（生理学专业论文）人ndrg家族成员cdna的克隆、表达及抗体制备.pdf

独铡牲离嚼 秉承学校严谨的学风与伉窿的科学道德，本入声明所望交的论文是 鑫嚣冁搓罨t 遴褥戆疆究i 释爱取褥瓣骚究裁鬃瑟蓑矮翔，除了交窜豢 l 标注和致谢的地方外，论文中不包盏其他八已经发表或撰写过的研究 不目含本八或他人已申请学位或其他用途使用过的戚果与我一同工作郴 骜零臻究磁豢豹轻驽蠢藤臻毫褒论交审佟了朝薅翁镒麓嘉表摹了蔹落，、 申请学位论文与资料若有不实之处，本八承担一切朔关责任。 l 交箨粪蔓萎：童羟型一嚣鬻：摩兰! 盛 保护知识产权声明 $ 八完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定即：研究生在较 学& 霸闻论文工 笨的知识产衩攀位辖第西军医六学本人保证毕娃离较 表女囊嫠竭途文i 终渡暴孵鬻墨蕈健 ) ：l 然海篆题军垂大学，学较毫较攥 交镕女的复印件，允许论文被查闻和储闻：学校可以公布论文的全部或部 名 僳密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其饱簧制手段保存论文 交终蠢签荔：一：鑫选一等舞签嚣：型二翌二蠢鬻：，二二兰 第四军医大学硕士学位论文 英文缩写英文全称 a a a b t s a m p a p b s a c d n a d t t e b ec o l i e d t a e g t a e l i s a g s t g a p d h h i s h r p i p t g k d a k l h l b m c a c m c s ：m e m r n a n c n j n 1 a n t 英文缩写词表 a m m oa c i d 2 , 2 一a z i n o - b i s - ( 3 一e t h y l b e n z o t a z o - | i n e 6 - s u l f o n i ca c i d ) - d i a m m o n i u ms a l t a m p i c i l l i n a m m o n i u m p e r s u l f a t e b a s ep a i r s b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a d i t h i o t h r e i t o l e t h i d i u mb r o m i d e e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e t h y l e n e g l y c o i h i s ( 2 - a m i n o e t h y l e t h e r ) n n n n - t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e g l y c e r a l d e h y d e 3 p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e h i s t i d i n e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l t h i o 1 3 d g a l a c t o s i d e k i l o d a l t o n k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n l u r i a b e r t a n im e d i u m m e t a lc h e l a t ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s 2 - m e r c a p t o e t h a n o l m e s s e n g e r r n a n i t r o c e l l u l o s e n - m y cd o w n s t r e a m r e g u l a t e dg e n e n i c k e l - n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d n u c i e o t i d e 中文全称 氦基酸 2 ，2 连氮基舣( 3 - 乙基苯 并噻吡咯啉6 磺酸) 氨苄青霉素 过硫酸胺 碱基对 牛血清向蛋白 互补d n a 二硫苏糖醇 溴化乙锭 人肠杆菌 乙_ 二胺四乙酸( 钠盐) 乙二醇- 舣( 2 - 氨醚) 四乙酸 酶联免疫吸附分析 谷胱苷肽一s 转移酶 甘油醛二磷酸脱氢酶 绵氮酸 辣根过氧化物酶 异丙基硫代1 3 d 、r 乳糖苛 干道尔顿 帽贝匙孔血监蚩白 l b 培养基 金属螫合亲合层析 多克隆位点 d 巯基乙醇 信使r n a 硝酸纤维素膜 n m y c r 游蛹仃基i x l 镍一次氮基二乙酸 核苷酸 第四军医大学硕士学位论文 o d o r f p a g e p b s p b s t p m s f p c a b p c r s d s s p d p t e m e d t r i s y p d o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n g f r a m e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e w i t ht w e e n - 2 0 p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l o u r i d e p o l y c l o n a la n t i b o d y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e n - s u c c i n i m i d y l3 - ( 2 p y r i d y l d i t h i o ) p r o p i o n a t e t h e r m u s a q u a t i c u sd n ap o l y m e r a s e n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e 2 - a m i n o - 2 ( h y d r o x y m e t h y l ) - 1 ，3 一p r o p a n e d i o l y e a s te x t r a c t 、p e p t o n e 、d e x t r o s e m e d i u m 2 光密度 开放阅凄框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 含t w e e n 2 0 的磷酸盐 缓冲液 苯甲基磺酰氟 多克隆抗体 聚合酶链反应 _ 一烷基硫酸钠 n 琥珀酰胺3 ( 2 - 硫代吡 啶) 丙酸盐 栖热水生菌d n a 聚合酶 n ，n ，n ，n 四甲基乙一胺 二羟甲基氨墓甲烷 酵母提取物、堂白胨、领萄 糖培养基 第四军医大学硕士学位论文 硕士学位论文摘要 入n d r g 家族成员c d n a 的克隆、表达及抗体制备 研究生：张健2 导师：张万会教授2 刘新平教授 药立波教授1 第四军医人学生物化学与分子生物学教研室1 ，生理学教研室2 ，西安7 1 0 0 3 2 关键词：。d r g 葛簇；n 一丢；局源性：反转录；p c r ；克隆：序列测定 验证；原核表达：可溶性：n i n t a ；亲和纯化：圆二色性分析：b 水解酶； 多克隆抗体制备：抗血清：特异性；效价鉴定：寡肽合成；k l h ；载体蛋白： 转染y f 1 人n d r 9 2 基因( n - m y cd o w n s t r e a m - r e g u l a t e dg e n e2 ) 是本课题组于2 0 0 0 年从正常成人全脑e d n a 文库中发现和获得的新序列。其全长为2 , 0 2 4b d ， 经b l a s t 相似性分析证明所得序列为一新基因( g e n b a n k 检索号：a f 1 5 9 0 9 2 ) 。n d r 9 2 基因含有1 6 个外显子和1 5 个内含子，定位于染色体1 4 q 1 1 2 ， 编码一个含有3 5 7 个氨基酸残基、分子量约为4 0k d a 的蛋白质。初步研究显 示，该基因可表达于多种组织中，并且是证常脑组织和胶质瘤的差异表达基 第四军医大学硕士学位论文 因。目前已报道该家族共有四个成员：n d r 9 1 、n d r 9 2 、n d r 9 3 和n d r 9 4 ，其 中n d r 9 4 又分为三个亚型：n d r 9 4 b 、n d r 9 4 b ”和n d r 9 4 一h 。该家族各成员问 的氨基酸残基序列同源性很高，但在各组织间的表达水平有明显差异。 已知有多种因素可以影响n d r 9 1 的表达水平，在施加同型半胱氨酸、致 d n a 损伤性物质、地衣霉素( t u n i c a m y c i n ) 、应激刺激( 缺氧、n i 2 十等) 、抑 癌基因p 5 3 等因素的条件下，n d r g l 的表达上调：而雄激素、n - m y c 、c m y c 等因素可下调n d r g l 的表达。已有文献报道，在细胞的增埔分化、细胞氧化 还原电势平衡的维持、阻抑肿瘤细胞扩散等过程中，n d r g l 和n d r 9 2 发挥着重 要作用0 1 。由于目前对于n d r g 家族的结构和功能性认识尚不全面，因此， 览隆和表达n d r g 家族各成员并制备相应的特异性抗体则成为迫切而重要的 琏础性工作有利于从总体上研究该家族各成具的生理功能。 根据上述事实，本实验按如下方案展丌：羡、静u k 下n 甲牙j 魂； 1 n d r g 家族成员的c d n a 克隆。提取人胎脑组织的总r n a ，经反转录 制备c d n a 。依据g e n b a n k 登录的n d r g 家族各成员序列分别合成了针对 n d r 9 1 、n d r 9 3 和n d r 9 4 一b 的引物，然后进行p c r 反应以扩增d n a ，回收和纯 化p c r 产物并将其插入到p m d1 8 一t 载体中进行克隆后测序分析，用b l a s t f t 序验证测序结果。 2 n d r g 家族成员的原核表达。将测序f 确的片段插入到p r s e t - a 、 - - _ _ _ _ - _ 一 p g e x 4 t 1 、p p r o e x h t b 等表达载体中，分别用i p t g 诱导表达，发现 p p r o e x h t b n d r 9 1 所编码的n d r g i 蛋白有高效可溶性表达。 3 n d r g l 蛋白的二级结构分析。融合表达的6 h i s n d r g l 蛋白经 o o _ _ _ - _ 。_ 一_ _ 一 n i n t a 偶联的琼脂糖珠纯化后，进行圆二色性分析。发现在该分子中，几 种蛋白质二级结构所占比列如下：o 螺旋：2 3 6 ，b 片层：1 8 6 ，转角： 二5 7 ，无规则卷曲：3 2 o ，这与计算机程序预测的结果相近。 4 抗人n d r g 家族的多克隆抗体制备。用可溶性的6 h i s n d r g l 蛋白 第四军医大学硕士学位论文 免疫家兔获得了高效价的兔抗人n d r g l 多克隆抗血清，利用固定于硝酸纤 维素膜上的n d r g l 抗原进行亲和吸附，以纯化抗血清，提高了n d r g l 多 克隆抗体的特异性，并用此纯化的抗体进行了免疫组化和w e s t e r n 检测。由 于n d r g 家族各成员间氨基酸组成有很高的同源性，此抗体在识别n d r g i 、 n d r g 2 、n d r g 3 和n d r g 4 时存在交叉，表明已获得抗人n d r g 家族的多 克隆抗体。 ， 5 抗人n d r g 家族寡肽的多克隆抗体制备。i 由于抗人n d r g 家族的多 f 兜隆抗体不能很好地区分n d r g i 、n d r g 2 、n d r 、c , 3 和n d r g 4 ，按各亚型 分亍二氨基酸残基序列中特异的肽段合成的寡肽作为半抗原，与k l h 偶联后 免疫家兔，以制备特异性的抗寡肽抗体。目6 u 免疫家兔的抗体滴度约为1 ：3 2 0 0 ，继续加强免疫，可望获得具有高度特异性的抗体，以特异地识别n d r g l 、 、， n d r g 2 、n d r g 3 和n d r g 4 各亚型分子。矿 第四军医大学硕士学位论文 m o l e c u l a r c l o n i n ga n dp r o t e i ne x p r e s s i o no fc d n a so fn d r gf a m i l yg e n e s p l u sg e n e r a t i o no f a n t i b o d i e ss p e c i f i ct on d r g p r o t e i n s p o s t g r a d u a t e ：z h a n g j i a n 2 s u p e r v i s o r ：p r o f z h a n g w a n h u i 2 p r o f l i ux i n p i n 9 1 p r o f y a ol i b 0 1 d e p a r t m e n to fb i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y , 2 d e p a r t m e n to fp h y s i o l o g y t h ef o u r t hm i l i t a r ym e d i c a lu n i v e r s i t y ，x i a n7 1 0 0 3 2 k e yw o r d s ：n d r gf a m i l y ；n m y c ；h o m o l o g y ；r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ；p c r ； c l o n e ； s e q u e n c ev e r i f i c a t i o n ；p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ；s o l u b i l i t y ； n i c k e l - n i t r i l o t r i a c e t i ca c i d ；a f f i n i t yp u r i f i c a t i o n ：c i r c u l a rd i c h r o i s ma n a l y s i s ；c 【b h y d r o l a s e ；p o l y c l o n a la n t i b o d y p r e p a r a t i o n ；a n t i s e r u m ：s p e c i f i c i t y ：t i t e r i d e n t i f i c a t i o n ；p e p t i d es y n t h e s i s ；k l h ；c a r r i e rp r o t e i n ；t r a n s f e c t i o n ； t h eh u m a nn d r 9 2 ( n - m y cd o w n s t r e a mr e g u l a t e dg e n e2 ) c d n aw a sf i r s t c l o n e df r o mn o r m a lh u m a nw h o l eb r m nc d n a l i b r a r yi no u r l a bi n2 0 0 0 t h ef u l l l e n g t h o fn d r 9 2c d n ai s 2 ，0 2 4b pl o n g b l a s ta n a l y s i sv e r i f i e dt h a tt h e d i s c o v e r e dc d n a s e q u e n c er e p r e s e n t e d an e wg e n e ( g e n b a n ka c c e s s i o na f 1 5 9 0 9 2 ) l o c a t e do nh u m a n c h r o m o s o m e1 4 q 1 1 2 n d r 9 2g e n ec o n s i s t so f1 6e x o n s 6 第四军医大学硕士学位论文 a n d15i n t r o n st h a te n c o d e sa4 0k d ap r o t e i nw i t h3 5 7a m i n oa c i dr e s i d u e s p r e l i m i n a r yd a t ai n d i c a t e dt h a tn d r 9 2w a se x p r e s s e di nm u l t i p l et i s s u e s w i t h h e t e r o g e n e o u se x p r e s s i o ni n n o r m a lb r a i ns t r u c t u r e s e x c e p tg l i o m as p e c i m e n s l a c k i n gn d r 9 2e x p r e s s i o n u n t i ln o w t h er e p o r t e df o u rm e m b e r s c o m p r i s e t h en d r g f a m i l y ：n d r gi ，n d r 9 2 ，n d r 9 3a n dn d r 9 4 ，w i t hn d r 9 4p o s s e s s i n gt h r e e i s o f o r m s ： n d r 9 4 * b 、n d r 9 4 一b ”a n dn d r 9 4 一h ，t h ef o u rn d r gf a m i l ym e m b e r ss h a r eg r e a t h o m o l o g yi nt h e i rc o m p o s i t i o n o fa m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n i nd i v e r s et i s s u e s m a n yf a c t o r sm i g h ta f f e c tt h ee x p r e s s i o no fn d r 9 1g e n e t h ee x p r e s s i o no f n d r g l i s u p r e g u l a t e db yh o m o c y s t e i n ，t u n i c a m y c i n ，d n ad a m a g i n ga g e n t s 、 s t r e s s f u ls t i m u l i ( s u c h a s h y p o x i a a n dn i c k e l t o x i c a t i o n ) a n d p 5 3 ， a n d d o w n r e g u t a t e db ya n d r o g e na n d t h ep r o t o - o n c o g e n e s n m y ca n dc - m y c e x i s t i n g e v i d e n c e ss u g g e s tt h a tn d r g la n dn d r 9 2p l a ya c t i v er o l e si nc e l lp r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o n e v e n t s ，m a i n t a i n i n g t h eb a l a n c eo fc e l lr e d o x p o t e n t i a l a n d s u p p r e s s i n gm e t a s t a s i so fm a l i g n a n t t u m o rc e l l s ，a st h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f n d r gf a m i l yg e n e sr e m a i nl a r g e l yu n k o w n ，i ti sv e r yi m p o r t a n t t of i r s t l yc l o n ea n d e x p r e s se d n as e q u e n c e so fn 魄f a m i l yg e n e s ( n d r g i ，3a n d4 ) c o u p l e dw i t h g e n e r a t i o no fs p e c i f i c a n t i b o d i e s a g a i n s tn d r gp r o t e i n s t h e s e w i l l g r e a t l y f a c i l i t a t es u b s e q u e n tc o m p r e h e n s i v ec h a r a c t e r i z a t i o no f n d r gf u n c t i o n s o u r s t u d yw e r e t h e r e f o r eu n d e r t a k e nt oa d d r e s st h ea b o v ei s s u e s 1 e d n ac l o n i n go fn d r gf a m i l yg e n e s t o t a lr n af r o mh u m a nf e t a lb r a i n t i s s u ew e r ee x t r a c t e d ，t h e nr e v e r s et r a n s c r i b e di n t oc d n a t h r e ep a i r so f p r i m e r s w e r es y n t h e s i z e dw h i c ht a r g e t p a r t i a ls e q u e n c e si nn d r g l ，n d r 9 3 a n dn d r 9 4 一b a c c o r d i n g t og e n b a n kd e p o s i t e ds e q u e n c e s 。p c rp r o d u c t sw e r ei n s e r t e di n t o p m d l 8 - tv e c t o ra n ds e q u e n c e d s e q u e n c e st h u so b t a i n e dw e r ec o m p a r e dt o 7 第四军医大学硕士学位论文 g e n b a n kd a t a b a s eu s i n gb l a s t p r o g r a m 2 t h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fn d r gf a m i l y t h ev a l i d a t e dg e n ef r a g m e n t s w e r e r e s p e c t i v e l y i n s e r t e di n t o p r s e t - a 、p g e x 一4 t _ 1 a n d p p r o e x h t b e x p r e s s i o nv e c t o r s p r o t e i ne x p r e s s i o nw a si n d u c e db yi p t gi ne c o l i b a c t e r i a l s t r a i n st h a te x p r e s s e dh i g h l ys o l u b l e6 h i s n d r g li nl bm e d i u mw e r eo b t a i n e d b yt r a n s f o r m a t i o no fp p r o e x - h t b - n d r 9 1 r e c o m b i n a n tp l a s m i dw h e na n a l y z i n g t h e i rs o l u b i l i t y 3 t h es e c o n d a r ys t r u c t u r a la n a l y s i so f n d r g lf u s i o np r o t e i nt h ee x p r e s s e d f u s i o np r o t e i nw a sp u r i f i e db yn i n t aa g a r o s eb e a d sa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f p u r i f i e d6 h i s - n d r g if u s i o np r o t e i nw a sa n a l y z e db y c i r c u l a rd i c h r o i s m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t6 h i s n d r g 1w a sc o m p o s e do f o h e l i x ：2 3 6 b s h e e t ：1 8 6 ，t u r n ：2 5 7 ，r a n d o m ：3 2 0 t h eo u t c o m eo f a n a i y s i sb a s i c a l l yc o n f o r m s t op r e d i c t e dd a t au s i n gc o m p u t e rp r o g r a m s 4 p o l y c t o n a la n t i b o d yp r e p a r a t i o na g a i n s tn d r gf a m i l y i m m u n i z a t i o no f r a b b i t sw i t hf u s i o n p r o t e i np r o d u c e dh i g h t i t e r p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t n d r g l t h e s p e c i f i ca n t i b o d yw a sp u r i f i e db ya b s o r b i n g a n t i s e r u mw i t hn d r g l a n t i g e n i m m o b i l i z e do nn cf i l t e r s s a t i s f a c t o r y r e s u l t sw e r eo b t a i n e di n i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n ga n dw e s t e r nb l o tu s i n gt h eg e n e r a t e da n t i b o d i e s d u et ot h eh i g hh o m o l o g yi nc o m p o s i t i o no fa m i n oa c i d sr e s i d u e si np r e d i c t e d n d r gf a m i l yp r o t e i n s ，t h ea n t i b o d y p r e p a r e da g a i n s tn d r g ia n t i g e n f a i l e dt o d i f f e r e n t i a t et h ef o u rm e m b e r so fn d r gf a m i l y t h u sa na n t i b o d ya g a i n s ta l l n d r gf a m i l yp r o t e i n sw a so b t a i n e d 5 p o l y c l o n a la n t i b o d yp r e p a r a t i o na g a i n s t t h e p e p t i d e s o fn d r gf a m i l y p r o t e i n s w es y n t h e s i z e d f o u rs h o r t p e p t i d e s a s h a p t e n st h a tr e p r e s e n tu n i q u e s e g m e n t s i n p r o t e i ns e q u e n c e s o fn d r g1 、n d r g 2 、n d r g 3a n dn d r g 4 8 第四军医大学硕士学位论文 r e s p e c t i v e l y t h e s ep e p t i d e sc o n j u g a t e dw i t hk e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n ( k l h ) w e r er e c e n t l yu s e dt oi m m u n i z e r a b b i t s ，w a i t i n gf u r t h e rb o o s t i n go fa n t i b o d yt i t e r s a tt h et i m eb e i n g t h ep r e s e n tt i t e ri sa b o u t1 ：32 0 0 f u r t h e rw o r ki se n v i s i o n e dt o h a r v e s th i g h e rt i t e ra n t i b o d i e sa g a i n s te a c h p e p t i d ew i t hh i g hs p e c i f i c i t y 9 第四军医大学硕士学位论文 刖吾 随着社会的进步，人们对生命和健康更加珍视。对于疾病的认识和研究 也逐渐由大体水平发展到细胞和分子水平，特别是近年来涌现的的新技术使 人们更易于获取与某种疾病密切相关的基因并研究其编码蛋白的功能，这将 从根本上改变临床上相关疾病的预防、珍断和治疗。 二十世纪8 0 年代以来，随着癌基因及抑癌基因的相继发现，对肿瘤发生 的遗传机制研究已从染色体水平进展到分子水平。目前研究己表明，肿瘤是 细胞中多种基因突变积累的结果，这些基因突变主要发生在三类基因，即癌 基因( o n c o g e n e ) 、抑癌基因( t u m o rs u p p r e s s o rg e n e ) 和d n a 修复基因( d n a r e p a i rg e n e ) 。大多数肿瘤的基因变异悉为体细胞突变，包括点突变、扩增、 瞩排、缺失或甲基化状态的改变。当原癌基因发生突变导致其币常的结构和 功能发生改变，致使该基因表达异常及其编码蛋白质的活性改变，即可诱导 或促进肿瘤的发生和发展过程。抑癌基因是正常细胞所表达的基因，它具有 诱导细胞分化、维持稳定的细胞状态、诱导细胞的程序性死亡和调节细胞生 长等作用。一旦抑癌基因失活或其编码蛋白的活性异常，将导致细胞增填和 分化过程的失控，从而增加细胞的恶性转化倾向。 n d r 9 2 是本课题组用锚定p c r 法从f 常成人脑组织c d n a 文库中克隆到 的一个新基因，于2 0 0 0 年1 月提交至g e n b a n k ，登录名称为s y l d ，登录号为 a f1 5 9 0 9 2 。后经g e n b a n k 确认，本课题组发现的序列为人n d r 9 2 基因的 首次报道。n o r t h e m 印迹实验结果证明，该基因在7 2 种诈常组织中均有表达， 以脑组织中的表达最为丰富。而其具有在脑和脑胶质瘤组织的差异表达以及 在许多肿瘤细胞系中不表达或低表达的特性，推测n d r 9 2 为一抑癌候选基因。 第四军医大学硕士学位论文 目前，已报道n d r g 家族有4 个成员( n d r g l 、n d r 9 2 、n d r 9 3 和n d r 9 4 ) 。 基于以上陈述，本实验旨在克隆人n d r g 家族的其它成员，以探讨所编码 蛋白的结构特征和制备多克隆抗体。为此将所克隆的c d n a 序列插入原核表 达载体中进行诱导表达，纯化表达产物，用圆二色性分析预n - - 级结构。此 外，拟合成人n d r g 家族4 个成员蛋白序列中各自独特的寡肽片段作为半抗原， 与匙孔血蓝蛋白( k l h ) 偶联后用以免疫家兔，以期获得特异性抗体，为后 继深入的研究工作打下坚实的基础。 第四军医大学硕士学位论文 文献回顾 一、n d r g 家族的研究进展 嬲禧家族( n m y cd o w n s t r e a m r e g u l a t e dg e n ef a m i l y ) 是近年刁逐渐发现 的一族新基因。n d r g l 最初是在n - m y c 敲除的小鼠胚胎组织中发现的，因该 基因瓣表达受n m y c 鹣搀割瓣缮名，僵n m y c 对怎继发瑷瓣n d r 窭2 、n d r 9 3 和n d r g4 并无调控作用。此家族成员的氨基酸残基序列同源性很高，但各成 受在缀织中酌分布都稽差穰大。匿蘸针对n d r g 家族的研究多集中在搽讨其在 组织间的差异表达和分布及其在细胞增殖分化过程中的作用等方面。本文拟 扼要介绍有关n d r g 家族的研究现状。 l 。n d r g 家族的发理与结穆特征 1 + 1 小鼠n d r g 家族的发现及命名 s t a n t o n 等嘲和c h a r r o n 等翻在n + m y c 敲除游小鼠胚胎缀织中发现呈异常 高表达的一个新基因，即n d r g l 。当n 。m y c 表达丌始下降，细胞开始分化时， n d r 9 1 始有表达。提示在通常情况下，n d r g t 的表达受n m y c 的抑制性调控， i 夤基因由此恧得名1 3 1 。k o n d o h 等1 4 】在寻找n d r g l 楣关基因时，获得了n d r 9 2 和n d r 9 3 两个新基因。因此，先后所发现的三个基因构成了小敞的n d r g 家族。 然恧，在n m y c 藏狳豹，l 、鼠题驻组织中n d r 9 2 鞠n d r 9 3 无鞠鑫靛表达变化， 随明n d r 9 2 和n d r 9 3 可能并不受n m y c 的调节。 在研究，l 、鬣中撬狰经系统发育时，y a m a u c h i 帮n i s h i n a k a 等发魏了与 n d r g 家族功能密切相关的b d m l ( b r a i nd e v e l o p m e n t ，r e l a t e dm o l e c u l e1 ) 和 b d m 2 净“。它们在神经元的分化和早瀚的神经组织发育中发撵了十分麓要的 作用，但是其作用机制以及与n d r g 家族的确切关系尚瘸未知。 第四军医大学硕士学位论文 目前，本课题组重点研究n d r 9 2 作为一种抑癌候选基因的理论基础和实 验猿攫，蓉冀逶过分枣厅n d r 9 2 一 ：游调控嚣戆结构秘转录调控馋嚣、磅究其对 细胞增髓分化的影响以及n d r g 2 的蛋白质结构和功能结构域等方面，深化 对n d r g 2 功麓翡全蟊谈识。 3 。展望 目前人类对于恶性肿瘤发生的机制尚不完全明了。由于抑瘸基因的突变 或缺失丽弓l 发懿瓣瘤发蹩三已毒诲多事实佐证，灏魏疆究静癌基灏以及季露癌基 因的调节因子则具有重要意义。n d r g 家族对细胞增碴、分化的影响亦十分 瞩目。阐明n d r g 家族中各成员瀚差异髓表达和缀织分布，将有懿于揭示该基 因家族蛋白产物的具体生物活性及生理作用。 二、抗寡肽的多克隆抗体制备策略 随蓉基霹缝诗划戆完成，磷究各基因壤妈蘩自黎绝擒、功缝、定位以及 与其它鬣白的相互作用则成为当务之急。制备针对这些礞白质的特异性抗体 对于研究蛋自豹定位鞠功能仍怒至关重要的工 乍瞄j 。获得抗体至少有以下两 种方法：1 在合适的条件下克隆、表达、纯化目的蛋白，然后免疫动物制备 多克隆抗体或革克隆抗体：2 依据目的蛋白序列选取特异性的寡肽片段以宣 接合成褰肽，制备相应的抗寡肽抗体。抗寡肽抗体具有特异性赢的优点( 可 以与单克隆抗体相媲美) 。近年来，后一种抗体制备途径同益受到重视。 l 。制各抗寡歇的多竟隆抗体熬适照情况t 2 6 1 ( 1 ) 仅有魁的蛋白的部分序列； t 2 ) 目的鬃白的表达量很低，蛋白的分离、纯化较困难： ( 3 ) 需要制各同源性高的浆家族中冬成员的抗体，瓤又需要避免出现交 叉反应： ( 4 ) 针对莱一特定磷酸他位点夔摭体； 第四军暇大学硕士学位论文 针对一特定突变位点的抗体： ( 8 ) 针对浆一剪浚位点数抗体； ( 9 ) 甩免疫亲和层据方法从细胞糖提取物孛建诧髫的蛋国时，撬器脓摅 体懿藏特异媲十分重要。 2 。墓懿蘩宦寡歉亭裂的选择原委蓦 经过寡敢序列的仔细选择、寡胶合成、偶联和兔疫程序，大多数的寨膝 抗舔都能诱叟鞍好的抗髂。穗实践簸经验认为寡胶的选撵办有可资遵褥姻标 准。以下为较常用酶原雕： ( 1 ) 尽熬逸簿靠遥嚣自n 溺或c 潜序列； ( 2 ) 选撵豢东性强的氯基酸，避凫筑求性蟹纂酸，便予撬艨位点艴暴露 积抗体鹣谈澍； ( 3 ) 逶免霹缝的耱鏊纯露磷酸纯应点； ( 4 ) 运稻稽关豹软俸( 翔鹣摊w w w e x p a s y c b ) 进行二缀姥鞫的獭灞， 避免a 螺旋嚣域； ( 5 ) 寡肽的长度至少为1 5 个氯基酸残基，这主要楚傈证褰歙有较好的摅 缀性、稳定酌二缀缡构以及与载体器自偶联的戒功率； ( 6 ) 合成肽时要充分考虑到与载体蛋白偶联沈策略。靠近蛋自n 端的寡 效应以焚e 端与载俸连接，覆序嗣漂近豢国e 壤匏寡簸应以其n 端与 鼗体连接；装秃特爨夔援驳簇酶逸餐，霹以在寡黢夔一越添趣一个拳照 鬣黻，瘸鬻瘸英蔬蒸与载髂连接： ( 7 ) 对所选铎豹器簸彦列避彳亍嗣源靛分橱，避免与英它蛋岛有过多豁交 叉性； ( s ) 针对两一蛋稻，尽量选敬较多翁款段进行抗 奉翎备，以提高获褥特 20 第四军医大举硕士学位论文 异性挠铬静梳肇。 3 。偶联载体及偶联方法的选择 由于合成的寡肽序列较短、分予澄较小，在免疫动物时可能会在体内被 蛋白懿獐勰。强恧，多果弱与一大分予茧自矮糖羁联麴方法，增强其稳定性。 匙孔m 蓝蛋白( k e y h o l el i m p e th e m o c y a n i n ，k l h ) 和牛血清白蛋囱f b o v i n e s e r u m a l b u m i n ，b s a ) 跫最为露鬻静舔释偶联载体，它船适合予大多数的寡膝 偶联条件。但是，这两种载体各有利弊。k l t t 为海洋动物体内的蛋白，与陆 地上生物蛋融的同源程很低，翻于产生高特辩的抗体；但k l h 的分子量过 大，操作较为繁琐。丽b s a 的分子量较小，易溶于承，但有可能产生交叉反 应f 二引。 办有报道应用宓囊蛋t ! l ( o v a l b u m i n ) 、鼠敷清白蛋囱和兔壶清皇蛋自作为 偶联载体。 4 抗寡肽抗体的应瘸前景 随着蛋白质组学的深入研究，抗体的应用将更加广泛。丽抗寡肽抗体凭 着其高特异性和制备膈期短的优势，将在以后的研究中得到广泛的的丌发和 应用。特别是在针对禁个特定结构域、某个姆定懿磷羧化或糖基纯位点的研 究等方面，抗寡肽抗体的优势将更加明显。 第四军医大学硕士学位论文 实验部分 第一部分人n d r g l 、n d r 9 3 和n d r 9 4 一bc d n a 的克隆 嚣g西 人n d r 9 2 基因( n m y cd o w n s t r e a m - r e g u l a t e dg e n e2 ) 是本课题组于2 0 0 0 年觚e 常成人全脑e d n a 文霹中发躐和克隆得到的耨序列。初步磺究显