（分析化学专业论文）微反应器的扫描电化学显微术用于生物分子的定量检测.pdf

山东火学硕：l ：学位论文 中文摘要 本论文b 分三部分：i 扫描l 乜化学显微术( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y s e c m ) 定量测定肿瘤相关标志物c a l 5 3 ；i i 微反应器的扫描电 化学显微术测定酶：i i is e c m 定量测撮t ，性：粒细胞r 0 过氧化物酶。 第一部分我们提i i 一种新的方法一扫描咆化学显微镜酶免疫方法 ( s e c m e 1 。1 s a ) 应用于乳腺瘸相关抗原c a l5 - 3 的测定。实验中通过在水平基 底上构筑微反应池的方法进行免疫反应，在基底上形成抗体一抗原一酶标抗体 ( a b a g a b + ) 的央心结构：反应结束后，将微反应池去掉，通过对h r p 催化 底物b q 的检测间接测定抗原c a l 5 - 3 ( a g ) 的量。我们对电极的材料，电极电 位，缓冲溶液的p l i 和浓度，底物的浓度以及扫描电流随时间的变化等几种因素 进行了研究，确定了c a l5 - 3 检测的最佳实验条件：p h7 0 的5 0m m o l l n a 2 h p 0 4 n a i l 2 p 0 4 缓冲溶液+ o 1 m o l lk c l ；h 2 e 的浓度1 0m m o l l ，h 2 0 2 的 浓度1 0 m m o l l ，检测电势0 4 v ，检njr , j 。问为加入h 2 0 26 8 m i n 后，电极用 半径1 0p m 金圆盘电极。同以往s e c m e l i s a 方法相比，该方法采用微反应池 进行免疫反应，起到了高集人g 的f l - ：f l j ，提高了检测的灵敏度。实验条件下c a l 5 3 的线性检测范嗣在15u m l 。一2 5 0u m l 之问，检测限可达到2 5u m l 左右。 应用该方法对c a l 5 - 3 试剂盒巾的对照样进行测定，测定结果与试剂盒所提供数 掘相符合。 第二部分我们制作了一种适_ - j 二s e c m 现场电化学检测用的微反应器，并用 该微反应器对辣根过氧化物酶( i i r p ) 进行了测定。该反应器由表面平整的有机 玻璃上刻蚀的微池和池口一1 ：7 0 覆盖的多孔膜构筑而成。多孔膜的孔径既要小于待 检生物大分予h r p 的直径，同时又要使h r p 的底物h 2 e 、h 2 0 2 及催化产物b q 等的分子能方便通过这些膜i l 。这样通过检测扩散出反应器的b q 而测量h r p 的量。实验中我们对膜材料、成膜溶液浓度、浇膜时机、有机溶剂等对h r p 测 定的影1 1 自进行了探索研究，确定了最佳实验条件。在最佳实验条件下我们对微反 应器中的h r p 成功进行了s e c m 检测，说明本方法用于检测溶液中的某些物质 山东大学硕：i ：学位论文 是可行的。 第三部分我们利用上节中制成的反应器进行中性粒细胞提取液中的过氧化 物酶( p o ) 进行了测定，测得中性粒细胞悬浮液中过氧化物酶含量约为2 4 4 1 0 五u m l 。通过计算求得单个中性粒细胞中的p 0 的平均含量约为1 0 6 1 0 8 u 个，与毛细管电泳所测得的中性粒细胞中的p o 的数据2 5 1 0 一一4 9 1 0 培u 个 相吻合。 山东大学硕1 二学位论文 a b s t r a c t t h i st h e s i si n c l u d e st h r e ep a r t s ：1 s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ( s e c m ) q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n a t i o nc a n c e rr e l a t i v e a n t i g e n c a l 5 3 i i e n z y m ea s s a ye m p i o y e dm i c r o r e a c t o r w i t hs e c ml i l q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n a t i o no fp o i nc e l la b s t r a c t i o nb ys e c m i nc h a p t e ro n eo ft h i st h e s i s ，w eh a v er e p o s e dan e wm e t h o d ( s e c m e l i s a ) t o q u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n ec a n c e rr e l a t i v ea n t i g e nc a 15 - 3i nt h eg cm o d eo fs e c m f i r s to f a l l ，w ef a b r i c a t e dam i c r o c e l lo nt h el e v e ls u b s t r a t ea n dt h ei m m u n o r e a c t i o ni n t h em i c r o c e l lf o r m e dt h ec o n f i g u r a t i o no fa n t i b o d y ( a b ) - a n t i g e n ( a g ) e n z y m e - l a b e l e d a n t i b o d y ( a b 4 ) o nt h es u b s t r a t e ，w h i c hw a sc a l l e d as a n d w i c hs t r u c t u r e a f t e rt h e i n r m u n o r e a c t i o n ，w eq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e dc a l 5 - 3b yd e t e c t i n gb ew h i c hw a s l h ec a t a l y z e dp r o d u c to fh r p s e v e r a lf a c t o r si n c l u d i n gp h ，b u f f e rc o n c e n t r a t i o n ， e l e c t r o d e ，d e t e c t i o np o t e n t i a la n dt h et i m eo fd e t e c t i o nw e r eo p t i m i z e d t h ef o l l o w i n g c o n d i t i o n sw e r es u i t a b l ef o rd e t e r m i n a t i o n ：b u f f e rs o l u t i o n ，5 0m m o l ln a 2 h p 0 4 - n a h 2 p o , 1 ( p h7 o ) + oi m o l l l 。k c i ；d e t e c t i o np o t e n t i a l ，- 0 4v ( v s a g c i ) ； c o n c e n t r a t i o no f i ：1 2 q a n d1 - 1 2 0 2 ，1 0m m o l l ；d e t e c t i o nt i m e ，6 - 8m i n u t ea f t e r i n j e c t i o nh 2 0 2 c o m p a r e dw i t ho t h e rs e c m - e l i s am e t h o d ，t h es u b s t a n c ef o r d e t e c t i o nh a db e e ne n r i c h e di nt h em i c r o r e a c t o r a sar e s u l t ，t h es e n s i t i v e n e s sh a d b e e ni m p r o v e du n d e rt h e c o n d i t i o n so ft h ee x p e r i m e n t ，t h el i m i to fd e t e c t i o no ft h e m e t h o dw a s2 5u m la n dt h el i n e a rs c o p ew a sb e t w e e n1 5u m l 一2 5 0u m l t h e v a l u e so ft h ec ai5 - 3k i tc o n t r o l sw ed e t e c t e dw e r eg o o da g r e e dw i t ht h ev a l u eo ft h e k i to f l i ：r e d i nc h a p t e rt w o ，w ef a b r i c a t e dam i c r o r e a c t o rs u i t a b l ef o rs e c ma n dd e t e c t e d h r pi ns o l u t i o nw i t ht h em i c r o r e a c t o r t h em i c r o r e a c t o rw a s m a d eb yc o v e r i n gat h i n f i l mw i t hp l e n t yo fh o l eo nt h ec e l lo fs u b s t r a t e t h ed i a m e t e ro ft h eh o l ei ss m a l l e r t h a nt h em o l e c u l ed i a m e t e ro fh r pa n db i g g e rt h a nt h em o l e c u l ed i a m e t e ro fh 2 q ， h 2 0 2a n db q s oh r pi ss i e v e di nt h em i c r o r e a c t o ra n dh 2 q ， 1 2 0 2a n db qa r ef r e e l y 东人学卿：学位论立 i na n do u t a sar e s u l t ，i i x pw a sd e t e r m i n e db yd e t e c t i o nb qd i f f u s e df r o mt h e m i c r o r e a c t o r s e v e r a lf a c t o r si n c l u d i n gm a t e r i a lo ff i l m ，c o n c e n t r a t i o no ff i l ms o l u t i o n a n di n f l u e n c eo f o r g a n i c a l l ys o l u t i o nt oh r pw e r eo p t i m i z e d u n d e rt h e c o n d i t i o n so f t h ee x p e r i m e n t ，w eh a v ed e t e r m i n e dh r pi 】_ m i c r o r e a c t o rt r i u m p h a n t l yw h i c hm e a n s t h a t t h i sm e t h o di ss u c c e s s f u li nd e t e r m i n a t i o ns o m ef r e em o l e c u l ei ns o l u t i o nb y s e c m i nc h a p t e rt h r e e ，am e t h o df o rd e t e c t i n gp oo fc e l la b s t r a c t i o nw i t ht h e m i c r o r e a c t o r b ys e c mw a sd e v e l o p e d t h ep o sc o n c e n t r a t i o no fc e l la b s t r a c t i o n w a s2 4 4 10 。u m la n dt h ea v e r a g ec o n t e n to fp oi ns i n g l ec e l lw a sf o u n dt ob e 1 0 6 1 0 一u c e l l w h i c hw a si nt h er a n g eo f2 5 1 0 一一4 9 1 0 8 u c e l ld e t e c t e db y c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s k e y w o r d ：s e c m ，s e c m e l i s a ，h r p , m i c r o r e a c t o r 山东大学硕士学位论文 符号与缩写 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 8 一环糊精与环氧氯丙烷交联聚合物 1 4 一苯醌 牛血清白蛋白 探头电位 抗原 抗体 神经生长索 戊二醛 葡萄糖氧化酶 剥苯二酚，氢醌 标记抗原 探头上的f l i 流 绒膜促性腺激素 胚盘促黄体激素 探头的校矿 【l 流( = f r 托。) 校正距离( = d a ，d ，探头与基底的距离；a ，探头的半径) 毛细管酶免疫分析法 髓过氧化物酶 葡萄糖氧化酶 还原型辅酶i ( 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) d 一环糊精与环氧氯丙烷交联聚合物 生理盐水 扫描隧道显微镜 扫描电化学显微镜 肿 姐q 队 o o叩d吼羽。o 儿 阱m弧佃a舔|；i 脚岫眦瞰他舳惭呱哪一竹瞄m上一啪蹶一咖哦洲一 山东大学顶：f ：学位论文 e l i s a t m b o x t m b r e d u m e c e a g d h g a l p q i p a p p a p g m r s a 酶免疫分析 3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺氧化念 3 ，3 ，5 ，5 一四甲基联苯胺还原念 超微电极 癌胚抗原 葡萄糖脱氢酶 半乳糖苷酶 对一醌亚胺 对一氨基苯酚 对一氨基苯一毗喃半乳糖 甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 原创，障声酮 本人郑鬟声 妥：所呈交的学位论文，是本人在，；i 的指导下，独 砖：进行研究所取得的成果。除文巾已经注明引用的内容外，本论文不 包含矮何其他个人或集体已经发表或撰写过瓣科褥成巢。对本文敬硝 究作出重戮贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声f 舞灼法律责任由本人承担。 论嫦者签名商泣一嚣期：幽 关予学位论文健羯授投酌声臻 本人完全了解l l 。溺：大学有关保翩、使用学位论文的规定，同意学 校缳鏊袋商澄家有关部 j 或爹l 构送交论文的复印件和咆予版，允许论 文被查阅和借嘲：本人授权1 “东大学可以将本学位论文的全郝或部分 内容翁入确+ 关数攥簿进 j ：检索，可吸采蹋影印、缭印或其毽复蔷毽手段 保存论义和汇编木学位论文。 f 僳密沦文在勰密霜癍遵守霓溉定) 论文作者签冬。以l 塑曼 导耀签名： 照逝謦 期：笺：! ：塑 山东大学硕：l ，学位论文 前言 扫描电化学显微镜( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p e ，s e c m ) 是在 超微电极( u m e ) 和扫描隧道显微镜( s t m ) 1 的基础上发展而来的一种 新型扫描探针显微镜技术。其分辨率介于普通光学显微镜和扫描隧道显微镜 之间。同其它扫描探针显微镜( s p m ) 相比，s e c m 的特点之一是能够检测局 部微区的电化学现象，弥补了其它s p m 不能直接提供电化学信息的不足。 图1s e c m 仪器装置图 s e c m 有多种工作模式，本论文试验过程中均采用产生收集模式。产生 收集模式是指s e c m 的一个工作电极产生的物质被第二个工作电极收集到的 一种工作模式( 见图2 ) 。它又分为二类：( 1 ) 基底产生探头收集模式( s g t c 模式) ，( 2 ) 探头产生基底收集模式( t g s c 模式) 。对于后种模式，由于 探头的直径远小于基底的直径，因此对探头产生的稳定物质基底的收集效率 山东火学硕一l ：学位论文 接近1 0 0 。这种模式应用不太广泛，主要用于研究溶液中的均相反应 2 - 6 1 。 s g t c 模式通常被用来测定基底上产生或消耗的物质的流量和浓度分布图。 这种模式不同于反馈模式和t g s c 模式那样整个氧化还原过程只能局限于探 头和基底之间的一层很薄的溶液层之间，而是探头在基底产生的一个很厚的 扩散层中进行测定。s g t c 模式的缺陷：若探头是电流型电极，探头上发生 的电极反应消耗了基底产生的物质，这会使基底的扩散层发生明显的扰动。 另外，移动探头会引起基底扩散层的搅动和收集效率( f r i s ，i s 是基底的电流) 的降低。 ，月刁j 图2 产生川5 ( 集模式 s e c m 最初被用于电极与电解质问界面的研究，包括探测表面形貌图 7 ，对材料进行微加工 8 ，进行电化学动力学研究 9 1 6 。此外s e c m 还被用于电化学现象如腐蚀的研究中 1 7 1 9 。随着s e c m 应用的不断拓展， 目前s e c m 在酶的研究【2 0 3 3 1 、抗原抗体复合物【3 4 4 0 l 、细胞的研究【4 1 - 5 7 等生物领域得到广泛应用。 酶的研究 s e c m 对于酶的研究有其独特的优势，既可定量测定酶反应的动力学参 数，又能直接得到酶催化活性分布的形貌图等。在酶的研究中产生收集模式 应用最多，原因是有些酶的动力学反应太慢而无法用反馈模式进行研究。 s e c m 被用作检测电活性点的工具，能提供准确定量的理论，还可以作为模拟 山东人学碗i ：学位论文 和分析传感器阵列! t - 物活性的工具。 9 2 年p i e r c e 等【2 0 】用反馈模式研究了微米厚度的孔层中的葡萄糖氧化 酶( g o x ) 催化b d 葡萄耱氧化为d 葡萄糖内酯的反应。溶液中的还原型介 质在探头上发生氧化反应产：生氧化型介质，此反应受扩散控制。只要有足量 的葡萄糖存在，此氧化型介质就会在固定于基底表面的g o x 催化下与葡萄糖 反应分别生成还原型介质和d 葡萄糖内酯。此时酶与介质问的动力学为零级 反应。按此机理求得了几种介质存在下的表观异相反应速率常数。他们又用 类似的反馈模式测定了聚碳酸酯膜7 l q ，固定的g o x 和鼠肝脏线粒体膜上的 n a d h 细胞色素c 还原酶 2 1 。z h o u 等 2 2 用两种方法把辣根过氧化物酶 ( h r p ) 固定在绝缘基底上：( i ) h r p 与共聚物发生交联反应而共同固定在 玻璃片上，( 2 ) 用相同的兆聚物固定亲和素。这两种方法固定后，在共聚物 的上方覆盖有微孔的聚碳酸酯膜。用第一种方法固定后可以直接测定微孔处 的h r p 。而用第二种方法吲定后再加入生物素化的h r p ，利用生物素和亲和 素的特异性反应，把h r p 阎定在绝缘基底上。该方法在直径约7u m 的区域 里可以检测到大约7 】0 5 个h r p 分子。 研究表明，s e c m 可以用来制作和分析表面上微米酶点的构造，这有可能 用在生物传感器的小型化设计中。w i t t s l o c k 和s c h u h m a n n 2 8 设计了一种 可以用s e c m 在金电极上固定微米级的g o x 点的方法。他们把s e c m 的探头 逼近到自组装有十二烷基硫醇的大而积金电极的上方，把探头作为对电极， 大面积金电极为工作f 乜极，在一1 2 到+ 1 2v ( v s s c e ) 扫二圈循环伏安。这样， 探头下方的十二烷基硫醇就会从金电极表面脱附 2 9 】，c y s t a m m i n i u m d i h y d r o c h l o r i d e 就会吸附在裸露的a u 电极表面上，再通过希夫碱反应连上 g o x ，即可得到固定的微米级的g o x 点，最终用铂探头s g t c 模式测定了基 底产生的h 2 0 2 。s h i k u 等【3 3 l 用一支微滴管将癌胚抗原( c e a ) 溶液滴在已 结合了抗癌胚抗原( a n t i c e a ) 的玻璃片上，再加入h r p 酶标抗体与c e a 结 合，形成抗体一抗原一酶标抗体这样的夹心化合物。用s e c m 通过测定h r p 来得到抗原分布的形貌图。另一利，构造酶层微型图案的方法是通过改变局部 化学环境，在微米或亚微米水平上改变酶的活性，如s h i k u 等【3 0 】报道了使 固定的心肌黄酶局部失活的文章。把铂探头靠近酶基底，在探头上加一个很 尔人学f 矾i 学位论文 正的电位，溶液中的氯化物和澳化物就会在探头上发生氧化反应分别生成c 1 2 和b r 2 ，它们再与水反应生成h c i o 和h b r o ，当h c i o 和h b r o 扩散到酶基底 上时就会使心肌黄酶失活，随探头走过的轨迹在酶层上形成一条失活的轨迹 线( g m 级) 。 前面所提到的酶都是氧化还原酶( 如g o x ，h r p 等) ，s e c m 是通过测定 其电活性反应物及或产物来实现对酶活性的测定的。实际上，s e c m 还可以 用来研究非氧化还原酶的活性。h o r r o c k s 和m i r k i n 【2 3 】用电位型探头测定了 固定在金微圆盘电极基底上的非氧化还原酶一尿素酶的活性及其与基底所加 电位之间的相关性。他们用n h 4 + 离子选择电极来测定催化尿素水解产生的 n h 4 + 。研究发现，当金基底电极的电位在0 0 4v ( v s a g a g c l ) 扫描时， 尿素酶发生可逆性的失活。这种失活复活的现象是酶的四级结构随电场和界 面离子成份改变而发生变化的结果。 近几年来，s e c m 对酶的研究进一步深入。g 6 s p d r 等 3 1 采用一种新型 微型分配器在金表面制成了微米尺寸的酶网。用分子自组装和交联聚合法固 定酶，分别得到了单分子层和多分子层的酶层。并用交联聚合法制备多酶偶 联结构的酶网，如双酶偶联( g o x 和过氧化氢酶) 和三酶偶联( 一葡萄糖苷 酶、变旋酶和g o x ) 。上述酶相互交叉形成的酶网可以用s e c m 的产生收集 模式通过测定酶反应产生的h 2 0 2 来进行表征。溶液中的葡萄糖和氧气在g o x 单分子层的催化下生成葡萄糖内酯和h 2 0 2 ，因此在g o x 的位置探头的电流增 加。0 4 年z h a o 等提出了种提高灵敏度和分辨率的s e c m 检测方式 3 2 ， 它结合了反馈与收集两种模式的优点。他们利用这种新的检测模式检测了半 乳糖苷酶( g a l ) 和葡萄糖脱氢酶( g d h ) 多酶体系。g a l 和g d h 被固定在顺 磁性磁珠中，溶液中对一氨基苯一吡喃半乳糖( p a p g ) 在g a l 作用下产生对 一氨基苯酚( p a p ) ，后者又被氧化为对一醌亚胺( p q i ) 。p q i 是g d h 的一种 有效辅助因子【3 3 】，它扩散至极微小的酶点在d 一葡萄糖存在的情况下被固定 的g d h 重新转变为p a p ( 图3b ) ，然后队p 重新扩散至超微电极从而完成反 馈循环。这样超微电极的电流来自两部分：一是p a p g 经g a l 作用产生的p a p 的氧化( g c 模式) ：二是探头还原产生的p q i 经g d h 作用( f b 模式) 所产生的 p a p 的氧化。该模式下由于反馈产生的p a p 使得探头电流较传统的收集模式 山东大学硕士学位论文 下的电流有明显增加( 图4 ) ，反馈所产生的信号放大效应仅仅发生在g d h 所处位置的部分区域。 圳圜 鼬n y n 。p m ，i 一叩b 啪纠r a 懈抽h 扣竺! 竺竺= 竺p 亩m 唧n 。例a 唧y 帆抽 m p g h d 6 c d h p 舻 口出5 9 + p n u l n c “e i n i r e o 吨f u c 口f i 鸵啪o p 舯 k 蚋e r d 2 1 - 1 p o ip p 图3 结合收集模式与反馈模式g a 卜g d h 多酶体系的检测原理图： a ) 无葡萄张 s 况卜 统收集模式检0 1 4 g a l ；b ) 葡萄糖存在下情况下信号增大。 ，m 一 图4 通过多酶体系微点中心的s e c m 线性扫描曲线：a ) 传统收集模式；b ) 收集、 反馈结合模式。曲线( a ) 无葡萄糖存在，曲线( b ) 葡萄糖的浓度为5 0m m o l l 。 抗原抗体复合物 绝大多数生物键合反应不能产生可以检测的电化学信号，为了用s e c m 对它们进行检测，必须先用标记技术使之标记产生氧化还原信号的物质，再 知 伯 幢 们 叩 ；l m u 东人学颂i 一学位论文 用探头来检测之。9 5 年w i t t s t o c k 等【3 4 】将常用标记物一碱性磷酸酶与抗原或 地高辛以共价键结合，然后与固定在玻璃片上的相应抗体结合。通过s e c m 检测a l p 催化反应的产物一4 氨基苯酚来间接测定了玻璃片上的抗体，并确 定该吸附为l a n g m u i r 吸附。9 6 年s h i k u 等【3 5 】通过火心方法将c e a 抗原与 辣根过氧化物酶( h r p ) 标记的癌胚抗体形成兴心化合物而固定，用s e c m 检 测由h r p 催化产物的还原电流成像了玻片基底上的癌胚抗原( c e a ) ，并研究丫 抗原浓度与扫描电流的关系，测得在直径4 0 微米的微斑点中c e a 抗蒙分r 的 最低量可达1 0 4 个。9 7 年s h i k u 等 3 6 】研究了玻璃基底上绒膜促性腺激素 ( h c g ) 与胚盘促黄体激素( h p l ) 双抗原免疫分析。2 0 0 0 年k a s a ie 1 1 3 7 1 用 s e c m 进行了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌( m r s a ) 产生的有毒蛋白一杀白 细胞素的免疫分析研究，他们制作了抗体阵列，同时进行了不同浓度的实验。i 文采用了直径6 0 0 “m 的金电极并且加快了扫描速度，达8 0 斗1 1 1 s ，检测限达到 p g m l 1 ( 图5 ，图6 ) 。 圈 而“ 圜 - i o- , 50 c u r r o n v n h - 1 2 1 1 1 0 - 9 - 8 - 7 4 - 5 - 4 l o 口( c1 9 u 幻c 甜m gm l 1 ) 圈艘! 坠! 差塞上形成的3 。：蹙列；! ? 图6 1 e u k o c i d i n 浓度与扫描电流的茂系 阵列中不同浓度的l e u k o c i d i n 点的s e c m 图； 。 ( c ) d f 点和 i 点耐线性扫描曲线。 以上实验皆是用玻片作为固相载体的，在其上固定抗体或抗原进行免疫反应。除 用固定的固相载体外，亦可用流动的固相载体。w i j a y a w a r d h a n a 等用在溶液中 可以流动的顺磁性超微磁珠作为固相载体，进行了一系列的免疫实验【3 8 4 0 。 首先用表面修饰有a b 的磁珠在溶液中与特定的a g 反应，再与酶标的二：儿进= 亍 免疫反应。反应结束后将溶液与磁珠分离，这样多余的a b 被除去，加，、潦标底 、窜 山东大学硕士学位论文 物后，用s e c m 检测酶的催化产物，检测电流大小与a g 浓度有关( 图7 ) 。用 磁珠作为固相载体的优点之一是省却了每步反应之间的洗涤步骤。到目前为止， 他们共发了三篇文章，这三个实验的共同点都是用扫描电子显微镜对免疫反应结 束后形成的顺磁性磁珠微区成像来进行磁珠微区的形貌与尺寸研究。用s e c m 对磁珠微区的生化活性进行研究。 图7 a ) 表而吸附碱性磷酸酶标记的小鼠抗体的磁珠聚集体的s e c m 图 b ) 聚集磁珠的s e c m 图所对应的s e m 图。 细胞的研究 s e c m 从开发的初期，人们就在不断尝试将其应用拓展到生物领域。继 b a r d 小组 4 l ，4 2 九十年代首次用反馈模式做出了草和l i g u s t r u ms i n e n s i s 叶子表面的形貌图以及用收集模式测定了e l o d e a 叶片上光合作用产生的氧气 和气孔释放氧气分布图之后，细胞的形态和性质逐渐成为s e c m 研究的热门 课题之一。s e c m 用于研究单细胞有其独特的优势：( 1 ) 对细胞的形态及活性 无太大影响，可以实现细胞活体测定：( 2 ) 只对有电活性的物质有响应，选 择性好；( 3 ) 可测定跨膜电荷传递的速度，进而研究细胞内的氧化还原活性。 近十年，m a t s u e 小组和m i r k i n 小组围绕单细胞做了一系列的工作。9 8 年 m a t s u e 小组测定了c n 一对活的人体癌细胞( s w - 4 8 0 ) 呼吸活性的影响 4 3 。 9 9 年用双微圆盘电极通过同时测定两种电活性物质一瞄f e ( c n ) 6 和0 2 ，同时 得到了原生质细胞的形貌图和光合作用产生0 2 的s e c m 图4 4 1 。0 1 年他们 7 山东人学顺j ：学位论文 研制了一种固定有细胞的生物微芯片，研究了两种抗生素一安比西林和链霉 素对大肠杆菌活性的影响【4 5 。测定了单个牛胚胎在培养状态下各个分裂阶 段氧的消耗速度 4 6 】。还研制一种有阵列微孔的硅片，把二种癌细胞一k 5 6 2 ， 抗阿霉素k 5 6 2 用胶原固定在微孔中。用s e c m 在微孔上方扫描，测定细胞团 的呼吸活性以及抗癌物质对细胞活性的影响【4 7 】。m a t s u e 小组发现单个牛胚 胎在锥形微池( 高度和半径均为2m m ) 中氧气的消耗速度是在培养池中的0 7 倍【4 8 】。m i r k i n 小组利用溶液中不同种类的氧化还原介质在细胞膜上与活细 胞内的氧化还原物质有可能进行电子交换的原理，用s e c m 探测了单个哺乳 动物细胞 4 9 ，5 0 】的氧化还原活性和酸碱活性及具有双层膜的紫色光合作用 菌( p u r p l ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 的氧化还原活性 5 1 】。并且进一步研究了 哺乳动物细胞中电荷转移反应的机理 5 2 ，提出了根据氧化还原活性区分正 常细胞和癌细胞的新思路【5 3 】；。他们所采用的是在s e c m 探头上产生还原型 氧化型介质，这些介质有可能进入细胞并在其内部再被氧化还原，这个过程 就会被探头收集，产生电流的增加( 正反馈) 。此过程随氧化还原介质的种类、 浓度及细胞的种类而变化。另外h e n g s t e n b e r g 5 4 研制了一种利用剪力传感 器控制探头和基底之间高度的s e c m 。用这种方法得到了神经细胞株p c i 2 的 s e c m 图。并把探头固定在细胞上方，记录了加入k + 后所产生的胞吐过程。 l i e b e t r a u 5 5 】用负反馈模式测定了p c i 2 的形貌图，并选用合适的氧化还原 介质及不同类型的探头，实时监测了p c i 2 细胞形态的变化。b a r d 小组研究了 甲萘醌进入酵母细胞后与酵母细胞内的谷胱甘肽反应，产生了氧化型产物， 利用p t 电极( 直径2 5r t m ) 探头测定了该氧化型产物的还原电流1 5 7 】。w i p f 小组【5 6 】利用两种工作模式( 恒电流模式和恒阻抗模式) 研究了神经细胞，发 现恒电流模式等距离细胞成像可以获得很高的分辨率，而恒阻抗模式等距离 细胞成像可以获得很好的细胞形貌信息，这是因为恒阻抗模式不需要额外加 入介质，可以直接在细胞培养液中成像。总体上说，现在用s e c m 来研究细 胞主要采用二种方法：( 1 ) 加入可逆型氧化还原介质利用反馈模式得到细胞 的形貌图；( 2 ) 通过测定细胞产生或消耗的氧气利用收集模式来进行研究。 随着s e c m 研究的飞速发展，s e c m 应用领域不断得到扩展，其中纳米级 探头的研究及s e c m 和其他技术结合在生物分析领域的应用将具有重要意义。 山东人学形 = | ：学位论文 参考文献 【i b a r d ，aj ，f a n ，f - r f ，k w a k ，j ，l e v , 0 s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y i n t r o d u c t i o na n dp r i n c i p l e s a n a lc h e m 1 9 8 9 ，6 1 ，13 2 - 13 8 【2 u n w i n ，pr ，b a r d ，aj s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 9t h e o r ya n da p p l i c a t i o n o ft h ef e e d b a c km o d et ot h em e a s u r e m e n to ff o l l o w i n gc h e m i c a lr e a c t i o nt a l e si ne l e c t r o d e p r o c e s s e s ，p h y sc h e m1 9 9 1 ，9 5 ，7 8 1 4 - 7 8 2 4 【3 1z h o u ，f ，u n w i n ，pr ，b a r d ，a js c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 1 6 s t u d yo f s e c o n d - o r d e rh o m o g e n e o u sc h e m i c a lr e a c t i o n sv i at h ef e e d b a c ka n dg e n e r a t i o n c o l l e c t i o n m o d e s jp h ) sc h e m1 9 9 2 9 6 4 9 1 7 - 4 9 2 4 4 】z h o u ，f ，b a r d ，a jd e t e c t i o no ft h ee l e c t r o h y d r o d i m e r i z a t i o ni n t e r m e d i a t ea c r y l o n i t r i l e r a d i c a la n i o nb ys c a n r d n gc l c c t r o c h e n f i c a lm i c r o s c o p y ，a mc h e ms o c 1 9 9 4 1 1 6 3 9 3 - 3 9 4 ，5 ，t r e i c h e l ! d ja ? m i r k i n ：m 扩? b a r d jnjs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ，2 7 霉 a p p l i c a t i o no ff ls i n l ，! i f l e dt r e a t m e n to fa ni r r e v e r s i b l eh o m o g e n e o u sr e a c t i o nf o l l o w i n g e l e c t o nt r a n s f c rt ot h eo x i d a t i v ed i m e r i z a t i o no f4 - n i t r o p h e n o l a t ei na c e t o n i t r i l e 。j 尸t o , sc h e m1 9 9 4 ，9 8 ，5 7 5 1 5 7 5 7 【6 】 u n w i n ，pr ，b a r d ，aj d e m a i l l e ，c a p p l i c a t i o n t ot h e s t u d y o fe c e d i s p 1 4 1 3 7 1 4 1 4 3 s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 3 3 r e a c t i o n s j p h y sc h e m 1 9 9 6 1 0 0 k w a k ，j ，b a r d ，a j s c a n n i n g e l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y a p p a r a t u s t w o d i m e n s i o n a ls c a n so fc o n d u c t i v ea n di n s u l a t i n gs u b s t r a t e s a n a l c h e m 1 9 8 9 ， a n d 6 1 1 7 9 4 17 9 9 8 】b a r d ，a j ，d e n u a u l t ，g ，l , e e ，c ，m a n d l e r ，d ，w i p f , d o s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y an e wt e c h n i q u ef o rt h ec h a r a c t e r i z a t i o na n dm o d i f i c a t i o no f s u r f a c e s a c c c h e mr e s 1 9 9 0 ，2 3 ，3 5 7 - 3 6 3 9 】w j p cd 0 ，b a r d ，a js c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 1 0 h i g hr e s o l u t i o n i m a g i n go f a c t i v es i t e so na ne l e c t r o d es u r f a c e ，e l e c t r o c h e ms o c 1 9 9 1 ，1 3 8 ，l 4 - l 6 【10 】w i p f , do ，b a r d ，a js c a n n i a ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y p a n7 ，e f f e c to f 9 【i 东- 人学埘! f 学位论史 【1 2 】 1 3 1 4 】 【1 5 】 16 】 【1 7 】 f 1 8 】 【1 9 】 【2 0 】 2 1 】 1 0 h e t e r o g e n e o u se l e c t r o n t r a n s f e rr a t ea tt h es u b s t r a t eo nt h et i pf e e d b a c kc u r r e n t e l e c t r o c h e ms o c 1 9 9 1 ，1 3 8 4 6 9 4 7 4 b a r d ，a j ，m i r k i n ，m v ，u n w i n ，p r ，w i p f , d o s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p y 1 2 t h e o r ya n de x p e r i m e n to ft h ef e e d b a c km o d ew i t hf i n i t eh e t e r o g e n e o u s e l e c t r o n - t r a n s f e rk i n e t i c sa n da r b i t r a r ys u b s t r a t es i z e j p h y s c h e m 1 9 9 2 ，9 6 ，1 8 6 1 - 1 8 6 8 m i r k i n ，m v ，r i c h a r d s ，7 r c ，b a r d ，a j s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y 2 0 s t e a d y - s t a t em e a s u r e m e n t s