（分析化学专业论文）卷烟色谱指纹图谱及其在品质监控中的应用研究.pdf

摘要 摘要 烟草生产的质量控制，是烟草行业中一个重要的部分。卷烟的质量控制包 括原料烟叶控制，成品烟丝控制和烟气控制等多个部分，由于烟草本身成分非 常复杂，其质量控制需要对其整体进行评价。本工作主要是从烟叶，成品烟丝 和烟气的气相色谱数据出发，研究卷烟样本的分类和质量控制的方法。 本工作中烟叶和烟丝经过硅烷化后进行气相色谱分析，而烟气则一部分直 接进行气相色谱分析，另一部分在硅烷化处理后进行气相色谱分析。由于这些 样本成分十分复杂，因此需要使用化学计量学来对其进行分析。 在进行各种方法分析前，首先对色谱数据进行一系列数据预处理，包括棒 图化模拟，调整保留时间，以内标为标准对峰面积标准化，多谱的平均化等。 在经过预处理后，使用多种化学计量学方法对色谱数据进行分析。包括差 谱法，多种模式识别方法及指纹图谱异常指数法。 差谱法考察的是不同样本的色谱分析结果中对应峰的差距，用于观察样本 中一些主要成分的变化较有效。提出差谱相对峰面积指标来表示两样本的整体 差距，引入相关系数表示样本问的相似程度。差谱法及相应指标能反映出不同 品牌不同生产时间的卷烟间的差异，并与实际情况相吻合。 模式识别方法用于对不同品牌卷烟样本的色谱数据进行分类，能够直观反 映分类效果。分别研究了无监督方法p c a 投影，模糊k 均值聚类，系统聚类法 和有监督方法线性学习机在卷烟分类中的应用。p c a 投影法可成功地对不同部 位、不同产地的烟叶进行分类。 研究了建立烟草样本色谱指纹图谱的步骤。提出了供试品与标准品的共有 色谱峰之间的异常指数、供试品缺失及额外色谱峰的异常指数的概念和计算方 法。初步建立了烟草样本基于指纹图谱总异常指数的品质监控的标准。该异常 指数不仅能反映出样本间含量较高组分的量的变化，更能敏感的反映出是否存 在额外或缺失的微量成分。所建立的品质监控标准可成功的判别包括正常合格 品，工艺异常产品、模拟变质产品、仿冒品等各种成品烟丝样本。 关键词：烟草，气相色谱，品质监控，指纹图谱，差谱法，模式识别，硅烷化 a b s t r a c t q u a l i t yc o n t r o lo fc i g a r e t t em a n u f a c t u r i n gi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tp a r t so f t o b a c c oi n d u s t r y i tc o n t a i n ss e v e r a lp a r t s ，i n c l u d i n gt h eq u a l i t yc o n t r o lo ft o b a c c o l e a f , p r o d u c ts h r e da n dc i g a r e 仕es m o k e b e c a u s eo ft h ec o m p l e x i t yo ft o b a c c o i n g r e d i e m ，i ti sn e c e s s a r yt oe s t i m a t et h eq u a l i t yc o n t r o lo fc i g a r e t t ea saw h o l e i n t h i sp a p e r , t h em a i nt a r g e ti st oi n v e s t i g a t et h ec l a s s i f i c a t i o no fc i g a r e t t es a m p l e sa n d m e t h o d so fq u a l i t yc o n t r o lf r o mg a sc h r o m a t o g r a p h i cd a t ao ft o b a c c ol e a f , p r o d u c t s h r e da n dc i g a r e t t es m o k e s a m p l e so ft o b a c c ol e a v ea n dp r o d u c ts h r e d ，i nt h i sp a p e r , w e r em e a s u r e db yg a s c h r o m a t o g r a p h y ( g c ) a f t e rb e i n gs i l y l a n i z e d , w h i l es a m p l e so fc i g a r e t t es m o k ew e r e b o t hd i r e c t l ym e a s u r e db yg a sc h r o m a t o g r a p h y , a n dm e a s u r e da f t e rb e i n gs i l y l a n i z e d b e c a u s eo ft h ec o m p l e x i t yo fs a m p l e si n g r e d i e n t ，c h e m o m e t r i c sw e r ea d o p t e dt o a n a l y z et h ed a t a f i r s to fa l l ，b e f o r ec h r o m a t o g r a p h i cd a t aa n a l y s i s ，as e r i e so fd a t ap r e t r e a t m e n t s ， i n c l u d i n gt h es i m u l a t i o no fb a rd i a g r a m , t h ea d j u s t m e n to fr e t e n t i o nt i m e ，t h e s t a n d a r d i z a t i o no fp e a ka r e a sb a s e do nt h a to fi n t e r n a ls t a n d a r da n da v e r a g i n go f m u l t i - c h r o m a t o g r a m , w e r eb e i n gp r o c e s s e d s e c o n d l y , a f t e rd a t ap r e t r e a t m e n t , s e v e r a lc h e m o m e t i cm e t h o d s ，i n c l u d i n g s u b t r a c t i o nm e t h o d ，p a t t e mr e c o g n i t i o nm e t h o d sa n df i n g e r p r i n ta n o m a l yi n d e x m e t h o d ，w e r eu s e dt oa n a l y z et h ec h r o m a t o g r a p h i cd a t a s u b t r a c t i o nm e t h o de f f i c i e n t l yi n d i c a t e st h ev a r i a t i o no fs o m em a i ni n g r e d i e n t s i n s a m p l e sa c c o r d i n g t ot h ed i f f e r e n c eo f c o r r e s p o n d i n gp e a k s b e t w e e n c h r o m a t o g r a m s r e l a t i v ep e a ka r e ai n d e xw a sa d o p t e dt os h o wt h ew h o l ed i f f e r e n c e o ft w os a m p l e s r e l a t e dc o e f f i c i e n tw a su s e dt oi n d i c a t et h es i m i l a r i t yo fd i f f e r e n t s a m p l e s s u b t r a c t i o nm e t h o da n dr e l a t e di n d e x e sc a nd e n o t et h ed i s t i n c t i o no f c i g a r e t t e sb e t w e e nd i f f e r e n tb r a n d sa n dm a n u f a c t u r i n gt i m e t h er e s u l t sc a nw e l l a c c o r dw i t ht h ef a c t p a t t e r nr e c o g n i t i o nm e t h o d sw h i c hc a l l i n t u i t i o n i s t i c l yr e f l e c tt h ee f f e c to f c l a s s i f i c a t i o nw e r eu s e dt oc l a s s i f yc h r o m a t o g r a p h i cd a t ao fd i f f e r e n tc i g a r e t t eb r a n d s a m p l e s l i n e a rl e a r n i n gm a c h i n e ( l l m ) ，o n eo fs u p e r v i s e dc l a s s i f i c a t i o nm e t h o d s ， a n du n s u p e r v i s e dc l a s s i f i c a t i o nm e t h o d s ，i n c l u d i n gp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ( p c a ) ，f u z z yk - m e a n s ( f k m ) ，a n dh i e r a r c h i c a lc l u s t e r i n gm e t h o d ( h c m ) w e r e s t u d i e da n da p p l i e di nt h ec l a s s i f i c a t i o no fc i g a r e t t e s e s p e c i a l l y , s u c c e s s f u lr e s u l t s t h a tt o b a c c ol e a fs a m p l e so fd i f f e r e n tp a r t sa n do r i g i n sc a nb ec l a s s i f i e dw e r e o b t a i n e db yp c a i nt h i s p a p e r , t h ep r o c e d u r e o ft o b a c c oa n dc i g a r e t t e c h r o m a t o g r a p h i c f i n g e r p r i n tw a se s t a b l i s h e d as e r i e so fc o n c e p t sa n da l g o r i t h m s ，i n c l u d i n gt h e a n o m a l y i n d e xo fc o m m o nc h r o m a t o g r a p h i c p e a k s ，d e f e c t i v e a n da d d i t i o n a l c h r o m a t o g r a p h i cp e a k sf r o mt e s ts a m p l e s ，b e t w e e nt e s ta n ds t a n d a r ds a m p l e sw o r e d e f i n e d p r i m a r i l y , t h et o b a c c oa n dc i g a r e t t eq u a l i t yc o n t r o ls t a n d a r db a s e do nt o t a l a n o m a l yi n d e xo ff i n g e r p r i n tw a ss e tu p t o t a la n o m a l yi n d e xc a ns e n s i t i v e l yi n d i c a t e w h e t h e rm i c r o c o m p o n e n t sa r ed e f e c t i v eo ra d d i t i o n a l ，a sw e l l 嬲t h ev a r i a t i o no f m a c r o c o m p o n e n t sb e t w e e ns a m p l e s t h ec i g a r e t t eq u a l i t yc o n t r o ls t a n d a r dc a l l d i s c r i m i n a t ea l lp r o d u c ts h r e ds a m p l e so fn o r m a lp r o d u c t s ，a b n o r m a lm a n u f a c t u r i n g c o n d i t i o np r o d u c t s ，d e t e r o p r a t e da n a l o g yp r o d u c t , a n dc o u n t e r f e i tc i g a r e t t ep r o d u c t s k e y w o r d ：t o b a c c o ，g a sc h r o m a t o g r a p h y , q u a l i t yc o n t r o l ，f i n g e r p r i n t , s u b t r a c t i o n m e t h o d ，p a r e mr e c o g n i t i o n , f i l y l a t i o n i i i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：嘲寻 w 口岁年；月7 , oh 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在a 2a l o 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：，荨- 中良 学位论文作者签名：沈泛翔 沙口陴多月加日1 w 0 3 年专月弘日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：汔乱翎 枷r 年月h e l 第1 章引言 第1 章引言 随着人们对吸烟与健康问题的普遍关注，卷烟工艺和烟草生产的质量控制， 越来越成为烟草行业中一个重要的部分。然而，作为一种天然嗜用植物，烟草 及其燃烧产生的烟气的成分，是极其复杂的。分析和处理烟草和烟气的方法也 是比较繁琐的。由于分析仪器和分析技术的发展，才使得收集烟草和烟气进行 分离鉴定成为可能。据文献报导，烟草和烟气中已经确定和分离的化合物达5 0 0 0 种，对如此复杂的体系进行研究，工业上往往使用气相和液相色谱法等进行 研究。随着烟草化学的深入研究以及更好更有效的分离检测手段的使用，烟草 分析有了很大的发展，大量色谱仪器在烟草分析中的应用，可以在很短时间内 准确地得到上百甚至上万个在线和离线的烟气、烟丝和烟草物理检测指标和化 学量测数据。由于一些量测方法已转化为常规检测，大量积累的数据依靠传统 的几个统计指标已不能准确而直观地提取有用的综合信息。因此，在烟草质量 控制体系中，越来越需要一种方便有效快速的方法来对烟草实验数据进行分析。 化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) 是一门新兴化学分支学科，它自二十世纪七十年 代诞生以来，在八十年代得到长足发展，至今己逐步成熟。研究范围涵盖化学 实验设计与优化、定量校正理论、分析信号处理、化学模式识别、模型与参数 估计、数据解析、过程模拟、人工智能、情报检索、实验室自动化等等。它应 用数学、统计学与计算机科学的工具和手段设计或选择最优化化学测量方法， 并通过解析化学测量数据以最大限度地获取化学及其相关信息瞳1 。 如何维护品牌卷烟的风格即如何保持卷烟质量稳定性一直是卷烟配方、卷 烟加工和卷烟销售的关键问题之一。由于卷烟首先是以烟气形式消费，在吸烟 过程中，烟草从固态形式转变为一种复杂的带有悬浮粒的气体。卷烟烟气质量 直接反映了混合烟丝燃烧过程中生成的化学成分及影响燃烧条件的卷烟几何形 状、卷烟纸、过滤嘴的类型。因此可以将卷烟质量概括为烟气质量、烟丝质量 及烟叶质量，首先从烟气色谱图出发，结合混合烟丝色谱图客观评价卷烟内在 质量稳定性及进行不同卷烟产品风格比较，而利用化学计量学处理复杂数据的 优势，可以最大限度地获取相关信息，并形成一套有效的方法应用于烟草生产 的质量控制。 第1 章引言 在已查阅到的有关指纹图谱研究的文献中，有关中药指纹图谱的研究占了 一定的比重。目前，指纹图谱已广泛用于中药质量评价。中药和烟草同属于成 分复杂的天然植物，对于两者的指纹图谱的研究也具有一定的相似性，对单一 成分的含量测定，显然很难完全反映它们的整体效果，所以，一些中药指纹图 谱研究方法和内容对于烟草指纹图谱的研究也有借鉴意义，详细介绍见第5 章。 本课题将通过对化学计量学方法的研究和改进，建立科学有效的烟气烟丝 复杂体系谱图处理系统。在此基础上尝试建立卷烟烟气烟丝的指纹图谱，用以 定量描述和评价卷烟烟气烟丝内在质量稳定性，并最终形成卷烟烟气烟丝质量 评价综合软件。 2 第2 章实验 第2 章实验 2 1 烟草样本色谱分离分析概述 烟草及烟气中的成分极其复杂，工业上往往使用气相和液相色谱法及近红 外光谱法b 1 ，或者进一步结合质谱法，固相萃取h 1 ，固相微萃取瞄3 法等进行研究， 而本课题的合作单位上海烟草集团主要使用气相色谱进行研究。 气相色谱适于分离分析有足够挥发性的物质。对极性强、挥发性低、热稳 定性差的物质往往不能直接进样分析，如果能将这类物质进行适当的化学处理 转化成相应的挥发性衍生物，就可以扩大气相色谱的测定范围。此外，转化成 衍生物的方法还可以改善结构极其近似的化合物分离的选择性，克服载体、柱 壁对高极性、低挥发性样品的吸附，改善样品的峰形。某些物质转化成含亲电 基团的衍生物如卤代衍生物后，可用电子捕获检测器( e c d ) 或阴离子化学电 离质谱( n i c i m s ) 检测，提高检测能力。因此，挥发性化学衍生物的形成在 气相色谱中具有重要的应用价值陋1 。 气相色谱中常见的衍生试剂主要有硅烷化试剂、烷基化试剂( 包括酯化试 剂) 、酰基化试剂、缩合反应试剂和手性衍生试剂等订1 。烟草不能直接进行色谱 分析，而当前对烟草组分的色谱研究，常使用硅烷化实验的方法。 硅烷化衍生试剂是一种常见的气相色谱衍生试剂，其主要作用是通过硅烷 化衍生反应将非挥发性物质转化为挥发性衍生物，扩大气相色谱的测定范围， 已广泛的应用于药物学哺。1 刳、生物化学n 钔、环境化学n 们和食品化学瓣翻等领 域。 硅烷化试剂与被测物的衍生反应是通过硅烷基取代羟基、羧基、巯基、氨 基及亚氨基的活泼氢而进行的，衍生产物是硅醚或硅酯。几乎所有含这些活泼 氢的化合物都能与硅烷化试剂发生衍生反应，反应活性顺序为：醇 酚 羧酸 胺 酰胺。在这类试剂中，三甲基硅烷( t m s ) 衍生物热稳定性好，挥发性强，易 于制备，色谱性能好，应用最广。n 一甲基一n 一三甲硅基三氟乙酰胺( m s t f a ) 、 n o 一双( 三甲硅基) 乙酰胺( b s a ) 、n o 双( 三甲硅基) 三氟乙酰胺( b s l r i 认) 、n _ 三甲硅基咪唑( t m s i m ) 因离去基团能稳定过渡态阴离子，反应性较强。m s t f a 3 第2 章实验 衍生物的挥发性最好。t m s i m 易与羟基及羧羟基反应，但与脂肪胺不反应，也 不能促进烯醇一t m s 醚的形成，适于衍生含酮和羟基的化合物。根据试剂的反应 性、选择性、挥发性、副产物的形成等因素，b s t f a 、m s a 二种试剂应用最 多n 焉净州。一些混合硅烷化试剂b s t f a 、三甲基氯硅烷( t m c s ) 、t m s i m 反应性 强，已商品化。三甲基硅烷衍生试剂与醇、酚类化合物的反应主要受立体效应 的影响，反应性为伯醇 仲醇 叔醇。硅烷化试剂的反应性还受到加入的催化剂 的影响。t m c s 、t m s i m 、t m s i ( 三甲碘硅烷) 、乙酸钾常被用作催化剂。加入1 t m c s 的b s ，r 1 1 a 衍生试剂被广泛用于检测滥用药物及其代谢物幽1 。 除了广泛使用的三甲硅烷化试剂外，还有其它烷基取代的甲硅烷化试剂。 二甲硅烷化衍生物( d m s ) 比三甲硅烷化衍生物挥发性更强，对分析多官能团 化合物有一定的优越性。 但二甲硅烷化衍生物易于水解，活泼s i h 基会导致副反应。特丁基二甲硅烷 基( t b d m s ) 衍生物比三甲硅烷基( t m s ) 衍生物对水更稳定，而且能给出有用 的质谱碎片。该衍生物也易于制备，但不能用于衍生有立体阻碍的基团。衍生 试剂n 一甲基一n 一特丁基二甲硅烷基三氟乙酰胺( m t b s t f a ) 可提供t b d m s 基团，该 试剂用于衍生羟基、羧基、巯基、一级胺和二级胺中的活泼氢心删，反应形成的 副产物易于挥发。t b d m s 衍生物在质谱中易于失去特丁基形成高丰度的 m 一5 7 + 特征离子，适于选择离子方式( s i m ) 定量分析。 卤烷基二甲硅基试剂能增加衍生物的亲电性，使之适于灵敏的电子捕获检 测器( e c d ) ，这类试剂已经用于制备甾醇、前列腺素、糖类等的衍生物。 2 2 硅烷化成品烟丝实验 2 2 1 实验原理 硅烷化成品烟丝实验的实验原理主要是利用三甲基硅烷化衍生试剂( s d e r i v a t i v e s ) n ，0 双( 三甲硅基) 三氟乙酰胺( b s t f a ) 和三甲基氯硅烷( 喇c s ) 与烟丝中的化学成分发生三甲基硅烷化衍生反应，通过三甲基硅烷基取代羟基、 羧基、巯基、氨基及亚氨基的活泼氢，提高烟丝中这类化学成分的挥发性，特 别是取代烟丝中糖类成分所含的羟基活泼氢，并用溶剂n ，n _ 二甲基甲酰胺 ( d m f ) 萃取反应后的衍生产物，在加入内标物正十七烷后，最后进行气相色 4 第2 章实验 谱分析，其中色谱检测器采用火焰离子检测器( f l a m ei o n i z a t i o nd e t e c t o r , f i d ) 。 反应方程式如下： r 如 。 甲 冒i h y+f 3 c 亡- - - n - - s i ( c h a ) 3 - - y _ s i ( c h 3 ) 3 + f 3 c c f r s j ( c h 3 ) 3 a s 锄帕l eb 8 t n 产物 在三甲基硅烷化衍生试剂中，b s t f a 为主要的硅烷化衍生试剂，与烟丝中 带含有活泼氢的化学物质进行反应，由于t m c s 发生的衍生化反应中的副产物 h c i 挥发或部分挥发，加入t m c s 对b s t f a 衍生化反应可起催化作用，在本 实验中，少量的t m c s 作催化剂使用。 2 2 2 实验仪器 a g i l e n t6 8 9 0 型气相色谱系统( 安捷伦科技) c s l 0 1 - a b 型电热鼓风干燥箱( 重庆试验设备厂) 2 2 3 实验试剂 硅烷化衍生试剂：b s t f a + t m c s ( 9 9 ：1 ) ，s u p e l c o 公司产品 溶剂：n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) 分析纯 内标物：正十七烷溶于d m f 中，浓度2 o o m g i i l l 2 2 4 实验步骤 先取两包成品卷烟作为样品，在去除过滤嘴和卷烟纸后取出烟丝，将烟丝 用磨粉机打磨成烟末，用电子分析天平称取o o s o o g o 0 0 0 5 9 烟末样品于2 m l 色谱样品瓶1 中。然后用移液枪移取1 0 0m ld m f 于样品瓶1 中，接着用移液 枪移取o 4 0i i l l 硅烷化衍生试剂加入到样品瓶1 中，盖紧瓶盖摇匀后放入烘箱， 在7 0 2 的温度下使样品与硅烷化衍生试剂充分反应，恒温3 0 分钟后取出样 品瓶。在样品瓶1 静置并冷却到室温后，打开瓶盖，用一次性吸管快速吸取上 层清液，移入已预先置于色谱样品瓶2 中的1 0 0 9 l 衬管中。最后盖紧瓶盖并赶 去衬管底部的气泡，将样品瓶2 放入气相色谱自动进样装置进行进样分析。每 个样品重复进样3 5 针。 5 第2 章实验 2 2 5 气相色谱条件： 色谱柱：d b 一1 ， 3 0 m x 0 2 5 m m i d x 0 0 2 t t m d f 进样量：1 o 山， 分流比：2 0 ：1 载气h e 恒流：1 5 m l m i n 进样口温度：3 0 0 ，f i d 温度：3 0 0 ， 程序升温：7 5 至2 8 0 ，每分钟升4 2 3 烟气实验( 硅烷化及非硅烷化) 2 3 1 实验原理 用转盘式吸烟机采集2 0 支卷烟主流烟气，用溶有烟酸甲酯和正壬醇的甲基 叔丁基醚萃取。分析粒相物挥发半挥发物( 萃取物a ) 时，内标物使用烟酸甲 酯，萃取液直接进入气相色谱，通过y 型分流器分别用氢火焰和氮磷检测器检 测。其使用的色谱柱为l i p i n n o w a x ( i n n o 固定相一键合p e g ) 。l i p i n n o w a x 柱是键合一交联聚乙醇固定相的色谱柱，它有很好的惰性，因而是可以广泛使用 的色谱柱，对各种极性化合物如酸、醛和醇类可以得到很尖锐的峰形，不需要 用酸和醇处理。它可以经受多次进水样和溶剂样品。它的温度上限极高并且其 流失性是所有w a x 型固定相中最低的一种，所以它是分离高沸点化合物理想的 色谱柱，例如用此柱可以分离高达c ：。的游离脂肪酸。而粒相物极性非挥发物( 萃 取物b ) 的分析，内标物使用正壬醇，在萃取液中加入b s t f a 硅烷化后进行气 相色谱分析，检测器为f i d 。 2 3 2 实验试剂 硅烷化试剂：b s t f a + t m c s ( 9 9 ：1 ) ，s u p e l c o 产品； 甲基叔丁基醚，分析纯； 烟酸甲酯，分析纯； 正壬醇，分析纯； 6 第2 章实验 内标溶液的配置： 本实验将采用双内标，烟酸甲酯和正壬醇。烟酸甲酯( 作为挥发半挥 发物分析的内标) 和正壬醇( 作为极性非挥发物分析的内标) 按一定比例 溶于甲基叔丁基醚溶液中，制成混合内标溶液。 2 3 3 实验仪器 瓦里安v a r i a nc p 3 8 0 0 气相色谱仪，配有双进样口、双f i d 检测器和氮磷 检测器 i 己m 一2 0 0 转盘式吸烟机 自制三角玻璃烧瓶，底8 4 r a m ，2 9 # 标准口 2 3 4 实验步骤 在i s o 标准状态下，用r m 一2 0 0 转盘式吸烟机在一张滤片上采集2 0 支卷 烟主流烟气。( 卷烟无需重量、吸阻进行分选和水分平衡) ； 将滤片置于自制三角烧瓶中，加入内标溶液1 0 0 p 1 ，萃取液3 0 m l ，振荡萃 取4 5 m i r a 将一部分萃取物a 直接进行气相色谱分析，得到挥发半挥发物的结果； 另一部分萃取物b 进行硅烷化实验，再进行气相色谱分析。过程如下： a ) 取萃取物b 5 0 0 l a l 于色谱瓶中，加入2 0 0 9 1 硅烷化试剂，旋紧瓶盖，将 色谱瓶放入烘箱，7 0 条件下烘4 5 m i n ，迸行充分衍生化反应； b ) 加热结束，冷却后待气相分析； c ) 进行气相色谱分析，得到极性非挥发物的结果。 2 3 5 色谱条件 2 3 5 1 挥发半挥发物成分( 萃取物a ) 色谱柱：i n n o w a x ，6 0 m x0 3 2 m m d x0 2 5 u m d f 进样量：4 0 p l ，不分流进样 h p i n n o w a x ( i n n o 固定相一键合p e g ) 7 第2 章实验 进样口温度：2 5 0 i 检测器：氢火焰检测器( f i d ) 氮磷检测器( t s d ) 色谱柱和双检测器用y 型分流器连接，色谱柱的出口连接与y 型分流器一 个入口连接，y 型分流器的两个出口用2 5 e m x 0 2 0 m m d 的空管分别连接f i d 和t s d 。 2 3 5 2 极性非挥发物( 萃取物b 硅烷化后) 色谱柱：d b 一5 ，6 0 m 0 3 2 r a m d 0 2 5 9 m d f 进样量：2 0 1 a l ，不分流进样 进样口温度：3 0 0 检测器：氢火焰检测器( f i d ) h e 恒流：2 5 m l m i n 程序升温见表2 1 。 表2 1 极性挥发物程序升温表 8 第3 章差谱法 3 1 定义及目的 第3 章差谱法 对两张色谱图的每个对应的时间点的响应值进行差减，称为差谱。 使用模拟色谱数据相减，分为高斯峰相减和棒图相减。高斯峰相减，是对 色谱峰进行高斯化模拟，得到高斯峰后，向量相减。棒图相减，是以色谱峰的 保留时间为横轴，色谱峰面积为纵轴，绘制棒图，在对应保留时间上的峰的峰 面积相减。本文差谱方法使用棒图差减，如图3 1 所示。 1 1 。 1 0 9 ： 0 8 a 0 7 0 6 ： 0 5 ： 0 4 0 3 0 2 ： 一 0 1 。 i 51 01 52 02 5髂1 舶艏弱 1 0 9 0 8 0 7 b 0 6 0 5 0 4 0 3 ： 0 2 ： | i o 1 j il , j l - - ：i i 一 1 ”5 1 01 5 2 0 1 衢3 0 弱柏4 5柏弱 u 1 a 0 0 0 5 8 。b j | t 1 l | 扎i 。 0 ： m 0 5 。 - 0 1 ： 5 1 0 。1 5筠3 5 柏4 5锄胬 3 2 相似度指标 图3 1 棒图差减示意图 9 第3 章差谱法 差谱后，对结果需要有量化的指标，而如果引入化学模式空间的几种距离 与相似性指标就可以直观表述差谱后两谱之间的差距。 3 2 i 化学模式空间 任何一张原始的化学谱图i 实际上是一组化学量测数据，可用一组矢量玉来 表征，即五= ( 粕，五，) ，其中矢量值又称特征值，可用刀个特征值来描述。 在许多情况下，这些参量实际上就是原始化学量测数据。在这里，这些参量就 是气相色谱所得的烟丝( 烟气) 量测数据，经过数据预处理后，便成了由数十 至百多个峰的信息( 保留时间和峰面积) 构成的矩阵。这样的一组n 个参量就 构成了化学模式识别空间的一个点，即一个n 维的化学模式。由这样的化学模 式所构成的n 维空间，称化学模式空间，简称模式空间。如几张烟丝的气相色 谱，各有8 0 个峰，则它们构成的模式空间为一个8 0 维的模式空间。 3 2 2 模式空间的距离与相似性度量 化学模式识别的基本假设是相似的样本在模式空间中处于相近的位置，如 何度量两个样本在模式空间的远近? 这里可应用在几何学中的距离的概念，它 在模式识别中是作为与“相似性 相反的“相异性”的度量使用的。谱图间的 相似度可用各种不同的方法来度量，本文主要采取其中的三种方法，即 m a n h a t t a n 距离法、夹角余弦法及相关系数法。 3 2 2 1m a n h a t t a n 距离及差谱相对峰面积指标 设样本而和之间的距离为d ( 而，_ ) ，作为距离必须满足以下几个条件： 当玉= _ 时，d ( 薯，- ) = o ，即同一样本距离为0 ； 当而乃时，d ( 五，) 0 ，即不同样本间距离大于o ； d ( 而，- ) = d ( x j ，五) ，即距离没有方向性； d ( 五，_ ) d ( 薯，黾) + d ( 稚，) ，即两点间直线距离最短。 1 0 第3 章差谱法 两样本之间的广义距离，即m i n k o w s k i 距离由下式给出： q 三 驴t 兰捌l x - x , ir ( 3 1 ) 七= lf 气1 式中q 1 ，当q = l 时，( 3 1 ) 式成为： 岛= 喜卜i 2 ) 式( 3 2 ) 中口，称为m a n h a t t a n 距离，这种距离主要用于二维情况下的相异 性判断，据此给出第一个相似度指标： i 一l 驴每k = l 而 。3 ) 其中矢量五和善，由样本在刀个保留时间上的色谱峰相对面积值组成。就 是两色谱总面积差与两色谱平均总面积的比值。故在下文中被称为差谱相对 峰面积指标。 当存在特征值具相关性时，样本间相似关系由于相关性的影响而失真，从 相关性角度引入了下列两个相似度指标。 3 2 2 2 夹角余弦 两样本在空间中构成的矢量间的夹角余弦定义为 c o s 口t ，2 占 乙x 馕x i k k = l 其中矢量而与3 2 2 1 中相同，夹角- ，越小， 其相似性越大。 3 2 2 3 相关系数 两样本的相关系数定义为 ( 3 4 ) 两样本在空间中靠得越近， 第3 章差谱法 。j 2 p ( 靠一墨) ( 工肚一墨) k = l ( 3 5 ) 其中矢量五与3 2 2 1 中相同，式中写和_ ，分别为第i 个和第，个样本的均 值。，：，越接近于1 ，相似性越大。见图3 2 对于二维空间( 即假设只有两个特征的情形) ，可用图3 2 来说明夹角余弦 和相关系数法，两个样品的谱图矢量五和石，完全相关时，即，；，为1 时，两矢量 的方向完全重合，矢量间夹角，为o 。式( 3 4 ) 和式( 3 5 ) 区别在于前者采 用的是原始数据，而后者采用的是与平均值的比较值( 即中心化值) ，因此可以 直观地理解为，是中心化向量的夹角余弦。相关系数和夹角余弦计算结果都介 于区间【0 ，1 】，结果越接近o 则表示两个像本越不相似，反之，如果计算结果 越接近l 则表示两个样本越相似。 ，2 图3 2 矢量夹角及归一法的几何意义 3 3 差谱( 棒图差减) 的基本步骤 进行差谱的流程如图3 3 所示 1 2 第3 章差谱法 3 3 1 原始数据的获得 图3 3 差谱流程图 气相色谱仪器产生的原始数据都是在不同时间点的响应值，而通过仪器本 身的工作站产生的报告我们得到的是一系列包括峰保留时间，峰型( 如：基线 一基线( b b ) ，基线一峰谷( b v ) ，峰谷一峰谷( w ) 等等) ，峰宽，峰面积 等等的信息。 图3 4 硅烷化烟丝样品的气相色谱图 1 3 第3 章差谱法 图3 5 硅烷化烟气粒相物的气相色谱图 烟丝和烟气的成分十分复杂，在不同色谱条件下，在1 到2 个小时内会流 出几十甚至几百个色谱峰，如图3 4 和3 5 。由于色谱条件的微小变化，可能不 同的色谱峰保留时间和峰面积会产生差异，如果在对其进行处理时没有对准保 留时间的话，可能最初失之毫厘，最后结果却谬以千里。 图3 6 同一包烟的两次硅烷化烟丝的气相色谱图 1 4 第3 章差谱法 图37 同一包烟两次烟丝硅烷化实验气相色谱直接差减 图37 中圈中的色瓒形状是因为差减时对应峰保留时间没有对齐而产生， 显然，图37 中有很多类似的情况，其差减结果显然不能让人满意。 对这样的数据，有必要在进行谱图分析处理前对数据进行预处理，调整保 留时间使同种物质产生的色谱峰的保留时间基本一致。而为了便于分析处理， 还可对其进行色谱信号的模拟将这些信息进行棒图化模拟或高斯化模拟，本 文选择棒图化模拟， 3 32 数据预处理 棒图化模拟：棒图化即不考壤峰宽和峰型的影响，只以保留时间和峰面积 来表示一个峰，将每个峰表示成粗细相同的棒，保留时间缸为横轴面积a 为 纵轴( 棒的高度代表峰的面积棒的位置代表峰保留时间) 。将色谱数据经一系 列处理后转换成如图31 中( a ) 和( b ) 所示的棒图。这里以红双喜的两次烟丝硅烷 化数据h s x 0 2 0 0 2 2 ( 命名规则见3 41 ) 和h s x 0 2 0 0 _ 4 i 为例来说明该步骤。 调整保留时间：原理和详细实现过程见合作工作3 以下所涉及的保留时 间均为调整后的保帘时间。在调整保留时间过程中得到这两张谱的对谱和差谱 的容差范围a t 。 峰面积标准化：由于实验仪器状态的影响，色谱峰的响应值的波动会对数 据处理的结果产生影响，因此在进一步处理前还要对色谱峰数据进行标准化。 标准化的方法见合作工作”。 第3 章差谱法 3 3 3 对应峰相减 图3 8 差谱方法示意图 如图3 8 所示，3 8 ( a ) 中标记为1 的峰保留时间为1 3 0 3 3 r a i n ，在( b ) 中寻 找保留时间在1 3 0 3 3 am a i n 范围内的对应峰，找到( b ) 中保留时间为 1 3 0 4 2 m i n 的峰( 在( b ) 中标记为1 ) 符合条件；两者峰面积相减，峰保留时间加 权平均得到( c ) 中标记为l 的峰。而如果( a ) 中的峰在( b ) 中at 范同内 没有找到对应的峰，则在( b ) 中对应保留时间插入一个面积为0 的峰，然后两 者相减。依次对( a ) 中所有峰都进行同样的操作。再从( b ) 中挑选出未被差 减过的峰，如标记为2 的峰，由于( a ) 中没有与其对应的峰，同样在( a ) 中 对应保留时间插入一个面积为o 的峰，在( c ) 中对应位置得到面积为其负值的 峰。依次对( b ) 中所有未被差减过的峰进行同样操作后，得到的( c ) 即为( a ) 和( b ) 的差谱结果图。 3 3 4 计算相似度指标 在差谱完成后，( a ) 和( b ) 中所有峰( 包括置0 的峰) ( 不包括内标峰) 1 6 第3 章差谱法 可一一对应，其数据见表4 1 ，表中峰面积均为标准化后的峰面积，标准化的方 法见合作工作啪1 。按公式( 3 3 ) ，( 3 4 ) ，( 3 5 ) 计算可得到两色谱之间的夹角 余弦为0 9 9 5 7 、相关系数为0 9 9 5 4 、差谱相对峰面积指标为0 1 6 。由于内标物 是人为加入的，不代表样品本身的性质，在计算相似度指标时，要将内标峰去 除。表3 1 中已不含内标峰数据。 差谱运算过程中，提供两种峰面积指标，一种是使用色谱峰的绝对面积( 即 峰的原始面积) 相减，贮独是使用龟道竖笪塑型亘堡( 即蠼壅丝卮盟蝰酗 相减。两种面积指标得到的相似度指标结果是完全相同。 表3 1h s x 0 2 0 0 2 2 和h s x 0 2 0 0 - 4 1 色谱峰面积表 峰序号样本a样本b峰序号样本a样本b峰序号样本a样本b l0 0 00 0 32 50 0 40 0 54 90 o lo 0 l 20 0 40 0 52 60 0 70 1 25 00 2 lo 1 8 30 0 00 o l2 7o o o0 0 75 10 0 40 0 4 4o 2 5o 2 42 80 1 90 2 l5 20 0 1o o l 5 o 0 2o 0 22 90 4 60 4 5 5 3 o 0 2 o 0 2 60 0 00 0 73 0o 7 6o 6 85 40 0 00 0 0 70 3 7o 2 73 10 4 20 4 05 5o o l0 0 l 8o 0 0o 0 13 20 0 80 1 45 6o 0 10 0 l 90 0 00 0 03 30 0 40 0 45 70 0 1o o o 1 0o 0 lo 0 13 40 0 0o 0 25 80 o lo o o 1 10 0 6o 0