栓，当静脉注射相同浓度的n k 、纤溶酶和弹性蛋白酶，颈总动脉恢复率分别为6 2 5 3 、1 5 8 0 7 、o 。可见n k 的溶栓效果远大于纤溶酶和弹性蛋白酶。同时，n k 抗胰酶水解，因此，不仅可静脉注射，而且口服效果也好。给狗服用4粒n k 胶囊或熟大豆，测定其血浆纤溶活性的实验表明，对照组服用熟大豆1 8 h 后没有出现血栓溶解，丽实验组服用n k 后5 h 内血栓完全溶解，血液循环完全恢复( 宋纲等，1 9 9 9 ：n a k a m u r a t ，e t a l ，1 9 9 2 ) 。对鼠十二指肠给药，发现n k 可以被鼠的消化道吸收，并在鼠的体内产生溶栓效应。用其它动物实验也表现出相似的溶栓效果。人口服n k 的实验，同样表现出良好的溶栓效果，并且口服n k 后优球蛋白的纤溶活性( e p a ) 和纤维蛋白降解产物( f d p ) 迅速升商，表明纤维蛋白迅速降解，还发现组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂( t - p a ) 的量不断增加，表明n k 不但能直接作用于纤维蛋白，而且还能激活体内的纤溶酶原。另有实验证明，n k 的纤维蛋白原水解活性远远低于纤溶酶和弹性蛋白酶，甚至u k ，而与t - p a 基本相同。这揭示n k 在发挥纤溶作用的同时，不水解血浆纤维蛋白质，不易引起出血倾向( 付俐等，1 9 9 5 ：f u j i t a m ，e t 耐，1 9 9 3 ) 。与传统溶栓剂比较，n k 可通过食品发酵或液体发酵获得，成本低，安全可靠。它分子量小，在p m 0 ，粗酶液仍有一定活性，可通过消化道直接吸收。因此，n k 作为一种新型的口服性溶栓药物，具有更多的优点，有广阔的开发前景。产纳豆撤酶激酶菌株的分离筛选与鉴定1 2 1 纳豆激酶的性质实验结果表明，n k 的最适温度为3 7 ，温度对酶稳定性影响显著；p h 的最适作用为7 4 ，在6 8 范围内酶活相对稳定；乙二胺四乙酸( e t l i y l c n e血啪矗壕戗跚删c a c i d ，e d t a ) 和苯甲基磺酰氟( p h e n y l m e t h a n es u l f o n y lf l u o r i d e ，p m s f ) 对酶有抑制作用；z n 2 + x r j 酶活有较大的抑制作用；a r 、c - - , u 2 + x - , j - 酶也有一定程度的抑制，m 9 2 + 、c a 2 + 是较好的酶活稳定剂和促进剂。不同p h 缓冲液处理，若以p h 7 时酶活为1 0 0 计，p h 6 9 相对酶活无明显变化，p h 9 ，酶活下降。在模拟胃的酸性条件下( p h 2 3 ) ，胃蛋白酶对纳豆激酶有抑制作用，p i - i 恢复到中性时，纳豆激酶活力1 0 0 恢复。在胃环境中，即使有其它内容物，对n k 活力影响也极小。说明n k 在胃环境中相当稳定( f u 妇m ，甜讲，1 9 9 5 ) 。1 2 2 纳豆激酶的溶栓机制1 2 2 1 纤溶系统与溶栓治疗体内纤溶系统是一种平衡调节器，由体内的纤溶作用和抗纤溶作用来保持这种平衡，以免因失去这种平衡而导致疾病的发生。在实现纤溶作用中，血液里有两种纤溶酶原激活剂，其一为源自于血管内皮细胞的t - p a ，其二是由肾细胞产生和分泌的尿激酶型纤溶酶原激活剂( u r o k i n a s ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ，u p a ) 。在正常情况下，血液中只存在少量的纤溶酶原激活荆( p l a s m i n o g e a a c t i v a t o r ，p a ) 。丽形成微量的纤溶酶，并通过纤溶酶原激活剂的抑制剂( p a i d ) 和以抗纤溶酶( a 2 - a n t i p l a s m i n ，a 2 - a p )来保持纤溶系统的平衡。纤溶酶原被激活产生纤溶酶的过程是纤溶作用、细胞迁移、细胞外基质降解等多种生物过程的关键步骤。纤溶酶原激活剂分直接和间接作用两类。属直接激活剂的有t - p a 和i l p a ，是自体细胞产生和分泌的。间接激活剂是由细菌产生的s k 和葡激酶( s t a p h y l o k i n a s e ，s a k )等。纤溶作用是纤溶酶原参与的众多生理和病理过程的基础。纤溶酶原是纤溶系统的重要成分，在各种生理与病理过程中发挥着举足轻重的调节作用。另外，在纤溶系统中纤溶的底物为纤维蛋白。而纤维蛋白的前体为可溶性的纤维蛋白原。它在凝血酶的催化作用下形成纤维蛋白。纤维蛋白的积累也是一些疾病发生标志。如各种血栓病，脑中风，老年痴呆等( r u j i t a1 4山东农业大学硕士学位论文m ，盯a l ，1 9 9 5 ) 。在纤溶系统的平衡中纤溶酶原激活剂与激活剂的抑制因子起着关键的调控作用。在人体内的t - p a 和u p a 与p a i - 1 和眈a p 即为这类因子。研究发现，n k 具有纤溶酶的直接降解血栓( 交联纤维蛋白) 的作用外，还可激活和转化p r o - u k 成u k ，起到间接溶检作用。同时，纳豆激酶还可促进血管内皮细胞产生内源t - p a ，t - p a 催化纤溶酶原转变成纤溶酶，以使积累的纤维蛋白或血栓溶解。研究发现( 李荣苹等，1 9 9 6 ) ，纳豆激酶表现出水解p a l 1 纤溶酶原激活剂抑制剂的重要作用。在调控纤溶系统中，p a i 1 主要功能是水解t - p a ，使其失去激活作用，减少纤溶酶原被激活成纤溶酶的量，因此使溶纤活性变小。正是纳豆激酶的这种作用，使p a l 一1 失活，保证t - p a r i a 能增加，使纤溶酶原被激活成纤溶酶，加速血栓的溶解。由此可见，n k 作为溶栓制剂具有以下四方面的作用。1 2 。2 2 直接溶栓作用最初须见洋行发现纳豆含n k ，即是通过将纳豆放在纤维蛋白的平皿j 上，3 7 c 培养后发现纳豆具有很强的溶解纤维蛋白的功能。n k 是一种丝! 氨酸蛋白，能水解纤维蛋白，具有严格的限制性酶切位点，其主要酶切位二点在l e n - t y r 之_ 间，其次在s e t - h i s 位点间，较微弱水解g l u - h i s 和h i s l e n 盥：点( 鞠洪荣，2 0 0 0 ) 。因此，可直接作用于交联纤维蛋白血栓的上述氨基酸位点，使纤维蛋白水解成可溶性的小分子，达到溶解血栓的目的。v u j i t a一等发现纳豆激酶在不同时间降解交联纤维蛋白的片段的大小不同，主要为1 7 5 k d 和1 1 0 k d 。随作用时间延长，其降解产物中出现1 4 3 k d ，3 6 k d 和4 l 妨等不同大小片段。表明纳豆激酶可直接降解血栓。1 2 2 3 刺激血管内皮细胞产生t - p a 及催化尿激酶原转变成u kt - p a 在体内纤溶系统的调控中起着重要作用，在溶栓治疗中t - p a 也是极为重要的临床用药。它可激活体内的纤溶酶原，形成纤溶酶，纤溶酶可将己形成的纤维蛋白栓子溶解。同眼 t - p a 的活性又受到p 越1 的抑制，借以调控纤溶酶的作用，保证体内纤溶系统的正常机能。在体内是由血管内皮细胞产生并分泌到血液中，其半寿期极短，仅为4 8r a i n 。当人口服 敝之后，定时取血，然后用酶联免疫吸附检测法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) ( 王正刚等，1 9 9 8 ) 测定不同时间内，血液中t - p a 乍i 量的变化。结果表明，血液中t - p a 召 量随着时间变化而发生从低到高，然后从产纳豆激酶激酶菌株的分离筛选与鉴定高至低的变化。在正常情况下，体内t - p a 量约为6 7 n g m l ，但在口服纳豆激酶后4h ，其血液中t p a 的含量可增加到1 0n g m l 以上。由此可见，口服纳豆激酶吸收到血液中，然后通过t - p a 途径，起到溶栓治疗作用。这是纳豆激酶能有效地溶解血栓的机制之一。另外，有学者指出，纳豆激酶不具备纤溶酶原激活剂的作用。但是须见洋行等研究发现，纳豆激酶可激活体p q p r o - u k 转变为u k ，u k 是第一代溶栓剂，普遍用于各种血栓病治疗中。u k 也是一种纤溶酶原激活剂，激活纤溶酶原产生纤溶酶，从而增加内源纤溶酶，增加体内溶栓作用。体外用纳豆激酶激活尿激酶原转变尿激酶，水解四肽的纤溶酶底物，依时间延长水解底物量增大，在9 0m i l l 后，逐渐下降，这就表明n k 可激活尿激酶原产生尿激酶，参与纤溶过程。1 2 2 4a i l ( 通过降解和失活p a i - 1 调节溶栓作用p a i - 1 是体内调控纤溶系统平衡的主要因子。它通过降解t - p a 调节体内纤溶酶原激活为纤溶酶。最近，日本学者( 杨志兴等，1 9 9 6 ；张淑梅等，1 9 9 9 ) 发现，n k 在体外具有降解和失活纤溶酶原激活剂( t - p a ) 的抑制剂p a i - 1 的作用。所以n k 可能通过调控p a i - 1 ，t - p a 和纤溶酶与纤维蛋白的平衡关系，改变体内的溶栓作用。u r o n o 等的纳豆激酶使重组p a l - 1 ( r pp a i - 1 )失活的研究发现，两者存在剂量依赖关系。即纳豆激酶 r pp a l 失活，t - p a不被降解，纤溶酶增多，降解纤维蛋白量增加。已证明，纳豆激酶降解和失活p a i - i 是特异现象，所以提出这种作用为纳豆激酶具有很强的溶栓作用的一种新的作用机制( f u j i t a m ，e t a i ，1 9 9 5 ) 。1 2 3 纳豆激酶的药用优势( 1 ) 可以口服：( 2 ) 在血液循环中半寿期长；( 3 ) 对纤维蛋白具有选择性；( 4 ) 出血副作用小；( 5 ) 来自于天然食品，可长期服用，重新栓塞几率低。1 2 - 4 纳豆激酶的研究进展1 9 9 2 年，n a k a r n u r a 等测定了n k 的基因序列。它的全长基因包括调控序列在内共1 4 7 3b p ，起始密码子上游1 7 处为核糖体结合位点a a a g g a g ，s d 序列上游为j v r 含量高达7 0 的转录调控区，l1 4 3b p 阅读框架编码2 9 个氨基酸的信号肽，7 7 个氨基酸的前肽及2 7 5 个氨基酸的成熟肽。前肽在蛋白质的分泌与折叠的过程中起着重要的作用。在ec a l l 中表1 6山东农业大学硕士学位论文达成熟肽的报道很多，表达量约占细菌总蛋白的3 0 。但大多表达产物都以包涵体的形式存在，而且很难复性。有文献( f u j i t am ，e t 讲，1 9 9 5 ) 报道可在ec o l i 中以融合蛋白方式表达，表达蛋白占菌体蛋白的1 5 2 。其原因在于应用的表达载体不同。当选用p r i t 2 t ( p r o t e i n a 融合型) 为载体，受体菌为ec o l i n 4 8 3 0 时，产物以融合蛋白形式表达，而使用p b v 2 2 0 为载体，以ec o l id h 5 a 为受体菌，则表达产物是以包涵体形式存在。另有文献报道( u r o n ot ，e t a l ，2 0 0 1 ) 1 2k b 的纳豆激酶基因在晟c o l i中的克隆，以分泌形式表达。表达量占菌体蛋白的1 2 左右。他们选用的表达载体为p b v 2 2 0 ，受体菌为ec o l ii - 1 8 1 0 1 ，其能够分泌表达可能是因为此1 2k b 的基因中含有信号肽序列，同时，复旦大学将1 5k b 的全长n k 基因在枯草杆菌中分泌表达，其产物经分离纯化后，扫描分析纯度达9 5 。目前已有诸多学者作了纳豆激酶蛋白质性质的研究。得知纳豆激酶分子量为2 7 7 2 8 ，p i 为8 6 0 3 。s u m i 等人首次报道并认为它是一种血纤蛋白溶酶类丝氨酸蛋白酶。因为它的活性不受5m m o l lc y s 的影响，但lm m o l l 二异丙基氟磷酸盐( d i i s o p r o p y lf l u o r o p h o s p h a t e s ，d