（微生物学专业论文）产细菌素乳酸菌的筛选鉴定和细菌素发酵条件的研究.pdf

中文摘要 本研究的主要目的是筛选和鉴定产细菌素的广谱菌株、优化发酵条件提高细菌素 的效价和探讨粗细菌素的生物学特性。 本实验从植物性材料中筛选到一株产细菌素的菌株r 2 6 0 ，菌株的形态观察和生 理生化性质测定结果显示，菌体细胞呈杆状，单个或成对出现，革兰氏阳性，无芽孢： 接触酶反应、硝酸还原实验、明胶液化实验、产氨实验、水解淀粉实验、硫化氢产生 实验和、，p 实验均为阴性；发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和核糖。根据r 2 6 0 菌株 的形态特征及生理生化特性，鉴定为一株植物乳杆菌。 在排除过氧化氢和有机酸对指示菌的抑制作用后，r 2 6 0 菌株的发酵液对指示菌 还有强烈的抑制作用。经胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后，发酵液抑菌活性明显下降，证 明发酵液中含有蛋白质性质的抑菌物质，即细菌素。 本研究探讨了培养基种类和组成、培养温度、培养时间、接种种龄、不同的起始 p h 值和t w e e n 8 0 对细菌素产生的影响，以求得产生细菌索的最佳发酵条件。植物乳 杆菌r 2 6 0 在m 1 7 s 、跚、m r s 和a p t 四种发酵培养基中都能生长，但在豫s 培养基中 生长最好，细菌素效价最高；正交实验得出最适碳源、氮源和生长因子分别是蔗糖、 大豆蛋白胨和f e ”，它们最适浓度分别为2 、1 o 和0 0 2 。 环境条件对发酵影响的研究表明，最佳起始p h 值为6 5 ；产细菌素的最适温度 为3 0 ：最佳接种量和种龄分别为3 的1 2 h 。从生长与p h 及产细菌素的关系曲线显 示，植物乳杆菌r 2 6 0 在改良的m r s 培养基中生长良好。在0 - 4h 范围内p h 值变化 较小，4h 后p h 值显著下降。r 2 6 0 菌株在培养7h 后开始产生细菌素，2 0h 后细 菌素产量达到最高水平，2 2h 后细菌素的活性急剧下降。 粗细菌素的生物学特性研究表明，细菌素在p h 值为5 0 时活性最强，在酸性条 件下稳定；它有很好的热稳定性，在1 0 0 加热2 0 m i n 仍有抑菌活性；它不仅抑制革 兰氏阳性菌，还能抑制部分草兰氏阴性菌，但对酵母菌和霉菌没有抑制作用，因此细 菌素有很广的抑菌谱；该细菌素对胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感，但对过氧化氢酶不敏感； 细菌素可抑制苏云金芽孢杆菌的生长，但不能杀死细菌。 关键词：植物乳杆菌，筛选鉴定，发酵条件，细菌素，生物学特性 a b s t r a c t t h ea i mo f t h i sp r o j e c tw a st os c r 嘲3s t r a i n so f p r o d u c i n gb r o a d - s p e c t r u mb a c t e r i o c i n f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fb a c t e r i o c i nw e r es t u d i e di no r d e rt oe n h a n c et h et i t e r o f b a c t a r i o c i na n dt h e b i o l o g i c a lf e a t u r e so f c o a r s e b a c t e f i o c i nw e r es t u d i e d a b a c t e r i o c i n - p r o d u c i n g l a c t i ca c i db a c t e r i ar 2 6 0s t r a i nw a ss c r e e n e d f r o m p l a n t - m a t e r i a l t h em o r p h o l o g i c a l p h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lf e a t u r e so fr 2 6 0s t r a i n w e r ea sf o l l o w s ，t h eb a c t e r i a lc e l lw a sg r a m - p o s i t i v e ，s t r a i g h tr o t s h a p e d ，s i n g l eo rp a i r s a n dt h es p o rw a s h tf o u n d v pr e a c t i o n , n i t r a t er e a c t i o n ，g e l a t i nl i q u e f ya n dc a t a l a s e r e a c t i o nw e r en e g a t i v eg l u c o s e ，f i - u c t o s e , s u c r o s ea n dm a h o s ew e r ef e r m e m e d t oo r g a n i c a c i d sr 2 6 0s t r a i nw a si d e n t i f i e da s al a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m , a c c o r d i n g t oi t s m o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o l o g i c a lp r o p e r t i e s t h e s u p e r n a t a n t o fr 2 6 0s t r a i nc a ni n h i b i ti n d i c a t o rs t r a i n ss t r o n g l ye x c l u d i n g i n h i b i t i v ee f f e c to fh 2 0 2a n do r g a n i ca c i d ，b u tt h ei n h i b i t i v ea c t i v i t yd e c r e a s e ds h a r p l y a f t e rt r e a t m e n tw i t h t r y p s i na n dp e p s i n t h e r e s u k sc o n f i r m e dt h a tt h i si n h i b i t o r ym a t e r i a l w a sak i n do f p r o t e i n , c o u l db ec l a s s e da sb a c t e r i o c i n w e i n v e s t i g a t e dd i f f e r e n tf a c t o r ss u c ha sd i f f e r e n tm e d i u m ，t h ei n g r e d i e n t so f m e d i u m ， t e m p e r a t u r e ，t i m e ，s e e da g e ，p ha n dt w e e n s oo np r o d u c t i o no f b a c t e r i o c i ni no r d e rt o o p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，r 2 6 0s t r a i n c a r lg r o wi na l lo ff o u rt y p e so fm e d i a i n c l u d i n gm 1 7 s 、c m 、m r s a n da p t , b u tkg r o ww e l la n dt h eh i g h e s tv a l u eo f t i t e ro f b a t c r i o c i ni nm r st h eo p t i m u mc a r b o ns o u r c e , n i t r o g e ns o u r c ea n dg r o w t hf a c t o rw a s s u c r o s e s o y b e a r lp e p t o n ea n df e 计r e s p e c t i v e l ya n dt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o nw a s 2 、 1 o a n d0 0 2 r e s p e c t i v e l yb yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h es t u d yo nc o n d i t i o no ff e r m e n t a t i o ns h o w e dt h a tt h eo p t i m u mi n i t i a lp hf o r p r o d u c i n gb a c t e r i o c i ni s6 5 i tp r o d u c e dt h eh i r g h e s ta m o u n to f b a c t e r i o c i na t 3 0 ct h e o p t i m u mi n o c u l m i n ga m o u n ta n ds e e da g ew a s3 a n d1 2 h o u r sr e s p e c t i v e l y t h e r e l a t i o n s h i po f t h eg r o w t h ，p ha n db a c t e r i o c i ny i e l ds h o w e dt h a tr 2 6 0s t r a i ng r e wv e r y w e l li nm r sm e d i u m t l 地p ha l m o s tc h a n g e dl i t t l ea tt h ef i r s t 4 h , b u td e c r e a s e d a p p a r e n t l ya f t e r4 h r 2 6 0s t r a i np r o d u c e db a c t e r i o c i na t7 h ，t h ea m o u n t so f b a c t e r i o c i n r e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e la f t e r2 0 ha n di t sa c t i v i t yd e c r e a s e ds h a r p l ya r e r2 2 h t h e b i o l o g i c a lf e a t u r e so f o o a r s eb a c t e r i o c i ns h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp hw a s5 0 t h eb a c t e d o c i nw a s s t e a d yi na c i dc o n d i t i o n s i tw a ss t i l la c t i v ea f t e rb o i l e di n1 0 0 。cf o r 2 0 m i n s , s ob a c t e f i o c i nh a sg o o dt h e r m a ls t a b i l i t y t h ei n h i b i t i o ns p e c t r u mo fb a c t e r i o c i n i sv e r yw i d e , i tc a r li n h i b i tb o t h p o s i t i v eb a c t e r i aa n ds o m en e g a t i v eb a c t e r i a ，b u tn o te f f e c t o ny e a s ta n dm o l di ti ss e n s i t i v et o p e p s i n a n dt r y p s i nb u ti n s e n s i t i v et o h y d r o g e n p e r o x i d a s e b a c t e r i o c i no flp l a n t a r u mr 2 6 0i n h i b i t e d b t h u r i n g e n s i sf r o mg r o w i n g r a t h e rt h a nk i l l i n gi t k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，s c r e e n i n g a n d i d e n t i f i c a t i o n ，f e r m e n t a t i o n c o n d k i o n s b a c t e r i o c i n , b i o l o g i c a lp r o p e r t y 独创性声明 y7 3 7 6 6 5 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包台其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名时f 白j ：2 0 0 5 年6 月1 5 同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 时间：2 0 0 5 年6 月1 5 日 时间：2 0 0 5 年6 月1 5 同 髀盥 文献综述 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌或 杀菌活性的多肽，主要抑制同源的细菌，产细菌素菌株自身对细菌素具有免疫性“1 。 自从乳酸乳球菌产生的细菌素n i s i n 批准作为食品防腐剂以来，细菌素的研究己 成为微生物学研究中的一个活跃领域，研究内容主要涉及产细菌素菌株的筛选和鉴定 。h “，细菌素的分类、理化性质、发酵条件和应用、作用机理以及工程菌株的构建等 f ，卜t i t 口 1 细菌素的分类研究 目前细菌索的研究主要集中在乳酸菌，大多数的乳酸菌都能产生细菌素。根据细 菌素的化学结构、物理化学性质及分子特征，可以分为三大类n 8 】_ 【2 ”：( i ) 羊毛硫细 菌素，这类细菌素的活性部分含有羊毛硫氨酸、1 3 一甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸和 脱氢丁氨酸等翻译后修饰氨基酸：( i i ) 分子量小于l o k d a 且不含翻译后修饰氨基酸 的热稳定多肽，这类细菌索又可以分为四小类：i i a 对利斯特氏菌有极强的抑制作用； l lb 二肽系统，该类细菌素由两个独立存在、高度巯水和对热稳定的小分子肽组成， 其最大抑菌作用依赖这两个小分子肽的协同作用；i i c 依赖s e c 一系统的细菌素；i i d 第二类中除上述以外的类型；( ) 热不稳定性蛋白分子量大于或等于3 0 k d a 。第( i i ) ( h i ) 类因不含有羊毛硫氨酸基团，又被称为非羊毛硫细菌素。 2 细菌素发酵条件的研究 细菌素的产量除了与菌株自身性质有关外，发酵条件对细菌素的产量有很大影 响，如培养基成分、有机溶剂、培养温度、培养时间、培养方式、起始p h 值、接种 量和接种种龄等，其中以培养基成分、有机溶剂和培养温度影响较大。 2 1 培养基成分对细菌素产量的影响 细菌素的产量受到培养基成分的影响，培养基只有在满足细菌生长的前提下，才 能保证细菌素的大量产生和分泌。目前用于产细菌素乳酸菌的常用培养基有m 1 7 0 、 a p t 、c m 和m r s 等，这些培养基的共同特点是有机氮源含量较高，可满足细菌生长及 中和代谢抑制物乳酸而产生细菌素，但高含量有机氮源的使用不仅增加了生产成本， 也不利于细菌素的积累和分离纯化，有机氮浓度过高还会抑制细菌索的合成。“。李孱 等通过适当降低氮源和增加k i 嘎p o , 的浓度，优化了产乳链菌肽的培养基配方“，使菌 株a t c c l l 4 5 4 的乳链菌肽效价提高了一倍。另外，增加培养基的粘度( 如添加琼脂、 葡聚糖、甘油或淀粉等) 也可提高细菌素的产量。 p a n t e v t 2 3 1 等通过各种氮源的不同浓度对肠球菌a 2 0 0 0 产细菌素影响的研究发现， 在发酵稳定期蛋白胨和酵母浸出物的浓度对细菌素的产量有很大影响。d e v u y s t 和 v a m d a m e 则系统研究了复合培养基中不同的碳源、氮源和磷源对乳酸菌n i z 0 2 2 0 8 6 的生长和乳链菌肽产量的影响。他们发现蔗糖是最好的碳源，当培养基中含有4 的 蔗糖时，乳酸菌的生物量和乳链菌肽的产量都达到最大值，并认为碳源的调节作用是 乳链菌肽产量的主要控制机制；在复合培养基中添加棉籽粉作为氮源可提高乳链菌肽 的产量；k h 。p o , 是乳链菌肽产生的最好磷源，将k 心p o , 的浓度提高到5 时，既可维持 发酵液的p h 在合适的范围内，又可刺激乳链菌肽的产生。除此之外，乳链菌肽的生 物合成对含硫无机盐或含硫氨基酸有强烈的依赖性，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸虽可 刺激乳链菌肽的产生，但不影响最终生物量，因而表明这三种氨基酸是乳链菌肽生物 合成的前体。 培养基中的无机盐及其浓度对细菌素的产生也有重要影响，陈秀珠1 等的研究表 明，m r + 对n i s i n 的产生有促进作用，而c u 2 + 则有强烈的抑制作用；m r + 可增加细菌 素p e d i o c i na c h 的产量。不同浓度的n a c l 对细菌素的产生有不同的影响，5 的n a c l 有助于戊糖片球菌产生细菌素a c c e l ，但1 0 以上的n a c l 阻碍其产生，在m r s 培养 基中添加4 的n a c l 不仅会使植物乳杆菌产生细菌素p l a n t a r i c i ns ，而且在稳定期 后期还可以产生一种新的细菌素p l a n t a r i c i nt 。f r e d e r i c 。”等对米酒乳杆菌c t c 4 9 4 的研究表明，n a c l 能通过调节细菌的生物量和特殊细菌素的分泌从而影响细菌素的 产量。当培养基中n a c l 的浓度增加到一定值时，细胞生长缓慢，生物量增加不显著， 随着盐浓度的进一步增加细菌素s a k a c i nk 效价急剧下降。细菌素s a k a c i n 效价的降 低是由细胞生长缓慢引起的，因而细菌素s a k a c i nk 的产量和细菌的生长密切相关， 低的细胞生长速率造成低的生物量，进而影响到细菌素的产量，最后使细菌素效价降 低。 2 2 有机溶剂对细菌素产量的影响 除了培养基中的碳源、氮源和无机盐对细菌素产量有影响外，有机溶剂对细菌素 的产量也有一定的促进作用。g a r v e r 噜5 3 等发现在m r s 培养基中不添加t w e e n 8 0 ，细菌 虽能生长但不产生弯曲乳杆菌素( c u r v a t i c i nf s 4 7 ) 。在培养基中添加1 的t w e e n 8 0 可提高乳酸乳球菌乳脂亚种j 4 6 的细菌素产量，增加到2 时，对其产量并无影响。 庄绪亮等研究了不同发酵条件下t w e e n8 0 对乳酸链球菌s m 5 2 6 产n i s i n 的影响。1 ， 在自然p h ( 初始p h 7 0 ) 兼性厌氧、恒定p h 严格厌氧及恒定p h 兼性厌氧等发酵条件下， t w e e n8 0 对乳酸链球菌s m 5 2 6 产n i s i n 都有一定的刺激作用。 乙酸能作为自动诱导因子诱导栖鱼肉杆菌a 9 b 产生对利斯特氏茵有极强抑制作 用的细菌素3 。诱导产生的细菌素量和乙酸的浓度有一定的剂量依赖关系，而且在不 同的培养基中乙酸刺激细菌产生细菌素所需的浓度也不同。在m r s 7 - c a 培养基中，乙 酸的浓度达到9 0 m o l 时将不起诱导作用，而在a p t 培养基中，乙酸浓度为7 0 咖o l 时，则无诱导能力，可能是由于高浓度的乙酸抑制栖鱼肉杆菌的生长从而降低了生物 量。提高培养基中氯化钠和葡萄糖的浓度可抑制乙酸的诱导作用，在m r s 7 一c a 培养基 中氯化钠的浓度高于1 6 时，乙酸就丧失了诱导能力；葡萄糖抑制乙酸的诱导作用 可能是葡萄糖直接影响细菌索的产量或者是通过间接改变p h 来实现的。 c a l l e w a e r t 啸1 等的研究表明乙醇不仅能刺激特定细菌素的产生，而且可以防止细 菌素吸附到产细菌素细胞上。因为在发酵期间，过多细菌索吸附到细胞表面会使产细 菌索细胞死亡。若在发酵期间不加乙醇，细菌素a m y l o v o r i nl 4 7 1 在葡萄糖耗尽后产 量会急剧下降。 2 3 培养温度对细菌素产量的影响 各种细菌素产生的最适培养温度各不相同。乳酸链球菌产生n is i n 的最适温度为 3 0 c ，在较高的温度下n i s i n 的产量有所下降：而扩展短杆菌a t c c9 1 7 5 在2 8 时 细菌素的产量最高。”；肠球菌r z sc 5 产细菌素的温度必须控制在3 5 。c 。”。 3 细菌素的应用研究 3 ，1 细菌素在饲料中的应用 细菌素由于具有一定的抑菌谱，因而可防止饲料本身被沙门氏菌等致病菌的污 染，防止致病菌对动物的危害。“。选择恰当的细菌素既可以防止动物受某些肠道致病 菌的危害，又不影响动物肠道其它有益的微生物的生存。 3 2 细菌素在医疗上的应用 g o w a n s 在1 9 5 2 年发现，由于n i s i n 在血液p h 值下难于溶解和胰蛋白酶对其活性的 破坏，n i s i n 不能象抗生素一样作为广泛用于人类和动物的药用治疗剂，仅可用于口 腔保健、治疗牛乳腺炎以及预防牛乳房感染等。但新的研究证实n i s i n 作用的靶位点 与万古霉索相同。”，而且以n i s i n 为主要形式的羊毛硫细菌素可治疗老鼠葡萄球菌引 起的传染性疾病和人类的痤疮。“，因而n i s i n 在医药方面的作用又重新引起了人们的 重视。随着细菌素的性质和作用机理的进一步研究，基因重组技术的应用和发展，细 菌素在医疗保健方面的应用将更加广泛。 3 3 细菌素在檀物保护上的应用 植物病原细菌产生的细菌素用于防治植物病害多数是利用产细菌索的无毒菌株， 植物病原细菌素是植物病原细菌产生的一类复杂的抑菌物质，它的应用包括以下几个 方面。”小“：( 1 ) 利用不同寄主来源的细菌素无霉菌株进行生物防治；( 2 ) 克隆植物 病原细菌素基因，获得转细菌素基因的抗病植物：( 3 ) 利用细菌素特征来研究植物病 原菌田间自然种群的动态；( 4 ) 研究植物病原细菌的分类鉴定及流行学；( 5 ) 研究植 物病原细菌的致病机理；( 6 ) 利用基因工程技术对产细菌素菌株进行改良，使之适应 不同环境不同作物的病害防治。 3 4 细菌素在食品及发酵工业中的应用 细菌素作为食品保鲜和储藏的添加剂，可避免化学防腐剂潜在的安全隐患，如硝 酸钠和亚硝酸钠能生成致癌物质，亚硫酸盐能导致过敏性反应，苯甲酸钠有致癌致毒 作用。乳酸乳球菌产生的细菌素( n i s i n ) 在食品中的应用，解决了这一难题。因此 细菌索具有广泛的应用范围“2 h “，同化学防腐剂相比n i s i n 作为一种纯天然生物防 腐剂有很多优点：( 1 ) 能被人体蛋白酶降解对人体无毒，不影响人体肠道其它有益微 生物，与抗生素无交叉拮抗作用；( 2 ) 对食品的色、香、昧和口感不产生副作用；( 3 ) 可降低食品的杀菌温度，减少热处理时间，从而保持食品良好的风味和营养价值；( 4 ) 在酸性条件下，热稳定性强，有利于持久发挥防腐效果，延长食品的保质期和货架期。 n i s i n 能抑制嗜热、耐热细菌和芽孢的生长和繁殖，添加n i s i n 到乳制品中，可 以抑制这些微生物的腐败作用，从而减少高温灭菌的时间，改善产品品质，保证原料 乳原有的风味和口感，有效地延长产品的货架期；在肉制品生产中n i s i n 和硝酸钠配 合使用，既可抑制产生霉索的肉毒梭状芽孢杆菌，又可以降低硝酸钠的使用量，减少 亚硝酸胺的形成；在罐头食品生产中，常规罐头食品杀菌一般难以将耐热芽孢杀死， 一旦条件适宜，这些芽孢就导致罐头食品的腐败，添加n i s i n 可以抑制杀菌处理后残 留的耐热芽孢；在低酸和非酸性罐头食品中添加n i s i n ，可采用相对温和的处理过程， 如添加到番茄酱、蔬菜和蘑菇等罐头食品中，能减弱杀菌条件，保证食品的营养风味： 在酿造工业上，添加n i s i n 到发酵罐中可以防止污染和代替影响酵母活力的酸洗液， 并可用来洗涤种酵母以消除污染菌；添加n i s i n 的啤涟，可降低巴氏处理的时间和温 度，并能延长啤酒的货架期。 4 细菌素作用机理的研究 41 l a n t i b i o t i o ( 羊毛硫细菌素) 型 这类细菌素的典型的代表是n i s i n ，尽管此型的n i s i n 已被广泛应用于食品防 腐，但对其作用机制仍不够明确。这类细菌素对革兰氏阳性菌的营养细胞和孢子均有 作用。且对芽孢的作用比对营养细胞的作用更大m 。咖1 ，它对营养细胞的作用主要是 在细胞膜上，对芽孢的作用是抑制萌发m 1 ，而不是杀死芽孢，由于细菌芽孢具有强烈 的对热稳定性，当杀菌过程完成后，混合物中的细菌素仍然保持一定的活力，这些残 留的细菌素在通常情况下可以抑制芽孢的萌发阱。它的作用机制：一方面认为与脱氢 丙氨酸和脱氢丁氨酸有关，因为脱氢丙氨酸和脱氢丁氨酸能够与敏感菌株细胞膜中某 些酶的巯基发生作用，释放细胞质，造成敏感菌细胞裂解嘲；另一方面认为它主要是 消耗敏感细胞的质子驱动力，从而抑制细胞壁中肤聚糖的合成，使细胞膜和磷脂化合 物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，引起敏感细胞裂解旧”“”；目前认为这类细菌 索对细胞的作用是在一定的膜电位存在下，吸附于敏感菌的细胞膜上，在其上形成通 透性孔道，导致k + 离子从细胞中流出，a t p 泄露1 ，造成细胞膜内外能差消失，细胞 外水分子流入，细胞自溶而死亡。此型细菌素与细胞膜上的类脂体尤其是带负电荷的 磷脂关系最大，这表明带正电荷的细菌素与细胞膜的最初作用具有能量依赖性，故又 4 称为能量依赖型细菌素。 4 2 非l a n t b i o t i c 型 这类细菌素的作用方式是破坏细胞膜的稳定性，在其上形成一个亲水孔道，但这 个亲水孔道是经膜上的特定的受体蛋白介导的，与膜电位无关”。孔道使得细胞膜的 通透性增强而引起细胞内各种离子的渗漏，导致细胞解体死亡”1 。发挥作用时不具有 能量依赖性，即可导致细胞膜渗透屏障的丧失及质子动力的消失。因此非 l a n t i b i o t i c 型细菌素又称为非能量依赖型细菌素。 此外，细菌素的作用还受许多外在因素的制约，如金属离子、p h 值、细菌浓度、 磷脂成分、蛋白酶、温度及食品性状等。在c 酽+ 、m 9 2 + 、c d ”等二价或三价阳离子存 在时，n i s i n 的作用效果显著下降。因为这些阳离子与磷脂头部基团的负电荷反应。 一方面竞争性地抑制了细菌素的正电荷与细胞膜的静电作用，另一方面中和了磷脂头 部基团的负电荷，类脂体发生聚合使细胞膜更加坚固，从而使n i s i n 的抑制活性降低。 第一章引言 1 实用价值和理论意义 防腐剂作为食品保鲜和储藏的食品添加剂，其安全性日益受到食品加工行业的关 注和重视，但由于化学防腐剂存在着很多潜在的安全隐患嘲，如能生成致癌物质的亚 硝酸钠和硝酸钠，能导致过敏性反应的亚硫酸盐，怀疑有致癌致毒作用豹苯甲酸钠等， 这使人们对化学合成的添加剂具有恐惧心理。乳酸乳球菌素( n i s i n ) 是一种天然安 全防腐剂，它在食品中的应用解决了这一难题。 乳酸菌在自然界中分布很广泛是人和动物肠道正常菌群中的优势菌，不仅具有许 多对人和动物健康有益的生理功能，而且能够产生有机酸( 如乳酸、丁酸和醋酸等) 、 过氧化氢和细菌素等抑菌物质呻3 ，这些抑菌物质不仅对食品的风味和组织状态有很好 的保持效果，还可以抑制腐败菌和痛原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保藏期。 乳酸菌产生的细菌素以其对动物无毒性，易被人体消化道中的蛋白酶降解，不会在体 内蓄积引起不良反应等特性，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲 料添加剂”“1 。 乳酸菌细菌素在我国的研究始于八十年代末期，其中主要是n i s i n 的理论和应 用研究，新菌株和高产菌株的筛选以及分子生物学的研究，而对其它乳酸菌产生的细 菌素无论在理论上还是在应用上的研究都不够成熟。因此，筛选具有抑菌活性高的细 菌素产生菌株仍然是国内外细菌素研究的主要内容之一，具有重要的理论和实践意义 6 4 o 细菌素的产生与菌株及发酵条件等诸多因素有关，例如，乳杼菌属的嗜酸乳杆菌， 因菌株不同，可产生不同活性的细菌素，它们在生化和分子生物学特性上也表现出很 大的差异。细菌素的产量和活性受到发酵条件及培养基成份如碳源、氮源、生长因子 和p h 等因素的影响。探明这些因素对产细菌素菌株营养代谢的调节作用，这将有助 于正确地控制发酵条件，获得最佳的产量”“。另外，由于不同类型的细菌素的抑菌谱、 在p h 值中的稳定性、耐热性、蛋白酶敏感性和作用方式等方面存在很大的差异，深 入了解乳酸菌细菌素的抑菌谱和最适宜的p h ，对各类蛋白酶的敏感程度以及最适宜 的温度条件，就可以在实践中，依据各种细菌素的生物学特性，对其应用条件加以控 制和选择，这将极大地提高细菌素的应用效果。 乳酸菌细菌素以其安全、高效、无毒副作用和无抗药性等优点，已经引起广大从 事食品防腐剂、饲料添加剂以及医药开发人员的研究热情，成为国内外研究的热点。 但随着其应用的推广，以及不同行业对细菌素性质要求的不断提高，在细菌索的研究 中仍存在许多有待解决的问题，主要有：( 1 ) 细菌素的产量普遍较低；( 2 ) 细菌素的 抑菌谱较窄，大部分细菌素只对革兰氏阳性萤有作用，而对革兰氏阴性菌、酵母菌和 6 霉菌没有抑制作用；( 3 ) 细菌素在不同食品介质中的溶解性和稳定性各异，而且只有 在偏酸的环境中才有活性。 因此，今后乳酸菌细菌素研究开发的重点可能集中在以下几方面为；( 1 ) 筛选细 菌素的高产和广谱菌株；( 2 ) 细菌素在医疗保健方面的应用；( 3 ) 对各类细菌素的免 疫机制、作用机理以及结构和功能之间关系的研究；( 4 ) 利用基因工程技术对产细菌 素菌株进行改良，使之适应不同环境不同作物的生物防治；( 5 ) 通过蛋白质工程构建 新的细菌素，改进细菌素的稳定性和杀菌谱等特性，以适于工业化生产和实际应用； ( 6 ) 根据已知的细菌素结构设计全新的氨基酸系列，人工合成新型的细菌素，或对 现有的细菌素进行改造，扩大细菌素的应用范围。 2 本论文要解决的问题 本论文的研究工作包括四个部分： 第一部分，筛选产细菌素菌株。从乳酸菌的自然生境( 如泡菜、动物肠道、西红 柿表皮和奶制品等) 中筛选乳酸菌，再从中筛选产抑菌物质的菌株。以产抑菌物质的 菌株为研究对象，排除酸性产物和过氧化氢的干扰后，用胰蛋白酶和胃蛋白酶处理发 酵上清液，如果发酵液抑菌活性明显下降，则可证明该括性物质具有蛋白质性质，可 以初步确定其为细菌素。 第二部分，鉴定产细菌素菌株。参照伯杰氏细菌鉴定手册和乳酸菌分类鉴定 及实验方法，对产细菌素菌株进行鉴定。 第三部分，确定产细菌素菌株的发酵条件。测定不同培养基，不同碳源、氮源、 金属离子及其不同浓度对细菌素产量的影响：发酵温度、发酵时间、接种种龄、接种 量、培养基的起始p h 和t w e e n 8 0 等对细菌素产量的影响，通过优化发酵条件，提高 细菌索的效价。 第四部分，确定粗细菌素的生物学特性。主要包括细菌素在p h 中的稳定性、热 稳定性、酶的敏感性、抑菌谱和细菌素的作用方式等。 7 第二章材料和方法 2 1 材料 2 1 1 供试材料 西红柿、丝瓜、黄瓜、土豆、毛豆和莴笋等，这些植物性材料均购自蜀山农贸市 场。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 分离培养基( 1 1 7 s ) 固体培养基：植物蛋白胨5 o g ，聚蛋白胨5 o g ，牛肉浸膏2 5g ，酵母提取物 5 0g ，甘油磷酸二钠5 o g ，抗坏血酸0 5 9 ，蔗糖5 0 9 ，溴甲酚紫0 i g ，琼脂1 5 g ，蒸馏水ll ，p h7 1 ，1 2 1 1 5 m i n 。 液体培养基：配方同上，不加琼脂。 半固体培养基( 上层培养蒸) ：配方同上，琼脂含量为0 8 9 6 。 2 1 2 2 生理实验基础培养基 p y 培养基( 1 0 0 m ) ：蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物1 o g ，无机盐溶液4 o m l 。 盐溶液成分( 1 0 0 0 m 1 ) ：无永c a c l 20 2 9 ，m g s o , 7 h 2 砚0 4 8 9 ，k , h p o , l _ o g ，k 也p o , 1 o g ，n a h c o , 1 0 o g ，n a c i2 o g 。 将c a c l ：和m g s 0 4 7 1 2 0 一起溶解于3 0 0m l 蒸馏水中，再加5 0 0m l 蒸馏水，一 边搅拌一边缓慢加入其他盐类。继续搅拌直到全部溶解，加2 0 0m l 蒸馏水定容至i 0 0 0 m l ，混合后贮备于4 。 p y g 培养基( 1 0 0 m 1 ) ：在p y 基础培养液内加入1 o g 葡萄糖。 2 1 2 3 培养指示菌培养基( l b 培养基) 固体培养基：蛋白胨1 0 9 ，酵母膏5 9 ，氯化钠l o g ，琼脂1 5g ，蒸馏水1l ，p h 7 0 1 2 l 2 0 m i n ( 灭菌) 。 液体培养基：配方同上，不加琼骺。 半固体培养基( 上层培养基) ：配方同上，琼脂含量为0 8 。 2 1 2 4 发酵培养基 ( 1 ) m 1 7 s ：同上 ( 2 ) c m ：蔗糖l o o g ，蛋白胨l o o g ，酵母粉1 0 o g ，l ( 2 船q1 o g ，n a c l2 o g ， m g , s o , 7 地o0 2 9 ，p h 6 21 2 1 1 5 r a i n ( 3 ) m r s ：蛋白胨2 0 o g ，k 2 h p o , 2 0 9 ，乙酸钠5 o g ，葡萄糖2 0 o g ，t w e e n 8 0l o m ， m 9 2 s o “7 h z o0 5 8 9 ，m n s o , 4 h , o0 2 5 9 ，p h 6 2 - 6 41 2 1 1 5 m i n ( 4 ) a p t ：蛋白胨1 0 o g ，酵母粉5 o g ，k 2 h p o , 5 o g ，柠檬酸钠5 o g ，葡萄糖 l o g ，t w e e n s ol m l ，f e s o , 7 也o0 0 4 9 ， h 1 s 仉4 h , o0 1 4 9 ，m 9 2 s o , 7 h , o0 8 9 ，n a c l 5 o g ，p h 6 7 - 7 01 2 1 1 5 m i n ( 5 ) 改良的m r s 培养基：植物蛋白胨1 0 0 9 ，酵母粉5 o g ，k 。h p 仉2 o g ，柠檬酸 二铵2 0 9 ，蔗糖2 0 o g ，t w e e n 8 0l o m l 。f e s o , 7 h 2 00 5 8 9 ，p h 6 4 - 6 6 1 2 1 1 5 m i n 2 1 3 试验设备及材料 2 1 3 1 主要仪器设备 旋涡混合器x w - 8 0 a超挣工作台 电热恒温培养箱电热鼓风干燥箱 电热恒温水浴锅显微镜 冷冻高速离心机电子天平 7 2 2 光栅分光光度计p h 2 1l 型酸度计 立式压力蒸汽灭菌器l 5 - c 5 0 l 型 2 1 3 2 主要试剂及药品 乳酸和乙酸均为国产分析纯，乳链菌肽( 纯度为2 5 ) 购自s i g m a 公司，胃蛋 白酶、胰蛋白酶和过氧化氢酶为s i g m a 公司分装。 2 1 4 检测菌株和指示菌株 检测菌：分离的乳酸菌1 6 6 株。 指示菌：见表2 - 1 寰2 1 实验用蕾株 ! 堂z ：! g 型磐登鲤墨型! 堕虫 菌 株用途来源6 6 一 巍酸酋细菌素产生蕾 分离自植物性材料 g 乳酸乳球菌指示菌 购买自中科院 g 大肠杆菌 指示菌实验室保藏 g 枯草杆菌 指示茁实验室保藏 g 八叠球菌 指示苗实验室保藏 g 苏云金杆菌指示茵 实验室保蕞 g 金黄色葡萄球菌指示菌 实验室保藏 g + 啤薄酵母指示菌 实验宣保藏 假单孢菌 指示菌实验室保藏g 。 根霉 指示萄实验室保藏 青霉 指示菌实验室保藏 一生一一 塑委堕 耋壁塞堡塞! ： 9 2 2 方法 2 ，21 乳酸菌的分离和纯化 将植物性材料装满整个无菌试管，然后用牛皮纸和塑料皮封口置于3 0 的培养 箱中富集培养4 8 h ，取富集培养后的材料2 0 9 转入含5 0 m l 蒸馏水的三角瓶中摇匀， 然后将菌液稀释至1 0 1 0 。梯度，分别从1 0 1 - 1 0 4 梯度的稀释液中吸取0 1 m t 菌液， 涂布于选择性培养基m 1 7 s 上。在有氧条件下，3 0 培养4 8 h ，观察结果。挑出使培 养基变黄的单菌落，四区划线纯化菌株。挑出纯化后的单菌落，接种斜面，培养2 4 3 6 h ，4 保藏。 2 2 2 产抑蕾物质的乳酸蕾的筛选 在固体m 1 7 s 平板上，接种初筛产酸细菌作为被检菌，每皿点种6 个，培养2 4 h 后，长出圆形的菌斑，冰箱保留待用。 将指示菌在l b 液体培养基中培养1 2 h ，配成浓度为1 0 7 菌体m l 菌悬液，取该 菌悬液0 1 m l 与5m 1 经熔化后保持在4 5 1 2 左右的上层培养基混和均匀后立即倒入上 述接有被检验菌的平板上，在3 7 培养1 2 h ，根据被检验菌斑周围是否形成抑菌圈来 判断被检菌抗性物质的产生。 2 2 3 产细菌素的乳酸菌的筛选 将初筛后有抑菌作用的菌株在m 1 7 s 液体培养基中培养2 4 h 后，将菌液倒入l o m l 离心管，在4 下，转速为1 0 0 0 0 r m i n 的情况下离心l o m i n ，用酸度计测上清液的 p h 值，上清液保藏在4 c 的冰箱中备用。将指示蕾配成浓度为l o 菌体m l 菌悬液， 取该菌悬液0 1 m l 与5 1 经熔化后保持在4 5 左右的上层培养基混和均匀后立即倒 入铺有下层培养基的平板上。在上述培养基平板上均匀地放上牛津杯，然后用微量取 液器取2 5 0 “1 被检菌离心上清液注入牛津杯中，把上述平板放在3 7 的培养箱中培 养1 2 h 后检测抑菌圈的出现。 2 2 4 产细菌素菌株的确定 采用逐步排除干扰因素的方法，确定复筛后有抑菌作用的菌株产生的抑菌物质的 蛋白质性质。 2 2 4 1 中和法排除有机酸 将被检菌培养2 4 h 的离心发酵上清液中和到p h 为5 0 后，进行对指示菌的抑菌 实验，并设p h 为5 0 的乳酸和乙酸作为对照，也可以用乳酸溶液调m 1 7 s 培养基p h 为5 0 作对照，分别检测两者的抑菌活性，然后用发酵上清液的抑菌活性减去对照的 抑菌活性，即得到排除酸后发酵液的抑菌活性。 2 2 4 2 过氧化氢酶检测排除过氧化氢 过氧化氢酶溶解在5 0 1 t o o l 1 的磷酸缓冲液( p h7 o ) 中配成母液，加入到发酵 液中使过氧化氢酶的终浓度为5r a g m 1 ，在3 7 c 水浴中温育2 h 后取出，检测过氧化 氢酶处理后发酵液的抑菌活性。 2 2 4 3 蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质 把胰蛋白酶和胃蛋白酶分别溶解在3t o o l 1 的磷酸缓冲液( p h7 5 ) 中配成母 液，分别加入到被检测菌发酵离心上清液中，使它们的终浓度为0 5m g m 1 ，在3 7 水浴中温育2 h 后取出用牛津杯法检测抑蔷活性，并用缓冲液相同倍数稀释后的 发酵液作对照，检测胃蛋白酶和胰蛋白酶对乳酸菌发酵上清液抑菌活性的影响。 2 2 5 指示菌及其浓度的确定 分别以枯草杆菌、八叠球菌和苏云金杆菌等为指示菌，检测各种不同指示菌对细 菌素的敏感性，确定对细菌素最敏感的指示菌。取不同浓度的敏感指示菌，用牛津杯 法检测其对抑菌圈的影响，从而确定敏感指示菌对细菌素的最佳浓度。 2 2 6 产细菌素菌株的鉴定 2 2 6 1 革兰氏染色和培养特征的观察 2 2 6 2 生理生化特征鉴定 2 2 6 2 1 过氧化氢酶测定 将实验菌接种于p y g 培养基斜面上，3 0 培养1 8 2 4 h ，取一环接种的培养物， 涂于干净的载玻片上，然后在其上漓加3 - 1 5 的过氧化氢，有气泡则为阳性反应， 无气泡为阴性反应。 2 2 6 2 2 葡萄糖产酸产气实验 在p y 基础培养基内加入3 0 9 葡萄糖和0 5 吐温8 0 ，再添加6 9 琼脂和1 6 9 l o o m l 的溴甲酚紫1 4 m l 作指示剂，分装试管。把菌液滴加入上述融化的培养基中，充分混 匀，再在上面加一层7 m m 厚的2 的琼脂，置3 0 培养6 d 。指示剂变黄表示产酸，