（果树学专业论文）柿子果酒酵母菌的分离、筛选及其应用研究.pdf

摘要 本研究以果酒的酿造特点为依据，以改善现有柿子果酒香气为主要目标，从自然界基 质中分离筛选得到2 株酵母菌，并在此基础上改进了发酵j 艺，使产品风味得以改善。本文 的主要实验结果如r ： 以不同f l 勺培养温度、p h 值、培养基、酒精浓度为富集条件，以柿果尉土壤和数十种水 果果皮为分离源，共分离得到1 2 2 株酵母菌。以各菌株发酵性能、不同的s 0 2 、酒精浓度为 筛选条件，结台感官评定，筛选出2 株符合果酒酿造要求且可产生怠好香气的酵母菌。 经鉴定，2 株酵母菌分别为德尔布有孢圆酵母( t o f z l i o s p o l - ad e l b r u e c k i i ) 、马克斯克 鲁维酵母( k i u y v e r o m y e e sm s r x i s n u 审，并命名为g s 一7 、g s 一3 。 本文研究了筛选菌株的生物学特性，g s 一7 、g s 一3 的展适生长温度分别为3 6 、3 4 ， 最适生长p h 值分别为4 5 和5 5 。通过分析不同因素对生长曲线的影响，可看出不同的培 养温度对最终菌物量有较明显的影响，而最初接种量对最终菌物量基本没有影响。2 株菌的 最适发酵温度均为3 0 ，最适发酵p h 值分别为4 5 和5 5 。同样，温度相对丁- p h 值和接种 量来说，对发酵度的影响也更为明显。g s 一7 、g s 一3 除满足一般果酒酿造要求外，还有很强 的凝聚性，本斯值可分别达到2 4 和3 6 m l 。 依据筛选酵母的生物学特性及参照原有柿果洒酿造技术，本研究采用了不同的混菌方 法对柿子酒的发酵工艺进行了改善。其中，单纯使用筛选菌株，柿子酒香气浓郁，具有典型 性，但发酵效率相对较低，最终酒精度可分别达1 0 9 和6 4 ；配合发酵能力强的酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a p ) 发酵，酒体不仅保持了柿子酒的香气，而且发酵效率可满足生 产的要求，为工业化生产柿子酒提供了一定的理论依据。 关键词：柿子果酒、酵母、分离、筛选、混菌发酵 a b s t r a c t b a s e do nt h eb r e w i n gc h a r a c t e r i s t i c so fw i n e ，t h ep r e s e n tw o r kf o c u s e do nt h ei m p r o v e m e n to f a r o m ao fp e r s i m m o nw i n e t w oy e a s t sw e r ei s o l a t e da n ds e l e c t e df r o mn a t u r a le n v i r o n m e n t f u r t h e r m o r e ，t h es e l e c t e dy e a s t sw e r eu s e dt oi m p r o v et h ef e r m e n t a t i o nt e c h n i q u es ot h a tt h e a r o m ac a l lb ei n c r e a s e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s t h ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，p hv a l u e ，c u l t u r em e d i aa n dc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw e r ec h o s e n a st h ee n r i c h m e n tc o n d i t i o n s 1 2 2y e a s t sh a db e e ni s o l a t e df r o ms o i li np e r s i m m o no r c h a r da n da l l k i n d so ff r u i tp e e l t h ef e r m e n t a t i o nc a p a c i t y , t o l e r a n c et os 0 2a n de t h a n o lw e r eu s e da ss e l e c t i v ec o n d i t i o n st o s e l e c tt h ey e a s t d u r i n gt h es e l e c t i o n ，t h es e n s o r yr e m a r kw a se m p h a s i z e d a c c o r d i n gt ot h ea b o v e r e q u i r e m e n t s ，t w os t r a i n so fy e a s tw e r es e l e c t e d t h et w oy e a f l sw e r ei d e n t i f i e da st o r u l a s p o r ad e l b r u e c k i i ，k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s ，a n d n a m e da sg s - 7 ，g s - 3 ，r e s p e c t i v e l y t h eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fs e l e c t e dy e a s t sw e r ea n a l y z e di nt h ep a p e r b yc o m p a r i s o n ，w e c a ns e et h a tt h et e m p e r a t u r eh a db e e nm o r ei n f l u e n t i a lo nt h eg r o w t hc u r v ea n dt h ef e r m e n t a t i o n c u l v et h a nt h ea n yo t h e rf a c t o r s t h eo p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r e sw e r ed e t e r m i n e da s3 c c ，3 4 。c ，a n dt h e o p t i m u m f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e so ft h e mw e r ea l l3 0 t h eo p t i m u mp hv a l u e so fg s - 7a n dg s 一3w e r e 4 5 ，5 5 a m o n gt h eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，t h ef l o c c u l e n tp r o p e r t yi sv e r yg o o d ，a n dt h e i rv a l u e sc a n r e a c h2 4 ，3 6 ，r e s p e c t i v e l y t h em i x e df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u ti ns e v e r a lw a y s t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ep e r s i m m o nw i n ef e r m e n t e db ym i x e dc u l t u r e sc a nn o to n l yk e e pt h ea r o m ao fp e r s i m m o n f r u i t ，b u ta l s oh a dah i g hf e r m e n t a t i o nd e g r e e t h u s ，i ti sah o p e f u lw a yt os a t i s f yt h ei n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o no fp e “i m m o nw i n e k e yw o r d s ：p e r s i m m o nw i n e ，y e a s t ，i s o l a t i o n ，s e l e c t i o n ，m i x e df e r m e n t a t i o n l l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究敲暴。尽我辑妇，除了文中特别热娃掭注秘致谢的逸方外，论文中不包食其她 人融经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 戆学位或涎书两使绷过的孝孝辩。与我同工作静同恚对本研究所墩的侄 可贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 暇蝼氨协晶 时阉：2 。r f 年g 月 乡爨 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 僳鳍送交论文的复印侔和磁盘，允许论文被查阅积倍淹，可以采嗣彩印、缩辞或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农般大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传搔学位论文鹣全部凌部分肉容。 ( 保密的学位论文在勰密后应遵守此协议) 研究生签名：程慷邑 导师签名： 7 主- - 下1 j 搠。易d 年月傍 时闻：26 心年g 月，日 1 1 柿子分布、生产概况 第一章绪论 柿属于柿科( e b e h a c e a e ) 柿属( d i o s p y r o sl ，) 植物，原产于我国。柿树栽植在中国 己有30 0 0 多年的历史。全世界分布的柿属植物约有5 0 0 余种，主要分布于热带和亚热带 地区，少数分布在暖温带地区。中国有6 4 种，主要分布在海南、云南、，一东、广。西热带和 亚热带地区，长江以南的温带也有少数分布，而黄河流域一般仅有柿及君迁子2 个种“1 。柿 属植物中作为果树栽培的有柿( d k a k i l ，) 、君迁子( n l o t u s l ) 、油柿( d o l e i f e r ac h e n g ) 、 浙江柿( n g l a u c i f o l i a m e t c a l f ) 、老鸦柿( d f r h o m b i f o l i a h e m s l ) 等品种，主要分布于我国的 华北和西北地区”。4 1 。 柿子( d i o s p y r o sk a k i ) 自7 世纪从中国传入日本”1 ，1 4 世纪又传至朝鲜”。，到1 7 世纪 初期传入欧洲，1 8 世纪以后才逐渐传遍了全世界。现在世界各地适宜柿子生长的地区和国 家，比如以色列”1 、泰国”1 、西班牙、意大利”1 、新西兰“1 、美国”等均有柿树栽培。除中 国外，栽培面积以日本、韩国居广，次之为巴西、以色列、意大利、新两兰、伊朗、澳大利 亚、墨西哥等国家，其他国家或有零星分布”1 。 但是，长期以来柿子的主产区一直在东弧地区，特别是在中国有较j “的栽培面积1 。据 统计，目前世界柿栽培面积3 4 9 9 万h m 2 。我国栽培面积己达2 8 2 8 万h m 。，居世界之首， 约l l 全世界栽培面积的8 0 8 i t 2 1 ；韩国、日本次之，各有3 0 8 万及3 0 万1 1 i n 2 ，备占8 8 和8 6 “。；全世界年产鲜柿2 3 2 万t ，我国产鲜柿1 6 4 6 万t ，占全世界总产餐的7 1 5 1 ，日本和韩国，分别占1 3 和5 左右“，可见，中、日、韩三国的柿子产量可以占 到将近世界柿子总产量的9 0 。近年来，随着其他国家对柿子的日益重视，泰国”1 、欧美”、 以色列的产量也在持续增加。 可见，我国无论在柿子栽培面积，还是在柿子产量上，均具有巨大的优势。我国加入 w t o 后，随着关税的逐年降低，主要果品如柑橘、苹果等无疑会受到巨大冲击，而发展有中 国特色的优质果品如柿子等水果，从战略上讲麻该是中国果品生产可持续发展所必需的，而 且从其它国家的水果业笈展经历来看也是可行的。日本在近年，尤其是在荚欧大量水果涌入 日本果品市场后，花大力罱研究、开发了具东亚特色的柿子，时至今日，柿子仍以约3 0 多 万t 的产量继柑桔、苹果、梨之后居第4 位”1 。柿子也是日本向欧美、东南亚及中东地区主 要山口的果品之一。目前日本柿子深受国内外市场欢迎，出口量成逐年递增的态势“。另外， 新西兰也是一个成功的例子。新西兰大量发展柿子的主要目的之一是向日本出口，利用季节 差来占领日本的柿淡季市场。近年来，柿子在新西兰得到了迅速发展，栽培面积有1 0 0 多 公顷( 1 9 8 8 年统计) ”1 ，且在不断扩大，可持续的发展战略保证了新西兰果品业的健康发展。 同样，我国的柿子生产也面临着新的发展机遇，理由至少有以下两点： 其一，欧、美等农业人国基本不产柿子或产量很小，而日本由于劳动力昂贵柿子的价格 很高，在我国的农产品大门打开之后，也不会给我国的柿子生产带来冲击。相反，我们完全 可以利用世界农产品市场也对中国开放之机，把我们的柿子打进国际市场。 中国农业大学硕上学位论文 第一章绪论 其二，多年米苹果、葡萄等水果的大量生产，使得柿子的地位有所下降。中国加入w t o 后，许多鲜果会从国外大量涌入，而原米不被看好的柿子会重新受到重视。近2 3 年，柿 子价格稳中有升，使许多果品产区将柿子作为重点果树扶持品种而迅速扩大栽培面积。尤其 是随着人们消费水平以及对柿子营养价值认识的提高，再加上人们对果品多样性的追求，也 使得柿子的地位开始大大提高。 因此，鉴于我国柿子生产的传统优势及加入w t o 后国外水果对我国果品市场可能带米的 巨人冲击，提高对柿子栽培与生产的重视是解决这一矛盾的重要出路之一。这一点已经引起 了有关部门的重视，不论在政府部门对柿科研的扶持力度上，在柿栽培高新技术推广上，还 是在柿农的生产积极性上，以及多年米柿子连续的人幅度增产上，均可以看到人们对柿子生 产的重视程度在不断的提高，这也是我国果品业发展的一个垂要方向”。 1 2 柿子的营养保健功能 据世界一p 生组织公布的最佳食品榜，柿子作为一种健康食品而位居前列。随着人民生活 水平的不断提高，柿予的保健作用也越来越为人所认识。据报道，每1 0 0 克柿果肉中含有 v c 4 9 7 2 m g ，是葡萄果实( 1 0 7 2 m g g ) 的l o 倍以上，蛋白质0 7 9 ，脂肪01 9 ，碳水化合物 1 1g 钙l o m g ，磷1 9 m g 、铁0 2 m g 等“1 ，是名副其实的保健食品。中医认为柿子可入药，柿果 能润肺、清热、化痰、止咳、解酒“”，具有较高的医疗价值。随着柿树在世界范围内广泛栽 培，近年来世界各地的科学家也对柿果及其各种成分做了大量研究。并做出了积极的评价。 k a t s u b e 认为”动脉粥样硬化的过程中，柿中的多酚物质能明显减少低密度脂蛋白的氧化， 可有效预防和治疗动脉粥样硬化；同时柿中单宁物质可有效清除体内自由基，抑制癌变过程 ”“。k a w a s e 报道”“，柿皮提取物对艾滋病病毒有很强的抑制活性，并且可阻l r 癌细胞增殖。 柿子除了具有抗肿瘤、抗病毒活性外，在预防和治疗常见疾病一l 也有一定的功效。柿叫中的 类黄酮提取物可有效抑制过敏性皮炎病人体内组胺的释放，减轻过敏症状”“。食用柿子可以 降低发烧病人体表温度，减少病人痛苦”“。另外，柿子作为一种良好的膳食纤维源，对丁促 进人体脂类代谢、预防脂类代谢紊乱性疾病有积极的功效”。可见，柿子不仅营养丰富而 且有较高的药用价值，为柿子产品的开发创造了有力的条件。 1 3 柿子的加工研究现状 当水果业发展到一定程度时，单靠鲜食很难完成水果的消化，必须通过h i _ 1 5 来转化。从 国外水果业的发展过程来看，到发展中后期，都特别注重水果的深加工。如韩国的柑橘、日 本的苹果及法国的葡萄，其加工比例均超过产量的3 0 ，而i ；i 前我国水果的加工比例不足1 0 ， 加工技术落后，加工品种单，适合加t 的水果品种较少等问题比较突出”“。由于柿子近年 来产量的迅速增加、以及柿果不易贮藏的特点，其深加工的问题亦就日益突出，成为了目前 凼扰柿子发展的主要阻力之一。因此对柿子资源的合理开发就成为了当前工作的莺中之重。 柿子的采后加工在我国有近千年的历史，主要是制成柿饼以各粮食不足时之需。现在， 随着人们对柿子中各种成分的进一步了解，以及加工水平的不断提高，对柿子的加工也警现 2 出了多样性的特点。 目前，柿子主要是作为食品和药品的原材料。作为食品，随着人民生活水平的提高，各 生产厂家和科研单位对柿子的采后加工越来越重视，市场上也出现了各种各样的柿子自h j l 产 品。目前除柿饼“外，柿子加t 产品有柿酒”、果丹皮”、柿醋”“、柿糕冻1 、柿汁”“、 果脯”、柿叶茶。”等，可以说柿子加工产品是各类水果加上制品中种类较齐全的一种水果。 但是，大多数柿子加工产品质量差、档次低，科技含量不高。作为药晶，由于柿子中各种成 分功效研究较为明确，所以在日本，从柿子中提取柿涩、单宁、膳食纤维作为药品已比较普 及。而在我国，以柿为原料加工成药品的只有柿蒂“5 、柿霜”等一些传统中药成分，对柿 子的药物开发还处于原始阶段。除食品和药品外，对柿子的其他利用方式和产晶也有见报道。 柿柒是一种青柿液的发酵产物，在日本已经部分取代了化工类涂料，属于新一代的环保产品 ”。柿树由于油脂类物质含量高，以其提取物为原料发酵生产燃料，也是可持续发展的一 个重要方向“。随着研究的不断深入，有关柿加工产品的报道肯定还会层出不穷。 在我国，由于整体科技水平比较落后，人们并没有重视柿子资源的开发，因此在现阶段 比较可行的加工方向是柿子在食品上的开发和利用。在上述诸多食品产品中，综合饮食习惯、 产品档次、保健价值、人们收入水平等因素来看，柿果酒是晟有开发前途的一种产品，这一 点不论从市场中商品的数量和质量，还是从科研中论文”。“的质量来看，都是无可非议 的。 1 4 柿子果酒的生产概况 1 4 1 柿子果酒的发展现状及存在的问题 用水果发酵酿酒，在中国有着悠久的历史。据有关文献记载，从汉唐至明清，中国的果 酒生产不仅绵延不绝从来中断，而且种类繁多。除传统的葡萄酒、枣酒外，近年来桑椹洒”、 柑桔酒“、梅子酒”“、石榴酒“、樱桃洒”“、梨酒“、草莓酒1 、苹果酒”“1 、柿子酒1 “ 。5 ”等果酒的酿造均有报道。 果酒的酿造技术虽然早在汉朝就由曲域传入中国，但它的产业化生产技术，只是到了近 代才从西方传入的。究其原因，水果种类繁多，各种水果的营养成分差另i j 很大；每一种果洒 的发酵条件都有较大区别：因此，果酒发酵的产业化生产技术比白酒要复杂得多。由于我国 近代工业基础、食品科技水平的落后，近儿十年来，我国不少单位虽然努力研究果酒产业化 生产技术，但除葡萄酒外，至今其它水果发酵酒的产业化生产技术还是不够成熟。随着农业 规模化、产业化生产在西方国家的形成，各种水果发酵滔的研究和产业化生产在国外也取得 很火进展。目前，苹果酒”、梨酒“5 9 】、柿子酒”1 等大宗水果发酵酒的初始研究均已完成， 有的已开始了大规模的产业化生产。比如，我国苹果生产大省山东省花巨资从美国引进了苹 果发酵酒的生产技术和成套设备，准备大规模生产苹果酒，其他一些果洒的生产线也在积极 引进之中。 与其他种类果酒产品相同，相对于柿子其他加工产品，柿子酒是一种上档次、有质量的 保健饮品，柿子酿酒应该是柿子产业化开发的一个重要方向。所以近年来人家对柿子酒的酿 3 制比较重视，有关报道也是屡见不鲜。由于柿子主要产于东亚，即中国、日本和韩国，柿子 酒也仅限于东亚生产。目前，只有日本酿制柿发酵酒的技术比较成熟一，柿酒在日本酒市 场上r 有固定的份额。柿子发酵酒在果酒酿造技术上属于难度较大的一种。因为柿果含糖量 较低，通常可溶性固形物只有1 4 1 8 ，含有大量的单宁和果胶物质，且缺少葡萄、苹果等 果实中所具有的构成果酒品质特性的各种有机酸而曾经被认为不能制作发酵酒。我国自7 0 年代开始研制柿子发酵酒，然而由于在柿子酒生产工艺、生产设备、菌种质量方面尚不够成 熟，所生产的柿子果酒颜色过深、或过氧化味浓，涩味过重，缺少香气或口感很差，总之是 难于被广人的消费者接受，所以不能大批量生产。至今，我国的酒市场上很少见到柿发酵酒， 也就谈不到过硬的品牌。国产柿子酒在市场上还基本是一个空白。不过，近年来包括本实验 室在内几家科研单位对此难题在一定程度上予以攻克”，解决了柿子酒颜色过深、涩味过重 的难题，但是对于柿子酒缺乏香气的难题，还有待于进一步的研究。 1 4 ，2 柿子果酒香气改善的主要对策 柿子发酵酒酿造j 二艺同其他果酒类似，是以柿子为原料，通过添加的或是白然存在的酵 母菌的生理代谢作用发酵产生以乙醇为主、以酯、酸等次级代谢产物为辅的代谢产物，优质 的柿子酒香气怡人、质地净爽、回昧深比。柿子酒的香气由多种因素决定，可以从不同方面 对其风味品质进行改良，但是原料在有限范阐的条件下，酵母的质量优劣就成为了柿子果酒 产品好坏的关键，只有在此基础之上，一l 艺的改进才更有意义。因此，鉴于目前的研究水平 和工艺条件，改善柿子酒香气的关键在于筛选优良的产香酵母，这也成为了本实验的关键。 一般来说，果酒的香气由以下几个冈素所决定。 1 、柿子品种 试材品种对于其他水果果酒酿制过程中影响风味的是最为重要的一个影响冈素，果实中 高含量的挥发性物质可赋予果酒浓厚的香气。但就柿子而言，无论哪个品种，果香都较为平 淡，因此给柿子酒的酿造带来了较大的困难。磨盘柿是华北地区的主栽品种，就果香而言， 和其他品种相比，有一定的优势，而且以它为研究对象对解决本地区的柿子采后加t 问题 有一定的意义。 2 、酵母菌种 酵母菌是被人类认识最早、研究最广泛并与人类关系十分密切的微生物。酵母菌种的性 能直接影响发酵工艺的类型和发酵条件，同时对发酵产品的类型和质每也起着决定性的作 用。同种原料，不同菌种，发酵产生的酒的品质、发酵副产物、风味等方面都有一定的差异。 酒类酵母主要分为酒精酵母、生香酵母、威士忌酵母等，其中生香酵母有较好的产有机酸及 其酯的能力，在发酵中可以提高果酒的有机酸和酯的含量，增进酒的香味，是提高酒质量的 有效途径”。目前，我国酿制的果酒除比较成熟的葡萄洒外，大多数都采用活性干酵母( a d y ) ”4 “。活性千酵母是经种子罐、酒母罐的逐级放大培养，最后经过离心分离、真空过滤或压 缩，再经制粒机制粒的酵母颗粒”。a d y 通常为酿酒酵母属，主要可分为啤酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、葡萄酒酵母( s a c c h a r o m y c e se l l i s o i d e n s ) 等，它们大多有着较强 的产酒精能力，但发酵酒风味比较平淡、缺乏香气。目前有些厂家也开发出了一些增香酵母， 4 中困农业大学硕士学位论文 第一章绪论 但由于其针对性不强、品种比较单一，还难于满足各种果酒的酿造要求。因此，使用a d y 酿造的柿子果酒质量不高，缺乏典型性的果香，是目前困扰柿子酒发展主要障碍。而在国外， 果酒的酿造大多使用企业实验室的保藏菌种。这些菌种都是由自然界基质中分离得到的，对 每种水果都有较强的针对性，因此所酿果酒香气浓郁，非常典型，能反映水果自身的特点。 鉴于以上考虑，为了得到能满足柿子酒产香要求的酵母菌株，本实验拟从与柿子生长环境密 切相关的果园十壤和水果上分离酵母菌，这不论在理论上，还是在实践中都是可行的。针对 柿子果实香气淡雅的特点，所筛选的酵母菌要求有较好的产香性能。产香酵母一般指在酿造 中应用的能较明显改善产品香气的非酿酒酵母( s a c c h r o m u c e sc e r e v i s i a p j 。直到近些年，其潜 在的能力才引起人们的关注并被开发利用。一些研究表明，这些非酿酒酵母属的酵母会对果 酒的总体风味产生积极的影响，它们能生成很多的芳香物质和特别的风味成份，使酒的风味 特征明显改善。而酵母产生的风味物质的种类和数量也随其种属的不同而异，不同的产香酵 母会赋于酒不同的风味特征”。果汁自然发酵的时候，这些非酵母属的酵母会在 发酵的早期活动，随着酒精浓度的升高，这些酵母的活性受到抑制，而酿酒酵母活力增强占据 了发酵的主导地位。采用产香酵母作为菌种进行发酵生产时应与耐酒精能力强的酵母，如酿 酒酵母等联合使用，才能保证发酵彻底。产香酵母在美国和澳大利亚正越来越多的用丁葡萄 酒的生产，在一定程度上弥补了以前采用单一酿酒酵母造成的酒味平淡的缺陷，而且不同产 香酵母的风味特征各不相同，也使生产的葡萄酒具有特定的风味”“。国内对果酒产香酵母的 研究较少，李剑芳等从自然发酵的猕猴桃汁中分离得到一株产香酵母为柠檬形克勒克氏酵母 ( k j o e c k e r aa p y c u l a t a ) ，耐酸能力强且能改善猕猴桃汁的品质”“。用于白酒生产的生香酵 母，我国研究和应爿j 较多，大多为产膜酵母和假丝酵母，是白酒和黄酒发酵产香的重要菌种 “。可见，产香能力优良的酵母是生产优质果酒的前提条件，本实验即以分离、筛选优良的 产香酵母为主要目的，使筛选酵母在尽量具备一般果酒用酵母的基本条件的情况f ，着重突 出酵母的产香能力，以改善现有柿子果酒的品质。 3 、酿造工艺 果酒的酿造二 艺对于果酒的品质有着重要的影响，其中对于发酵期的控制、s o 瘸i 加量、 发酵温度的变化等因素都会改变果酒的风味。一般来说，以下3 方面可能会对果酒风味的影 响更为明显一些。 发酵温度对果酒风味的影响 发酵温度对果酒质量的影响甚大，温度较高时会导致香气成分挥发，同时会引起挥发酸、 醛类等副产物增大，使酒的的风味劣化。另外，较高的发酵温度还使酵母迅速老化，造成发 酵困难；相反，低温发酵酿成的果酒酒香浓郁，入i ：3 细腻柔和3 。荧惠芳”等认为将发酵 温度控制在2 0 。c 左右可有效防止果酒产酸，而且也有利于减少氧化”。 初始p h 对果酒风味的影响 有机酸是酒香味物质的组分之一，既是重要的成味物质，也是酯类合成的前体。李华认 为”“酸是影响葡萄酒，特别是干型葡萄酒感官质量的主要因素之一。对所有红葡萄酒，较低 的酸度是酒体柔和、圆润的最基本的质量因素，酸度过高，则果酒会有刺激性酸味。同样， 柿子果酒的酿造也有同样的问题，较低的酸度对丁保持酒香有着积极的作用。 菌种及加菌工艺对果洒风味的影响 5 串雷表业大学硬土学娥论文第一章绪论 如前所述，使用不同的菌株可赋予果酒不周的风味，且对发酵性能也有明显的影响，因 魏应有选择的加敷镫蠲。蓝磐，每一拣藩都存箕钼对局陵往，鲡能结合不瓣靛t 艺条件混会 使用，可能会收到良好的效果。相对来说，此因素对果溺的香气改善的潜力最人。发酵温度 馥蛸篷对于酿造工笼寒巍较荔竣变，作瑁夔毪鞍明显，毽这两个鞘素改蒜潜力毙较，l 、，已 经基本被现有果酒生产厂家接受和掌搬。而自然界的酵母资源是无穷的，讽过不断的分离筛 选$ h 应用，可能会在技太程度上提赢粜渣的品蠖。本实验鄹在对务筛选菠株发酵性状全西了 解的基础之上，采崩不同触发酵工艺进行混菌袋酵，以充分利用筛选酵母的产香性能和酿酒 酵母的产酒精能力，从而在定群度上改善现有柿子果洒的品质。 1 5 酵母育种研究进展 一般来说，从自然界分离筛选得到的菌株，不宣直接投入到上业生产中。要想使菌种的 生产性状有较大幅度的提高和明显的改善，可以通过现代化的育种手段来进行菌种选育。应 用较为广泛的有诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因克隆和转化技术。诱变育种采用， 如亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外线1 、y 一射线、重离子辐射”“等理化因素对酵母菌株 进行处理，然后从中筛出正突变的菌株。睡l 诱变具有随机性，而筛选则是定向的，因此筛选上 作显的尤为重要，一个高效的筛选方法使育种的成功率和效率都大大提高了，否则如大海捞 针，事倍功半。从方法上讲。它具有简便易行、条件和设备要求较低等优点，故至今仍有较广 泛的应用“。杂交育种是选用已知性状的供体菌和受体菌作亲本，网此无论在方向性还是自 觉性方面均比诱变育种前进了一大步，另外利用杂交育种往往还可消除某一菌株在经历氏期 诱变后所山现的产量性状难以继续提高的障碍，因此是一种重要的育种手段。杂交育种可以 在异宗结合型酵母的单倍体细胞之间进行，方便而易行，但生产菌株人多为同宗结合犁，所以 此法的应用受到限制，但曾成功用于嗜杀酵母和s 魄抗性酵母之间的杂交1 ；也可以直接在同 宗结合型酵母的孢子和异宗结合型酵母的单倍体细胞之间进行，t h o r n t o n 在1 9 8 2 年完成 的强发酵活性酵母与s 0 z 抗性酵母的构建”“；最为常见的是同宗结合型酵母的孢子之间进行 的杂交，操作程序较复杂，因为果酒酵母人多是同宗结合型的酵母，所以这种形式应用最为广 泛。女h r o m a n o 等于1 9 8 5 年曾将一株絮凝性强的酵母与一株不产s 0 2 的酵母杂交获得了既不 产s o z 同时凝聚性也较强的酵母用于葡萄汽酒的生产”1 ，1 9 9 9 年r a i n i e n 等用筛白乳清的酿 酒酵母与葡萄汁酵母为亲本进行杂交，获得的杂合子同时具有两个亲本的优良特性，即分解 苹果酸的能力强和生成乙酸能力弱”。原生质体融合技术在育种工作中研究较多，成绩显著 在某些例子中其重组频率可达1 0 一。国内曾报道用酿酒酵母和克鲁维酵母进行属间原生质体 融合，获得了在4 5 下能进行酒精生产的融合子1 ，杜金化等采用核融合缺陷原生质体融合 技术将供体菌5 0 4 5 中和的嗜杀质粒转移到苹果酒酵母a w 中，得到了具有嗜杀活性且发酵性 能良好的果酒酵母，高玉荣等利用原生质体融合技术得到用于葡萄酒降酸的酵母”1 。 上述这些传统的育种技术曾选育了一大批优良的生产菌株，但缺乏精确性，在很多情况 下一些不良的性状也随着我们想要的性状起进入杂合子中。而基因工程技术是一种自觉的 可人为操纵的体外重组技术，可以用特定的酶，准确的获取目的基因，将目的基冈导入受体细 胞中得以表达，既不带入不想要的性状也不改变受体细胞已有的性状。从而，突破了上述方法 6 的局限性。近些年来，此项技术已用于粜酒酵母的改良，分别在果酒酵母发酵性能的提高、果 溪的澄清能力靛增强、果滔菇睬的饶德、采滔酸度赫调熬帮嗜蓉鞠子的导入等方蠢获褥一系 列基因工榴菌。如l i l l y 镎在2 0 0 0 年饿乙酰转移基因在酵母中高效表达，姒求k 时间保持果 溅秘鑫兰媳孛的巢黉气味”、又絮d e q u i n e t o u 等在1 9 9 9 年将于懿巍抒莛瓣乳酸残氯酶基因 导入酿酒酵母中，促进果汁中的葡萄稀向乳酸转化以解决p h 过高的果汁的酸化问题。通过 这些基因工程萤株的钩建，我们可以番出将一些优异舱酿滔性状的基因找到，并转入粜洒酵 母中是完全可行的。但基因：程技术厢于酵母的育种仍她在基础研究阶段，随着分子生物学 技术的发展，酵母d n a 测序的完成，酵母作为外源基冈受体和其载体系统的完善，酵母的遗传 蠢稃l 二律赫将褥到广泛焉实鹰经静发畿帮应蠲。获而，健许多酿灞生产中衽在盼闻聪歇根本 上得以解决，果酒品种日揣丰寓多彩，特征更加突出，品质更加优良，全面促进国际酿酒工业 豹发展。 1 6 论文主要研究内容 鉴于目前市场上现存柿子果酒存在的问题，本研究着重以增强柿子果酒的香气为主要目 的，通过从果园土壤和水果皮中分离、筛选生香能力强的酵母及应用混菌发酵工艺以解决柿 子果酒缺乏香气的难题。具体实验内容如下： 1 、从柿果园土壤及各种水果皮上分离酵母菌； 2 、根据柿子果酒的酿造要求，对所分离的酵母菌进行筛选； 3 、参照国际通用酵母菌鉴定方法，对筛选得到的酵母菌鉴定到种。 4 、测定筛选菌株的生物学特性； 5 、应用筛选菌株，结合混菌发酵优化柿子酒的发酵j - = 艺。 7 第二章柿果酒酵母菌的分离和筛选 大量研究表明，酿洒用酵母多分布于水果的果皮及果梗处”1 。此外，在富含水果残渣 的果园十壤中也有大量的酵母分布。本实验依酵母的分布规律，以水果皮及柿果园土壤为分 离源，利用不同的分离条件扩大样本最，分离酵母菌；为了得到能够满足果酒生产要求的酵 母菌株，缡合柿果酒自身的特性，本实验对分离得到的酵母菌株以三个级别进行筛选，并着 重强调了酵母菌的产香能力，从而保证筛选得到的菌株所酿果酒既能满足一般柿子酒的酿造 要求，义有较浓郁的香气，以满足消费者的需要。 2 1 柿果酒酵母菌的分离 2 1 1 材料与仪器设备 21 1 1 酵母菌分离源：河北省保定市满城县柿果园十壤； 北京、保定两地市售新鲜及腐败柿、苹果、梨、桃等水果。 211 2 试验菌种及来源 试验菌种：分自果皮及果园土壤的酵母菌株。 2 11 3 培养基 ( 1 ) 富集培养基 分别含0 - 1 2 ( 以1 乙醇为一个梯度，每个处理酒精浓度依次增加) 乙醇的麦芽汁( 1 0 9 b r i x ) 、豆芽汁( 取1 0 9 黄豆芽，加1 0 0 r a l 水，煮沸、f 小时后纱布过滤，加入5 蔗糖， 自然p h 值，待用) 、y p d 培养基( 葡萄糖2 0 9 、蛋白胨1 0 9 、酵母浸膏1 0 9 、水1 0 0 0 m 1 ) ； p i 分别为2 ，3 ，4 ，5 ，6 的麦芽汁( 1 0 。b r i x ) 、豆芽汁、y p d 培养基。 ( 2 ) 分离培养基：麦芽汁( 1 0 。b r i x ) ，自然p h 值。 ( 3 ) 酵母菌保藏用培养基：麦芽汁琼脂培养基分离出的菌种保存在麦芽汁琼脂培养基试 管斜面上，每隔一个月转接一次。 ( 4 ) 原麦汁：购自保定市京苑啤酒有限公司，1 3 。b r i x o 2 1 14 主要仪器设备： l r h 一2 5 0 a 型生化培养箱，广东省医疗器械厂； d l c j 2 n 医用型洁净工作台，哈尔滨东联电子技术开发公司i y x q 一$ g 4 6 2 8 0 s 不锈钢手提压力灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂； p hh j 0 1 3 型p h 计，北京海淀航天计算机公司； o m p 2 0 0 a 型分析天平，上海第二天平仪器厂； o l y m u p u s 显微镜，o l y m u p u sc o l t d ； w t 0 8 0 型手持折光仪等。 8 中周农业大学硕士学位论文 第二章柿果酒酵母菌的分离和筛选 2 12 方法 2 12 1 酵母菌分离样品的采集 从各个果园十壤基质中采用随机取样原则收集十壤样品，十样装入灭菌纸袋中，贮存于 冰箱中备用；果皮则分批取用，取至果实腐烂为止。 2 122 酵母菌的分离 菌种分离方法：采用不同的培养基种类、酒精浓度、培养温度、p h 值对酵母菌进行分离， 以尽量扩大样本量。富集、分离条件如下所述： ( 1 ) 取适量样品分别加入到已灭菌的分别含0 - 1 2 ( 1 为一个梯度) 乙醇的麦芽汁( i 0 6 b r i x ) 、 豆芽汁、y p d 培养基中，自然p i 值，于生化培养箱中3 0 。c 培养； ( 2 ) 取适量样晶分别加入到已灭菌的p h 分别为2 ，3 ，4 ，5 ，6 的麦芽汁( 1 0 9 b r i x ) 、豆芽 汁、y p d 培养基中，丁生化培养箱中3 0 。c 培养； ( 3 ) 取适最样品分别加入到已灭菌的麦芽汁( 1 0 。b r i x ) 、豆芽汁、y p d 培养基中，自然p h 值，分别于1 5 c 、2 0 。c 、2 5 。c 、3 0 、3 5 c 、4 0 。c 条件下生化培养箱中培养。 每2 4 小时观察一次，镜检，观察有无活菌存在，若有则取l m l 接入麦芽汁同体平皿中 3 0 。c 培养2 3 天，待长出茁落后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线分离 2 3 次，经镜检为纯种后分别转入麦芽汁固体斜面，低温保存，菌种以阿拉伯数字1 、2 、3 依次编号。 2 1 3 酵母菌的分离结果与讨论 从不同地区不同地点共采集样品2 5 份，从中共分离得到酵母菌1 2 2 株，其中来自果园 十壤的酵母4 6 株，来自水果的酵母7 6 株。分离酵母结果见表2 - 1 。 表2 - l 酵母菌分离结果 从分离结果可看出，水果皮上，尤其是腐烂的水果皮上酵母菌种类和数量较多，从6 - 1 2 9 酒精浓度的麦芽汁中均可分离出酵母菌，可见分离到的能耐高浓度酒精的菌株也多；土壤中 由于菌相复杂，含有的细菌、霉菌等微生物种类较多，但分离到的酵母菌数量相对较少，且 多是由卜5 酒精浓度的培养基中分离得到，所以能耐高浓度酒精的酵母菌株数量可能也比 较少。这与前人的报道，果酒用酵母多分离于与果实有关的环境是一致的“”。 2 2 柿果酒酵母菌的筛选 2 2 1 材料与仪器设备 2 ，2 1 1 试验菌种及来源 试验菌种：分自果皮及果园土壤的酵母菌株； 2 21 3 培养基 ( i ) 原麦汁：购白保定市京苑啤酒有限公司，1 3 ”b r i x 。 ( 2 ) 酵母菌保藏用培养基：麦芽汁琼脂培养基，分离出的菌种保存在麦芽汁琼脂培养基试 管斜面上，每隔一个月转接一次。 ( 3 ) 柿汁培养基：柿子打浆后，加入等体积的水，调糖至1 5 。b r ix 。 2 2 1 4 主要试剂：偏重亚硫酸钾、乙醇( 分析纯) 、果胶酶( 法国进口分装) 2 21 5 主要仪器设备： l r h 一2 5 0 a 型生化培养箱，广东省医疗器械厂； d l c j 2 n 医用型洁净工作台，哈尔滨东联电子技术开发公司； y x q s g 4 6 2 8 0 s 不锈钢手提压力灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂； p h i t j 0 1 3 型p h 计，北京海淀航天计算机公司； o m p 2 0 0 a 型分析天平，上海第二天平仪器厂； o l y m u p u s 显微镜，o y m u p u sc o l t d ； w t o 一8 0 型手持折光仪等。 22 2 方法 为得到符台柿果酒酿造要求的优良菌株，将所分离到的酵母菌分3 个级别进行筛选。 ( 1 ) 酵母菌的一级筛选 采用杜氏管发酵法，在相同的培养条件下，测定酵母菌株产气泡的快慢及在规定时间内产气 泡的多少，初步比较各株酵母苗的起酵能力和发酵能力，初筛出发酵性能优良的酵母菌株。 试验平行重复三次。 菌株活化条件：2 8 c 于8 b r i x 的麦芽汁中振荡培养1 0 小时。 发酵条件：2 86 ct - l o m l l 3 。b r i x 的麦芽汁中静止发酵4 8 小时。 接种量：1 1 0 。个m l 。 ( 2 ) 酵母菌的二级筛选 采用柿汁取代麦芽汁发酵，在果胶酶的作用下，柿子打浆取汁，放入三角瓶内，同时，菌种 1 0 中国农业人学硕士学位论文 第二章柿果酒酵母菌的分离和筛选 经活化制种后也接入三角瓶，在相同的条件下进行发酵，经7 天后采用蒸馏法比较各菌株产 酒精能力的人小，从而较一级筛选更进一+ 步确定实验菌株的发酵能力。发酵7 天后感官评定 其风味。试验平行重复三次。 菌株活化条件：2 8 。c 丁8 。b r i x 的麦芽汁中振荡培养1 0 小时。 发酵条什：2 8 。c 于1 5 。b r i x 的柿汁中静止发酵7 天。 接种量：1 1 07 个m l 。 ( 3 ) 酵母菌的三级筛选 采1 f ； j 杜氏管发酵法，将酵母菌分别接入含不同乙醇浓度( 8 、1 0 、1 2 、1 4 、1 6 、1 8 ) 和不同s 0 z 浓度( 6 0d d m 、8 0p p m 、1 0 0p p m 、1 2 0p p m 、1 4 0d d m 、1 6 0 p p m 、1 8 0p p m 、 2 0 0 p p m ) 的麦芽汁中，在相同条件f 进行培养，观察杜氏管中的气泡产生情况，比较各酵母 菌株对乙醇和s 0 2 的耐受程度，进一步确定适合柿果酒酿造的菌株。试验平行重复三次。 菌株活化条件：2 8 。c 于8 。b r i x 的麦芽汁中振荡培养1 0 小时。 发酵条件：2 8 c 于l o m l l 3 b r i x 的麦芽汁中静止发酵9 6 小时( 由丁乙醇或s 嘎的存在，对酵 母菌的发酵在不同程度上会产生抑制作用，故产气观察时间延长为9 6 小时) 。 接种量：1 x 1 07 个m l 。 2 2 3 结果与讨论 223 ，1 酵母菌的一级筛选 杜氏小管产气情况见f 表 表2 2 毒土惩巾警产气情稼 注：“十”表示产气鼍绮等于挂氏小管体拱的l ，3 ，“”袭暴产气量均等于挂魁小管体秘的2 3 ，“+ ”表示产气量约莓乎撞氏 士善体积。 由上表可以看出，酵母菌在含有杜氏小管的试管中，2 8 。c 发酵4 8 小时，能产气达别约 等丁杜氏小箭满体积的酵母菌有1 6 株。说明这些酵母菌趟酵能力比较强，并且可能有较高 救发酵瘦和发酵效率。露檄据经验，在2 天出产气量未达鞋氏管满体织的酵母篷，奠发酵 度一般不糍满足采滔的酿造簧求，鼓在筛选进程中应蒋萁台弃。发酵结策螽，打开褊塞撼动 试管，有些菌株发酵液能嚷到淡淡的酒香，说明这些菌株可能有较强的产香能力，为进步 中国农业大学硕士学位论文 第二章柿果酒酵母菌的分离和筛选 的筛选生香酵母提供了保证。而且，其中有儿株酵母菌起酵时问很短，只有8 小时左右，发 酵产气量也比较大，为筛选发酵能力强的酵母创造了条件。另外，有2 株酵母菌虽然产气能 力较差，但其发酵液能嗅到明显的香气，因此也作为下一步筛选的菌株。将这1 8 株酵母菌 作为山发菌株进行二级筛选。 2 23 2 酵母菌的二级筛选 将级筛选得到的1 8 株酵母菌分别接种到盛有2 0 0 m 1 1 5 b r i x 的柿汁的三角瓶中，于 2 8 发酵7 天，测定其酒精度，并进行感官评定。二级筛选是在一级筛选的基础之上进一步 比较各菌株的发酵