（分析化学专业论文）溶解氧型酶生物传感器的研制及分析应用.pdf

摘要 摘要 第一章：本章对生物传感器的概念、基本组成、工作原理、分类、特点 及各种类型传感器的研究进展进行了综述。 第二章：本章以戊二醛为交联剂，将葡萄糖氧化酶共价交联固定于鸡蛋 壳膜载体上，再将固定有酶的鸡蛋壳膜紧贴于氧电极表面制成葡萄糖生 物传感器，并对最佳实验条件、电极的响应特性、可能存在的干扰物及 实际样品进行了考察。实验结果表明，酶的固定化及样品测定的最佳实 验条件为：交联剂戊二醛浓度为2 5 ，底液磷酸缓冲溶液浓度为2 0 0i i l 【， p h = 7 ，实验温度为室温。该传感器的平均响应时间为1 0 0 秒，葡萄糖浓 度在1 o 1 0 一1 3 1 0 刁m 0 1 几间呈良好的线性关系( r = o 9 9 7 5 ) ，检 出限为o 5 1 0 。5 m 0 1 几，r s d 为3 2 6 ( n = 7 ) ，连续使用4 个月后，响 应值降为初始值的8 5 2 。实际样品中可能存在的干扰物对测定无干扰。 对葡萄糖注射液、葡萄酒和人血浆样品中葡萄糖的含量进行了测定，并 与葡萄糖试剂盒法测定的结果进行了对照。结果表明，此传感器具有操 作简便，干扰少，检测速度快，使用寿命长等优点，对于食品和临床的 葡萄糖检测具有重要的意义。 第三章：本章以戊二醛为交联剂，将葡萄糖氧化酶和葡糖硫苷酶以一定 比例固定于鸡蛋壳膜载体上，再将固定有酶的鸡蛋膜紧贴于氧电极表面 制成硫代葡萄糖苷酶生物传感器。并对最佳实验条件、电极的响应特性、 可能存在的干扰物及实际样品进行了考察。实验结果表明，酶的固定化 及样品测定的最佳实验条件为：葡糖硫苷酶与葡萄糖氧化酶的比例为 6 ：1 ( 质量比) ，底液磷酸缓冲溶液浓度为5 0 i 【l m ，p h = 6 ，实验温度为室温， 激活剂抗坏血酸的最佳浓度为o 4i i i l o l l 。该传感器的平均响应时间为 1 0 0 秒，硫代葡萄糖苷浓度在2 5 1 0 一7 5 1 0 4 m o l 几问呈良好的线性 关系( r = o 9 9 7 5 ) ，r s d 为4 1 5 ( n = 6 ) ，连续使用3 个月后，响应值 仍为初始值的8 5 以上。实际样品中可能存在的干扰物对测定无干扰。将 该方法成功应用于食用蔬菜籽、传统中草药样品中硫代葡萄糖苷含量的 v i i 山西大学2 0 0 5 届硕士圳宄生学位论文 测定，并进行了回收实验，回收率在9 0 一1 1 4 之间。 第四章：本章研究了以戊二醛为交联剂，将葡萄糖氧化酶在鸡蛋壳膜上 进行固定化的机理以及抗坏血酸对葡糖硫苷酶激活作用的机理。 第五章：本章将荧光分光光度仪用作传感器的检测器，组建了荧光传感 装置，利用表面活性剂吐温一6 0 对固定于聚氯乙烯( p v c ) 膜中的四苯基卟 啉( h 2 t p p ) 可逆的荧光增强作用，研制成测定吐温6 0 浓度的荧光化学 传感器，并初步考察了该传感器的传感机理和响应行为。 关键词：生物传感器，葡萄糖酶生物传感器，硫代葡萄糖苷酶生物传感器， 鸡蛋壳膜，葡萄糖氧化酶，葡糖硫菅酶，光化学传感器，吐温一6 0 ，四苯 基卟啉 a b s t r a c t a b s t r a c t c h 印t e rl ：b i o s e n s o r s a r ea n a l y t i c a ld e v i c e sc o m p o s e do far e c o g l l i t i o n e l e m e n to fb i o l o g i c a l o r i g i n a n dap h y s i c o c h e m i c a lt r a l l s d u c e r t h e b i o l o g i c a l e l e m e n ti s c a p a b l e o f s e n s i n g t h e p r e s e n c e ，a c t i v i t y o r c o n c e n t r a t i o no fac h e m i c a la r l a l y t ei ns 0 1 u t i o n t h e c o n c e p t i o n ， b a s a l c o n s t i t u t i o n ，p r i n c i p l e s ，t y p e s ，c h a r a c t e r i s t i ca n dr e s e a r c hs t a t u so f b i o s e n s o r s a r er e v i e w e d c h a p t e r2 ：a9 1 u c o s e b i o s e n s o ru s i n ga ne n z y m e - i m m o b j l i z e de g g s h e l l m e m b r a n ea n do x y g e ne l e c t r o d ef o r 9 1 u c o s e d e t e 加1 i n a t i o nh a sb e e n f a b r i c a t e d g 1 u c o s eo x i d a s ew a sc o v a l e n t l yi m m o b i l i z e do na ne g g s h e l l m e m b r a n ew i t hg l u t a r a l d e h y d e a sa c r o s s l i n k i n ga g e n t t h e 9 1 u c o s e b i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e db yp o s i t i o n i n gt h ee n z y m e i m m o b i l i z e de g g s h e l l m e m b r a n eo nt h es u r f a c eo fad i s s o l v e do x y g e ns e n s o r t h ed e t e c t i o ns c h e m e w a sb a s e do nt h ed e p l e t i o no fd i s s o l v e do x y g e nc o n t e n tu p o ne x p o s u r et o g l u c o s es o l u t i o na n dt h ed e c r e a s ei nt h eo x y g e nl e v e l 、v a sm o n i t o r e da n d r e l a t e dt om eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n t h ee f 先c to fg l u t 甜a i d e h y d e c o n c e n t r a t i o n ，p h ，p h o s p h a t eb u f 凳rc o n c e m r a t i o na n dt e m p e r a t u r eo nt h e r e s p o n s eo fm eg l u c o s eb i o s e n s o rh a sb e e ns t u d i e di nd e t a i l c o m m o nm a t r i x i m e r f b r e n t sd i dn o tg i v es i g n i 矗c a n t i n t e r f e r e n c e t h er e s u l t i n gs e n s o r e x h i b i t e daf a s t r e s p o n s e ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o ds t o r a g es t a b i l i t y t h e l i n e a rr e s d o n s ei s1 o 1 0 一1 3 1 0 _ j m o l lg l u c o s e t h eg l u c o s ec o n t e n t i n r e a ls a m p l e sw a sd e t e m l i n e d ，a n dm er e s u l t sw e r ec o m p a r a b l et ot h e v a l u e so b t a i n e df r o mac o m m e r c i a lg l u c o s ea s s a y k i tb a s e do na s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d c h 印t e r 3 ：ab i o s e n s o rf o rd e t e m i n a t i o no fg l u c o s i n o l a t e s h a sb e e n f a b r i c a t e db ye m p l o y i n gab i e n z y m es y s t e mc o m p o s e do fm y r o s i n a s ea n d g l u c o s eo x i d a s e i m m o b i l i z e do n t o o x y g e ne l e c t r o d ea st h et r a n s d u c e r a ne g g s h e l lm e m b r a n ea n dad i s s o l v e d t h ed e t e c t i o ns c h e m ew a sb a s e do nt h e 些堕查兰! ! ! ! 旦竺! 堡垒竺堂些笙苎 e n z y m a t i c r e a c t i o n so fg 】u c o s j n o l a t e sl e a d i n gt ot h ed e p l e t i o n o ft h e d i s s 0 1 v e do x v g e ni e v e li nt h eb a s es o l u t i o na n dt h e nt h ed e c r e a s ei nt h e o x y g e nl e v e lw a sm o n i t o r e da n dr e l a t e dt ot h eg l u c o s i n o l a t e sc o n c e n t r a t i o n t h ee f 话c t so fb i e n z y m er a t j o ，p h ，a s c o r b i ca c i dc o n c e n t r a t i o n ，p h o s p h a t e b u f f e rc o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r eo nt h e 王 e s p o n s eo ft h eg i u c o s i n 0 2 a e s b i o s e n s o rw e r ei n v e s t i g a t e d s t o r a g ea n dr e p e a t a b i l i t yo ft h eb i o s e n s o rw e r e a l s os t u d i e di nd e t a i l t h ea n a l y t i c a lr a n g eo ft h eb i o s e n s o rw a sf r o m2 。5 1o 一5t o7 ，5 10 - 4m o i 几g i u c o s i n o l a t e sa n dt h et i m et a k e nt or e a c has t e a d y s i g n a lw a sa b o u t10 0s e c o n d s c o m m o nm a t r i xi n t e r f e r e n t s s u c ha st a r t a r i c a c i d ，g i y c j n e ，o x a i i ca c i d ，s u c c i n i ca c i d ，a j a n i n e ，a d j p i ca c i d ，d l c y s t e i n e ， c a l c i u mc h i o r i d ea n ds o d i u mc h l o r i d ed i dn o tg i v es i g n i f i c a n ti n t e r f e r e n c e t h e9 1 u c o s i n o l a t e sc o n t e n ti ns e e d so fc o m m o n l yc o n s u m e dv e g e t a b l e sa n d c h i n e s em e d i c i n a l h e r b sw e r ed e t e m l i n e d ，a n dt h er e s u 】t sw e r es a t i s f a c t o r y c h a p t e r 4 ：0 nt h eb a s eo fp r e v i 叫s e x p e r i m e n t s ， t h em e c h a n i s m so f i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m ea n da c t i v a t i o no fm ”o s i n a s eb ya s c o r b i ca c i d w e r eb r o u g h tf o n v a r d c h 印t e r 5 ：x n o p t i c a l c h e m i c a is e n s o rh a sb e e n d e v e l o p e d f o rh e d e t e n n i n a t i o no ft w e e n 一6 0i na q u e o u ss o i u t i o nb a s e do nt h en u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n to ft e t r 印h e n y l p o i p h y r i n ( h 2 t p p ) i m m o b i l i z e di nap l a s t i c i z e d p o l y ( v i n y lc h i o r i d e ) ( p v c ) m e m b r a n e s e n s o rf o r1 w e e n 6 0i sd i s c u s s e di n s e n s o ri sa l s os t u d i e d t h es e n s i n gp r i n c j p l eo ft h ep r o p o s e d d e t a i l t h er e s p o n s eb e h a v i o r o ft h e k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；g l u c o s eb i o s e n s o r ；g l u c o s i n o l a t e sb i o s e n s o r ： e g g s h e l lm e m b r a n e ；g l u c o s eo x i d a s e ；m y r o s i n a s e ；0 p t i c a lc h e m i c a ls e n s o r ； t w e e n 一6 0 ；h 2 t p p 第一章概论 第一章概论 1 1 生物传感器概述 传感器是一种信息获取与处理的装置。对物质成分传感的器件就是化学传感器， 它是一种小型化的、能专一和可逆地对某种化学成分进行应答反应，并能产生与该 成分浓度成比例的可测信号的器件。而生物传感器是一类特殊的化学传感器，它是 以生物活性单元( 如酶、微生物、动植物组织切片、抗原和抗体、核酸等) 作为生 物敏感基元，对被目标测物具有高度选择性的检测器。它通过各种物理、化学型信 号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应，然后将反应的程度用离散或连续的电 信号表达出来，从而得出被测物的浓度。 最先问世的生物传感器是酶电极。1 9 6 2 年，c 1 a r k 和l y o n s 【】最先提出酶电极的 设想，他们利用葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应，经极谱式氧电极检测氧量的变 化，从而制成了第一支酶电极。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s l 2 j 采用当时最新的方法， 将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面，研制成酶传感器。2 0 世纪7 0 年代中期，人们注 意到酶电极的寿命一般都比较短，提纯酶的价格也比较昂贵，而各种酶多数来自微 生物和动植物组织，因此就自然地启发人们研究酶电极的衍生物：微生物电极、细 胞器电极、动植物组织电极以及免疫电极等新型生物传感器，使生物传感器的类型 大大增多，经过4 0 余年的不断发展，当今的生物传感器技术r 新月异。 1 2 生物传感器的基本组成、工作原理、分类及特点 生物传感器一般有两个主要组成部分：其一是生物分子识别元件( 感受器) ，是 具有分子识别能力的生物活性物质( 如组织切片、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗 体、核酸、有机物分子等) ；其二是信号转换器( 换能器) ，主要有电化学电极( 如 电位、电流的测量) 、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表 面等离子共振器件等。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物( 或 光、热等) 通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析检测 的目的。 生物传感器一般可从以下三个角度来进行分类：根据传感器输出信号的产生方 式，可分为生物亲和型、代谢型和催化型生物传感器；根据生物传感器的信号转化 器可分为电化学型、半导体型、测热型、测光型和测声型生物传感器等；根据生物 山西火学2 0 0 5 届顺士研究生学位论义 传感器中生物分子识别元件上的敏感物质可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传 感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。 与传统的分析方法相比，生物传感器这种新的检测手段具有如下优点： ( 1 ) 生物传感器是由选择性好的生物材料构成的分子识别元件，因此一般不需 要样品的预处理，样品中的被测组分的分离和检测同时完成，且测定时一般不需加 入其它试剂。 ( 2 ) 由于它的体积小，可以实现连续在线监测。 ( 3 ) 响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。 ( 4 ) 传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，便于推广普及。 1 3 生物传感器的研究进展 13 1 酶传感器 酶催化特定底物发生反应，从而使特定生成物的量有所增减。将这类物质的量的 改变转为电信号的装置和固定化酶耦合，即组成酶传感器。酶传感器是牛物传感器 领域中研究最多、最成熟的一种类型。但大多数酶的制备和纯化困难，加之固定化 技术对酶活性影响很大，这就大大限制了酶传感器的研究和应用。为了扩大使用范 围，提高传感器的性能，目前主要的措施有以下几方面： ( 1 ) 多酶体系 双酶或多酶的生物传感器具有以下优点：可实现对混合样品中各个组分的同时 检测；由于工作电位低，生物样品中的一些电活性物质如尿酸、抗坏m 酸等对底物 的测定干扰小。因而，近年来多酶体系在生物传感器的研制中有着广泛的应用。如 c h o i 等”埔4 作的用于测定天冬甜素的酶电极，其分子识别元件由固定在聚( 氨基甲 酰基) 磺化水凝胶上的l 一氨基酸氧化酶和链霉蛋白酶构成。其 作原理是：天冬甜 素在链霉蛋白酶作用下生成天冬氨酸，天冬氨酸作为一种l 一氨基酸可在i 。一氨基酸氧 化酶的催化作用下生成苯基丙酮酸盐、h 。0 。和n h 。+ 。而h ：o 。和n h ，+ 可分别被h ：o ：电极 和氨电极测得，从而可食品饮料中天冬甜素的浓度。d e l v a u x 等 4 将葡萄糖氧化酶和 辣根过氧化酶固定在用巯基乙胺修饰的金纳米管表面，能在很低的工作电压下实现 对葡萄糖的测定，而噪音和来自其它易氧化物质的干扰为最小。 ( 2 ) 电子传递介体的应用 一般的酶部是生物大分子，其氧化还原活性中心被包埋在酶蛋白质分子里面， 第一章概论 它与电极表面间的直接电子传递难以进行。即使直接电子传递能够进行，电子传递 速率也很慢，这是因为分子( 氧化还原活性中心) 与电极表面间的电子传递速率随两 者间距离的增加呈指数衰减。对蛋白质分子而占，当电子给予体与电子接受体之间 的距离从8 a 增加到1 0 a 时，电子传递速率衰减到原值的1 1 0 4 。因此，电子传递介体 的引入能够克服上述缺陷。 目前，所采用的电子传递介体按其固定方法分为三种类型：简单的电子传递介 体、与酶化学键合的电子传递介体、与聚合物共价键合的电子传递介体。按分子结 构特点和分子量大小可分为有机小分子媒介体和高分子媒介体。有机小分子媒介体 主要包括以下几类：二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、四硫富瓦烯( t t f ) 、 富勒烯和导电有机盐等；高分子媒介体主要包括变价过渡金属离子螯合型高分子媒 介体、氧化还原型高分子媒介体、单体聚合型高分子媒介体和包络型高分子媒介体4 种。 简单的电子传递介体，是指电子传递介体在应用中以单体的形式存在，包括氧 化还原电对( 如二茂铁及其衍生物、l ，4 一萘醌、六氰高铁酸盐、苯醌及其衍生物) 和有机导体盐。尽管上述简单的电子传递介体可以在氧化还原活性中心和电极间有 效地传递电子，使生物传感器在响应速度、检测灵敏度、抗干扰能力等方面的性能 得到很大提高，但是，简单的电子传递介体在实际应用中却遇到了一些困难，例如 介体的溶解或部分溶解、介体扩散离开电极表面等。由于介体的流失，使生物传感 器的稳定性和使用寿命受到影响，这就限制了该类生物传感器作为皮下探针在临床 上的应用及长时间进行在线测量( 如发酵跟踪等) 。但是，简单的电子传递介体有不 可替代的优点，即电子传递速度快。对这类电子传递介体的固定还有待进一步研究。 为了防止电子传递介体因溶解等原因而离开电极表面，可以将电子传递介体与 酶进行化学键合。键合后不仅可以更好地固定电子传递介体，而且还可以使酶的氧 化还原活性中心和电子传递介体更紧密接触，更有利于电子传递。将电子传递介体 与酶化学键合后，成功地防止了电子传递介体的流失，使生物传感器的稳定性得到 提高，使用寿命也得到延长。但是，酶经化学修饰后其催化活性降低，这又会使生 物传感器的灵敏度降低。 为了既能防止电子传递介体的流失，又能克服介体与酶键合使酶的活性降低的 缺点，最近几年来，将电子传递介体与合适的聚合物键合的研究取得了很大的进展。 比较典型的例子就是把二茂铁及其衍生物键合到硅氧烷聚合物上。电子传递介体与 聚合物共价键合后，介体不溶于水，也不易扩散而离开电极表面，用它制成的生物 山西丈学2 0 0 5 屈硕士研究生学位论文 传感器在测定时，既不污染样品溶液，又可以提高生物传感器的稳定性，延长生物 传感器的使用寿命。 ( 3 ) 以电化学合成的导电聚合物1 5 。6 和天然有机材料为载体 用电化学方法合成的导电高分子制备的生物传感器具有以下优点：方法简单， 聚合物合成和酶的剧定化可一步完成，并直接固定于电极表面；聚合物膜的厚度和 聚合物上修饰酶的量易于控制和调节，从而可能制备重现性好的传感器；聚合物膜 严格地在电极的有限表面上形成，有利于在微电极和阵列电极上酶的固定化；不少 高分子膜具有选择性透过某些物质的功能，可以降低干扰。目前研究最多的导电聚 合物有聚砒咯及其衍生物、聚苯胺及其衍生物、聚4 乙烯基吡啶及聚噻吩等。如莫 金垣等【7 i 用循环伏安法制备了对烟酸有良好能斯特电位响应的聚毗咯修饰烟酸化学 传感器：程发良等 8 】用电化学方法制备了聚吡咯一抗坏血酸传感器，电极的稳定性好、 响应快、寿命较长，可用于饮料中抗坏血酸含量的测定。张占恩等一j 选用苯胺及其几 个衍生物( 邻苯二胺、二苯胺、n 一甲基苯胺、n ，n 一二甲基苯胺) 作聚合单体，用电化 学聚合方法在玻碳电极上固定辣根过氧化酶制成了测定h 。o 。的传感器，对其中最灵 敏的聚合单体n ，n 一二甲基苯胺进行了详细的研究。传感器具有较高的灵敏度，对h ：o ! 的线性响应范围为l l o 一一1 1 0 。m o l 几，检测限达5 1 0 0m o l l 。 天然的有机膜材料具有生物相容性好、无毒等优点，是固定化酶的优良载体 i “ 。如邓健等以牛血清白蛋白戊二醛为交联剂，将乳酸氧化酶固定于鸡蛋膜上制成 乳酸氧化酶传感器，用于测定血浆或其它体液中乳酸的含量 ”】：吴治平等将葡萄糖 氧化酶固定于再生丝素蛋白上制成了葡萄糖氧化酶传感器，用于葡萄酒中葡萄糖含 量的测定吲。 ( 4 ) 新技术的应用 一些新技术如纳米技术、基因重组技术、溶胶一凝胶技术、酶的定向取向技 术等的应用可在一定程度上提高传感器的综合性能。 固定化酶时引入纳米颗粒能够增加酶的催化活性，提高电极的响应电流值。首 先，纳米颗粒能增强g o d ( 葡萄糖氧化酶) 在载体表面上的固定作用；其次是定向作 用，分子在定向之后，其功能会有所改善；再次，由于金、铂纳米颗粒具有良好的 导电性和宏观隧道效应，可以作为固定化酶之间、固定化酶与电极之间有效的电子 媒介体，从而使得g o d 的氧化还原中心与铂电极倒通过金属颗粒进行电子转移成为 可能，酶与电极问可以近似看作是一种导线来联系的。这样就有效地提高了传感器 的电流响应灵敏度。唐芳琼等【i6 j 首次研究了二氧化硅和金或铂组成的复合纳米颗粒 第一章概论 对葡萄糖生物传感器电流响应的影响，其效果明显优于这三种纳米颗粒单独使用时 对葡萄糖生物传感器的增强作用。其原因是纳米粒子具有吸附浓缩效应、吸附定向 和量子尺寸颗粒效应，复合纳米颗粒比单独一种纳米颗粒更易于形成连续势场，降 低电子在电极和固定化酶间的迁移阻力，提高电子迁移率，有效地加速了酶的再生 过程，因此，复合纳米颗粒可以显著增强传感器的电流响应。 周亚风等j i 等黑曲霉g o d 基因重组进大肠杆菌、酵母穿梭质粒，转化甲基营养 酵母，构建出g o d 的高产酵母工程菌株。重组酵母g o d 比活力达4 3 6 6 3u m g 蛋白， 是商品黑曲霉g o d 的1 6 倍，催化效率更高。重组酵母g o d 的高活力特性可有效提 高葡萄糖传感器的线性检测范围。 溶胶一凝胶应用于生物传感器领域具有如下一些优点：基质在可见光区是透明 的，适于光化学生物传感器的制作；基质具有一定的刚性，提高了生物活性物质的 热稳定性；基质热稳定性好，并且呈化学惰性，对生物活性物质的失活作用很小， 保持了活性：通过溶胶一凝胶制备条件的优化，可控制基质的孔径大小和分布，使酶 分子有足够的自由活动空间，而又不至于从基质中流失，从而提高传感器的使用寿 命；溶胶一凝胶材料还具有生物相容性，为微电极植入人体提供了新的可能性；还可 通过对先驱体的功能化赋予溶胶一凝胶新的性能；溶胶一凝胶的制备条件十分温和， 生物分子可以在不同的制备阶段加入，并且可以制成不同大小与形状的修饰电极等。 罗国安等利用硅酸乙酯( t e o s ) 的溶胶凝胶化过程对葡萄糖氧化酶( g o d ) 进行固化， 共制各了不同载体下的g o d 酶柱。实验结果表明g o d 可在s i o 。的溶胶凝胶体系中保 持较高的活性。将此酶柱用于流动注射化学发光分析体系，可实现对葡萄糖的在线 测定。该体系的校正曲线线性范围为3 5 7 0 p m o l 几，其相关系数为0 9 9 9 ，检出下 限为o 6 um o l l 【1 ”。 经典的固定化酶方法主要有吸附法、共价键固定法、交联法和包埋法等。酶在固 定化过程中活力降低的因素主要有：固定过程中的化学损伤；酶分子不适合的空问 取向使得与底物发生邻近定向效应受阻，催化作用减弱。因此，酶或蛋白质分子空 间沉积的方向控制是制备高质量固定化酶、酶标试剂和生物器件的前提。固定化酶 空间取向方法主要有共价键法、氨基酸置换法、抗体偶联法、生物素一亲和素亲和法 和疏水定向固定法等。应用较多的是生物素一亲和素亲和法。生物素一亲和素之间具 有高度专一和强烈的相互作用，在p h 值、温度、有机溶剂或变性剂等较大的变化范 围内均能稳定存在，已经广泛应用于蛋白质的固定化及生物传感器。生物素一亲和素 系统可以方便地设计分子结构单元来赋予膜特定的功能。如方华丰等【2 0 j 以壳聚糖为 山西人学2 0 0 5 届顺l j 研究生学位论文 膜材料制成薄膜，运用生物素一亲和素系统将辣根过氧化酶固定在膜上，运用鲁米诺 一h ：o 。一辣根过氧化酶化学发光体系，对水样中微量的h ：o ：进行检测。 1 3 2 微生物传感器 进入7 0 年代，随着细胞固定化技术的发展，出现了微生物传感器。1 9 7 5 年d 1 v is 等刚研制出用于测定乙醇的第一支微生物传感器。1 9 7 7 年k a r u b e 等1 2 “首次报道了 b o d 微生物传感器，该传感器可在1 5 分钟内测出污水的b o d 值，连续使用寿命达1 7 天。微生物传感器的分子识别元件是由固定化微生物构成的。提出这类传感器的基 本思路在于：( 1 ) 微生物细胞内含有能使从外部摄入的物质进行代谢的酶体系，因 而可避免使用价格较高的分离酶。况且，有些微生物的酶体系的功能是单种酶所没 有的。( 2 ) 微生物能繁殖生长，或在营养液中再生，因而有可能长时间保持生物催 化剂的活性，延长传感器的有限使用期限。 微生物传感器的种类很多，可以从不同的角度分类1 2 ”。根据测量信号的不同， 微生物传感器可分为如下两类：( 1 ) 电流型微生物传感器。换能器输出的是电流信号， 根据氧化还原反应产生的电流值测定被测物。常用0 ：电极作为基础电极；( 2 ) 电位型 微生物传感器。换能器输出的是电位信号，电位值的大小与被测物的活度有关，二 者呈能斯特响应。常用的电极为各种离子选择性电极、c o ：气敏电极、nh ；气敏电极等。 根据微生物与底物作用原理的不同，微生物电极又可分为如下两类：( 1 ) 测定呼吸活 性型微生物传感器。微生物与底物作用，在同化样品中有机物的同时，微生物细胞 的呼吸活性有所提高，依据反应中氧的消耗或二氧化碳的生成来检测被微生物同化 的有机物的浓度；( 2 ) 测定代谢物质型微生物传感器。微生物与底物作用后生成各种 电极敏感代谢产物，利用对某种代谢产物敏感的电极即可检测原底物的浓度。 d e w e t t i n c k 等i 2 4 】基于细菌对葡萄糖的新陈代谢作用，发展了一种新型的p h 生物 传感器，可在3 7 的工作温度下，利用肠细菌的生长状况来监测p h 值。该传感器适 用于在线监测，可以作为水处理装置的终端，其绝对监测极限为1 0 5 c f u ( 菌落形成单 位) m l h 。l e t h 等口驯以固定化微生物和生物发光体测量技术为基础，将弧菌属细 菌体内的一个操纵子在一个铜诱导启动子的控制下导入产碱杆菌属细菌中，可使细 菌在铜离子的诱导下发光，发光程度与离子浓度成比例。将微生物和光纤一起包埋 聚合物基质中，可以获得灵敏度高、选择性好、测量范围宽、储藏稳定性强的生物 传感器。这种生物传感器可用于测定污水中的重离子，最低检测浓度为l n m 。李贵荣 等【2 6 】以自地霉菌为甘油三脂水解反应的酶源，采用p h 玻璃电极为基础电极研制成甘 第一章概论 油三脂微生物传感器，用于血清中甘油三脂( t g ) 含量的测定。该传感器对甘油三 脂的响应线性范围为3 9 4 l o 一1 9 1 1 0 。7 m 0 1 l ，响应时间为5 一1 5 分钟，使用寿命 达2 8 天。李新等 2 7 将株以甲醇为唯一碳源和能源的专性好氧甲醇细菌与极谱型溶 解氧电极结合制成不受乙醇干扰的甲醇细菌电极，用于测定白酒和工业废水中的甲 醇含量。该电极的线性响应范围为0 。2 9 3 f g 几。慈云祥等1 2 即将能够大量生成葡萄糖 氧化酶的地衣芽孢杆菌固定于交联葡聚糖s e p h a d e xl o o 或海藻酸钠一氯化钙载体上， 首次研制成用于检测体液中葡萄糖含量的微生物传感器。王晓辉等 2 9 1 将株专性、 自养、好氧的氧化硫硫杆菌夹于两片纤维素膜之间，制成硫化物微生物传感器，该 传感器对s 。的测定线性范围为0 0 3 3 0 0 m g 几，测定一个样品仅需2 3 分钟。 和酶传感器相比，微生物传感器的稳定性较好，使用寿命较长，灵敏度与前者相当， 但是响应速率较慢。因此，对于测定呼吸活性的微生物传感器而言，待测物需被细 菌摄入然后才由体内的酶体系进行代谢，所花时间较长。此外，由于微生物参与的 过程较复杂，当对选择性有较高要求时，必须挑选具有专一性的菌株作为分子识别 元件。 1 3 3 免疫传感器 一旦有病原菌或其它异种蛋白( 抗原) 侵入某种动物体内，体内即可产生能识别 这些异物并把它们从体内排除的抗体。抗原与抗体结合即发生免疫反应，其特异性 很高。免疫传感器就是利用抗体( 抗原) 对抗原( 抗体) 的识别功能而研制成的生 物传感器。1 9 7 5 年，j a n a t a 【3 0 j 首次报道了一种免疫传感器。他把刀豆球蛋白( c 。n a ) 共价结合在涂敷在白金丝上的5 u m 厚的p v c 膜表面上，构成c o n a 免疫电极。该电极 的电位甘露聚糖酵母的浓度有关，据此可测定甘露聚糖酵母。免疫传感器的种类很 多”1 ，3 2 】，根据标记与否可分为直接免疫传感器和间接免疫传感器；根据换能器种类 的不同，又可分为电化学免疫传感器1 3 3 j 、质量测量式免疫传感器、热量测量式免疫 传感器和光学免疫传感器【3 4 j 等。 s a m s o n o v a 等发展了一种快速灵敏的用于测定牛奶中双氢除菌素残余物含量 的免疫生物传感器。它是基于细胞质基因组的反应，通过光学系统传输信号。已达 到的检测极限为1 6 2 n g m l ，一天可检测2 0 个牛奶样品。赵晓君等口州研制出了表面 等离子体共振( s p r ) 白蛋白免疫传感器。该传感器以a 蛋白吸附于传感器的金属表面 作为基底，测定了白蛋白抗体在a 蛋白表面的分子自组装程序和速率，并通过检测 共振波长来检测白蛋白的浓度，检测下限为0 2 m g m l 。 山西大学2 0 0 5 届顸士研究生学位论文 抗体对抗原的选择亲和性与酶对底物有很大差别。酶与底物形成的复合物的寿命 很短，只存在于底物转变为产物的过渡态中，而抗体一抗原复合物非常稳定，难以分 离。另外，抗体一抗原反应不能直接提供电化学检测可利用的效应。这些特点都是设 计免疫传感器所必须考虑的。 免疫传感器是活性单元( 抗原或抗体) 与电子信号转换元件的结合。免疫传感 器在迸行测定时要以抗体一抗原亲和反应为识别基础，具有很高的选择性；而与此同 时，免疫活性单元是用一定的基体固定在检测器上的，基体和附着在基体上的共存 物引入的非专一性反应就可能影响免疫反应的专一性。这种来自于基体和共存物的 干扰就成为免疫传感器研究中一个亟待解决的问题。 134 组织传感器 组织传感器是将哺乳动物或植物的组织切片作为分子识别元件的传感器。与酶传 感器相比，具有一些独特的优点：( 1 ) 省去了酶传感器中酶的分离，制作简单，价 格低廉；( 2 ) 可用于酶催化途径尚不明确的体系；( 3 ) 组织中时常含有诸如辅酶等 物质的协同因子或最佳条件下所必须的成分，而生物催化机制常常是生物体多种辅 酶因子的系统表现或分步联合的结果。 1 9 7 8 年r e c h n i t z 3 7 】利用牛肝组织切片和尿酶与n h 3 气敏电极结合研制成功第一 支动物组织传感器。1 9 8 1 年k u r i y a m a 例利用南瓜组织切片与c 0 。电极结合研制成第 一支植物组织传感器。林祥钦等【39 j 报道了以美洲蜚蠊的下颚须作为分子识别和转换 元件研制的一种新型生物组织传感器，发现该传感器对抗坏血酸( a a ) 有选择性的 响应，响应脉冲的发放频率与a a 的浓度对数成正比，在5 l o 一5 1 0 m 0 1 几范围 内呈线性关系，检出下限低于l o 。m o l l 。该传感器响应快，并且具有较好的重现性。 章竹君等 4 0 】将含有草酸氧化酶的菠菜组织装入玻璃管柱中作为接受器同时将发光试 剂鲁米诺及c o ”固定在离子交换柱中构成对酶促反应产物h 2 0 ：响应的换能器，并结合 流动注射技术来检测尿液中的草酸赫。该传感器利用菠菜组织巾的草酸氧化酶，比 离析酶活性高，稳定性强，响应时间短，灵敏度高，线性范围为4 o 1 0 1 o l o 。4 m 0 1 几，检出限为2 1 0 。7 i i l o l 几，单次测定可在1 分钟完成，使用寿命为7 天。刘 杰等【4 l 】将富含酪氨酸酶的蘑菇固定在碳糊基质上制成植物组织电极，用于监测微量 的环境毒物如二乙基二硫代氨基甲酸盐、硫脲或苯甲酸等酪氨酸酶的抑制剂结果 表明这种生物传感器价廉、灵敏、快速、操作简易，可用于现场环境监测 虽然组织传感器在2 0 多年的时间里取得了一些可喜的成就，显示了广阔的发展 第一章概论 前景，但由于目前人们对各种组织的内在功能的实质了解尚不透彻，从整体上说， 此类传感器的研究还处于初级阶段，存在以下几方面问题：( 1 ) 选择性问题。由于 组织切片不象经分离纯化的酶那样含酶单一而选择性好，组织体内往往是多种酶原 的聚集体，因此，提高选择性是开发组织传感器的首要任务。( 2 ) 重现性问题。由 于组织切片受组织来源、保存期限、切片厚度等因素的影响，因而每支组织传感器 都需制作标准校正曲线，并需在使用过程中随时进行校正。( 3 ) 响应时削问题。由 于组织切片的厚度一般需要数十至数百微米，加上细胞膜的屏障作用，使待测物扩 散受阻，响应时间一般比酶传感器要长。( 4 ) 机理问题。迄今为止，关于组织传感 器响应机理的研究还很不深入，人们目前仅了解组织传感器的宏观响应现象，内部 机制有待进一步研究。 13 5d n a 传感器 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异 质双链的过程叫核酸分子杂交。目前，大多数d n a 传感器都是建立在核酸分子杂交 基础上的。d n a 传感器是在换能器上固化一条单链d n a ( d d n 4 ) ，通过d m 分子杂交， 对另一条含有互补碱基序列的d n a 进行识别，结合成双链d 1 1 a ( d d d n a ) ，通过声、光、 电不同信号的转换，对目的基因进行检测。d n a 传感器【4 2 按照换能器划分主要有电化 学d n a 传感器、光学光纤d n a 传感器【4 4 】和压电晶体d n a 传感器【4 s 。 目前，在蹦a 传感器研究中，虽然较好地解决了可逆性和特异性识别的问题，但 在传感器的响应时间和灵敏度方面却不尽人意。已报道的各种d n a 传感器响应时间 大部分在几十分钟到一小时以上，这与目前应用的常规杂交分析相比并不算长，但 对于传感器来说是太长了。对于大批量样品的测定，这将成为其致命弱点。在灵敏 度方面，d n a 传感器目前还远远达不到常规非放射杂交方法具有的灵敏度 ( 1 0 。o l l ) 。就核酸杂交反应而言，杂交时间( 响应时间) 与杂交量( 灵敏度) 是一对矛盾因素。在其它条件一定的情况下，要保证良好的灵敏度，缩短杂交时间 常常是困难的。如何在不损失或保证足够灵敏度的前提下缩短杂交时间是d n a 传感 器研究者们关注的问题。 1 3 6 细胞及细胞器传感器 近年来直接利用细胞内酶代替纯酶的生物传感器也有报道4 6 ，4 。如利用人体红 细胞中过氧化氢酶的催化活性测定h 。o ：的细胞生物传感器。制作方法是将一特殊的薄 山西丈学2 0 0 5 届硕+ 研究生学位论文 尼龙垫浸入到含有红细胞的磷酸缓冲溶液中，取出后与氧电极组合而成。该传感器 制作简单，使用寿命长达两个月，可检出浓度为1 0 4 m o l 几的h 。o 。，线性范围为1 j 1 0 一一5 1 0 。3 m 0 1 儿，与测定h 1 0 ：的酶电极结果相近。此外，细胞器传感器如粒体传 感器、微粒体传感器及叶绿体传感器等也有报道。但由于微生物和动物细胞的表面 由细胞膜和细胞壁覆盖，具有复杂的构造，是一个多功能体系。细胞种类不同，其 结构、成分也不同，加之细胞不同的活性状态，都将导致其不同的电极过程。这就 使得细胞的电化学响应信号弱，检测困难和多数细胞的电化学响应机理尚不明确。 所以，细胞传感嚣和细胞器传感器的研究受到限制。 1 4 本论文的立题背景和主要内容 14 1 本论文的立题背景 在各类型的生物传感器中，酶传感器是研究最早、发展最成熟的一类传感器。 由于葡萄糖氧化酶具有活性较容易保持、价格相对便宜等优点，葡萄糖酶生物传感 器的研究和发展最为成熟，应用也较为广泛。现有的葡萄耱酶生物传感器大致以电 化学型和测光型为主，具有灵敏度高、准确度高、选择性好、检测限低、线性范围 宽、分析速度快和使用寿命长等特点，而其不足之处是：由于采用循环伏安法和荧 光法作为检测手段，需要庞大或昂贵的电化学工作站或荧光仪器，较难实现仪器的 微型化、便携化和市场化。由美国p a s c os c i e n t i f jc 公司开发的p a s c oc i 一6 5 4 2 犁 溶解氧电极和p a s c oc i6 4 0 0 工作站及其操作界面克