（生物化学与分子生物学专业论文）泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究.pdf

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和2 5 能耐p h 值2 。5 的酸 度和1 2 的盐浓度；而菌株17 、l9 和2 2 受p h 值的影响比较大，在低于p h 值3 o 的环境中较难生长并且当盐浓度达到1 0 后其生长受到严重抑制。菌株6 ，9 和2 5 的最适生长温度在3 0 3 7 ，而菌株1 7 ，1 9 和2 2 的最适生长温度在2 5 3 0 之 间。 不同菌种组合发酵萝卜泡菜试验中，含有菌株2 2 的组合发酵泡菜中前几天p h 值下降速度较快，而无菌株2 2 的菌种组合发酵中后期产酸量较大，酸味浓烈，但 各组合发酵在后期时其p h 值均有稍微的浮动，这是由于其微生物自身生长周期和 代谢物的积累造成的；萝卜泡菜中氨基酸含量很高，而且由于萝卜本身的维生素c 含量比较丰富，而在发酵过程中又损失较少，所以其最终含量也较高。从综合评 定结果中看出，以组合3 和组合15 发酵最佳。 对所选出的两个优良发酵剂组合在不同温度下发酵比较，得知环境温度越高， 泡菜发酵达到成熟的时间就越早，并且综合分析表明在1 2 15 左右时接种发酵 泡菜效果最好，在较低的温度下发酵虽然发酵周期要稍微长一些，但可避免过酸 或是过早酸败的可能，而且不易其它杂菌的生长，能起到延长保质期的作用。通 过测定泡菜中亚硝酸盐含量，得知接种发酵的泡菜亚硝酸盐含量明显低于自然发 酵。 通过试验分析表明，泡菜风味的优劣不是某一类或者某一些风味物质决定的， 而是各组成成分的交互作用形成了泡菜所特有的风味。因此对于风味有显著影响 的主要成分研究将是发酵蔬菜的一个重要研究。 【关键词】泡菜乳酸菌筛选发酵性能 扬州大学硕士学位论文 a b s t r a c t 2 一 p i c k l ei sat r a d i t i o n a lv e g e t a b l ep r o d u c t i o nw i t hl a c t i ca c i df e r m e n t i o n ，w h i c hh a s al o n gh i s t o r y f o rp i c k l eh a su n i q u ea n dd e l i c i o u sn a v o ra n dal o to fn u t r i t i o n e f f e c t i o n ，p e o p l ee n j o yi tv e r ym u c ha l lo v e rt h et i m e t h eo b j e c t i v eo f t h i st h e s i sw a s t os e l e c tt h es u p e r i o rs t r a i n s ，s oa st oi m p r o v et h eq u a l i t yo fd o m e s t i cp i c k l e i n t h i sr e s e a r c h ，s i xs t r a i n sw e r ei s 0 1 a t e df r o mm a n ys o r t so fp i c k l e sf o rt h e s u p e r i o rc h a r a c t e r i s t i c si na c i dp r o d u c t i o n ，d e g r a d a t i o no fn i t r i t ea n df e r m e n t a t i o n f l a v o r w i t ht h em o r p h o l o g i cc h a r a c t e r ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le x p e r i m e n ta n d s u g a rf e r m e n t a t i o n ，s t r a i n6a n ds t r a i n2 5w e r ei d e n t i n e da s 三口c f d 6 口c f ，“s6 ，p v f s ； s t r a i n9w a s 三口c f d 6 口c f ，“s ，打f ，z d ，；s t r a i n s17 ，l9a n d2 2w e r ei d e n t i n e da s 三p “c d 刀d s f d c g p ，扎拙聊t h eg r o w t h so fs t r a i n s17 ，19a n d2 2w e r er e s t i a n e da tt h ec o n d i t i o na tw h i c h t h ep hw a sl o w e rt h a n3 oo rt h es a l t yc o n c e n t r a t i o nw a sh i g h e rt h a n10 ，w h i l e s t r a i n s6 ，9a n d2 5c o u l dg r o wa tt h ec o n d i t i o na tw h i c ht h ep hw a sl o w e rt h a n2 5o f t h es a l t yc o n c e n t r a t i o nw a sh i g h e rt h a n14 t h ep r o p e rg r o w t ht e m p e r t u r eo fs t r a i n s6 ， 9a n d2 5w a sd u r i n g3 0 t o3 7 ：t h ep r o p e rg r o w t ht e m p e r t u r eo fs t r a i n s1 7 ，1 9 a n d2 2w a sd u r i n g2 5 t o3 0 b yt h ef e r m e n t i n go ft u r n i p i n o c u l a t e dw i t h d i f k r e n tc o m p o u n db a c t e r i aa s f e r m e n t a t i o na g e n t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： t h ec o m p o u n d sc o n t i a n e ds t r a i n2 2 p r o d u c e d a c i dm o r eq u i c k l yt h a no t h e rc o n l p o u n d sa tt h ep r o p h a s e ， w h i l et h e c o m p o u n d sw i t h o u tc o n t i a n e dp r o d u c e da c i dm o r ea n dq u i c k e ra t t h ea n a p h a s eo f f e r m e n t a t i o n b u ta l lo ft h ec o m p o u n d sh a dan u c t u a t i o no fp ha tt h ea n a p h a s eo f f e r m e n t a t i o n m a y b ei tw a sf o rt h e i rg r o w t hc y c l e sa n da c c u m u l a t i o no fm e t a b 0 1 i t e s t h ec o n t e n to fa m i n oa c i dw a sh i g h e ra n dv cw a sa f n u e n ti nt h et u r n i pp i c k l e ， m e a n w h i l et h e yl o s tl i t t l ed u r i n gt h ep r o c e s so ff e r m e n t a t i o n o v e r a l l ，c o m p o u n d3a n d c o u p o u n dl5w e r es e l e c t e da se x c e l l e n tf e r m e n t i n ga g e n t c o m p a r e dt ot h ef c r m e n t a t i o no fb o t he x c e l l e n tf e r m e n t i n ga g e n t s ，i ta p p e a r e d t h a ti n o c u l a t e df e r m e n t a t i o nw a sb e s ta t12 t o15 t h o u g ht h ec y c l e o f f e r m e n t a t i o nw a sl o n g e ra tt h el o w e rt e m p e r t u r e ，i tc o u l da v o i dr a n c i d i f i c a t i o na n d r e s t r a i no t h e rm i c r o b et og r o w i m p o r t a n t l y i tc a np r o l o n gt h eg u a r a n t e ep e r i o d t h e n i t r i t ec o n t e n to ft u r n i pi n o c u l a t e dw a sl o w e re v i d e n t l yt h a nt h a to fn a t u r a l f e r m e n t a tio n t h r o u g ht h ea n a l y s i s ，t h ef l a v o ro fp i c k l ew a sd e c i d e db yt h ei n t e r a c t i o no fe v e r y c o m p o n e n t ，n o tb yo n ek i n do ro n en a v o rs u b s t a n c e a n di t i sai m p o r t a n ts t u d yo f 薛凌燕：泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究 3 一 f e r m e n t i n gv e g e t a b l et h a tw h i c hn a v o rc o m p o n e n th a sap r o m i n e n te f 传c tt ot h ef l a v o r o fp i c k l e k e yw o r d s ：p i c k l e ；l a c t i ca i c db a c t e r i a ；s c r e e no u t ；f e r m e n t e dc a p a b i l i t y 扬州大学硕士学位论文 4 一 j _ j 一- _ 一 1 月i j 舌 1 1 概述 果蔬保鲜和加工贮藏的方法很多，主要有六大类：速冻食品、脱水制品、熏 制品、腌制品、罐头制品、辐照制品。腌制品是古已有之的保存和加工果蔬的方 法。泡菜是腌制品中的一种，是以湿态发酵方式加工制成的浸制品【l 】。泡菜主要是 靠乳酸菌的发酵生成大量乳酸而不是靠盐的渗透压来抑制腐败微生物的。泡菜使 用低浓度的盐水，或用少量食盐来腌渍各种鲜嫩的蔬菜，再经乳酸菌发酵，制成 一种带酸味的腌制品。只要乳酸含量达到一定的浓度，并使产品隔绝空气，就可 以达到久贮的目的。 泡菜的起源最早可追溯到距今3 1 0 0 多年前的商朝，商书说明记载有“欲 作和羹，尔惟盐梅”，说明在商代武丁时期，我国劳动人民就能使用盐来腌渍梅供 烹饪用；周礼天官记载：“下羹不致五味，侧羹加盐菜”，所谓羹是用肉或咸 菜做成的汤。中国最早的诗集诗经记载：“中田有庐，疆场有瓜，是剥是菹， 献之皇祖”，“庐”和“瓜”是蔬菜，“剥”和“菹”是腌渍加工的意思，据汉许慎 说文解字解释“菹菜者，酸菜也”【2 j 。西汉时期，酱菜初现，到了南北朝时期， 各种类型的酱腌菜已经相继出现。北魏著名的农学家贾思勰都在齐民要术中 较为系统和全面地介绍了腌菜、酸菜、酱菜的种类和制作方法。唐代时，高僧鉴 真和尚第六次东渡日本成功，把我国的盐渍菜制作方法传入日本，现在日本家喻 户晓的奈良渍就是鉴真所传。至今日本人还流传这样的诗句“豆腐酱菜数奈良， 来自贵国盲圣乡，民俗风气千年久，此地无人不称唐”，奈良是日本著名古城，盲 圣是日本人对鉴真和尚的尊称，唐即我国唐朝。到了1 3 0 0 年前韩半岛三国时代， 腌渍菜加工方法就传到了韩国，并结合韩民族的饮食文化，发展成为今日的韩国 泡菜。到了宋、元、明朝，我国的盐渍菜已有很大的发展，盐渍、酱渍、醋渍、 糖渍等蔬菜品种均有。盐渍菜传沿到清朝，其品种已是丰富多彩f 3 】。泡菜最早始于 中国。除中国外，韩国、德国、印度等国家也有自然发酵泡菜。各国泡菜具体制 作方法有所不同，目前国际上韩国泡菜最有名，1 9 9 7 年国际食品规格委员会会议 上，将泡菜的国际标记定为韩国“泡菜 两字发音的“k i m c h i ”，韩国清州大学2 0 0 0 年增设了泡菜食品科学专业。 1 2 泡菜的研究现状 泡菜是用低浓度食盐溶液来腌泡各种新鲜蔬菜，利用自然发酵或人工发酵制 成的一种带酸味的腌制加工品。泡菜含酸o 4 0 8 ，直接食用或做为调味菜， 其原料可采用萝卜、胡萝卜、莴笋、甘蓝、黄瓜等。我国较出名的泡菜有四川泡 菜，国外现已经形成庞大的泡菜工业，以韩国泡菜较为出名【4 】。国内外对泡菜的研 薛凌燕：泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究 究主要集中在四个方面，首先是泡酸菜发酵中的微生物，其次是生产工艺，第三 是发酵过程中物质的变化规律，最后是安全和营养性方面p j 。 1 2 1 泡菜微生物研究 对泡菜中微生物的研究主要包括两方面，一是自然发酵过程中的微生物，二 是人工发酵所用菌种的选择。泡菜是一种古老的蔬菜贮藏加工方法，直至二十世 纪初，随着微生物学的发展，人们才将蔬菜的腌制与微生物的活动联系起来，并 研究蔬菜发酵中的微生物学，这些研究至今仍很有价值。在国外p e d e r s o n ”j 在1 9 3 0 年首先研究了泡卷心菜中的微生物，指出了肠膜明串珠菌启动蔬菜发酵的过程； 并在1 9 5 3 年研究了蔬菜发酵中的微生物菌群，指出异型发酵的产品质量要优于同 型发酵；随后p e r d e r s o n 等进一步研究了酸白菜、酸黄瓜等自然发酵中的微生物， 发现，当白菜或黄瓜全部浸入盐水中时就进入了微生物发酵阶段，最初为异型发 酵阶段，然后是同型发酵，发酵初期是肠膜明串珠菌的异型发酵阶段，此时它的 数量最多，而且生长繁殖速度快，这是因为肠膜明串珠菌比发酵液中的其他乳酸 菌的代谢周期短，对酸的敏感性很强，随着发酵的进一步进行就会死去，肠膜明 串珠菌死后，短乳杆菌和植物乳杆菌等就占优势，最后由植物乳杆菌完成发酵。 除了上面几种微生物外，他们还从发酵酸菜中分离得到了弯曲乳杆菌、米曲醋杆 菌、粪肠球菌、融合乳杆菌、醋酸片球菌、啤酒片球菌，但这些微生物的作用还 不太清楚【6 】。杨瑞朋、方心芳、刘阴武等【_ 7 】还研究分离了其他微生物在代谢中出现 的顺序等。为了便于控制泡菜的质量，人们对人工接种发酵生产泡菜进行了大量 的研究。l o p e z 等报道在生产中采用纯菌种或者用肠膜明串珠菌、短乳杆菌、植物 乳杆菌的混合菌种接种发酵，最终产品质量与不接种的产品相差不大。研究发现， 同型发酵和异型发酵乳酸菌之间的恰当比例对于优质泡菜的生产是必要的，但这 一比例到目前仍不清楚【昏8 1 。p e d e r s o n 等【9 】在1 9 6 1 年研究了用乳酸菌对黄瓜进行 接种发酵，发现尽管开始加入的菌种不同，但到最后在发酵终止占统治地位的都 是植物乳杆菌。f a t i h 等1 9 8 1 年研究了几种常用乳酸菌( 明串珠菌、小片球菌、短 乳杆菌、植物乳杆菌) 在无菌白菜汁中的联合生长规律，结果显示：肠膜明串珠 菌被其他几种菌所抑制，而短乳杆菌和植物乳杆菌的生长则受益于这几种微生物 的相互作用。p e t a j a 等【1 0 】报道在酸菜中发酵用小球菌接种比用短乳杆菌或自然发酵 产酸能力强，但到p h 值降到3 5 以下时，酵母菌就开始生长( 包括有害酵母) ， 所以不能采用小球菌接种，应采用乳杆菌或者混合菌种。h a r r i s 等j 在1 9 9 2 年在 酸菜中分离出两株能产生乳酸链球菌肽( n is i n ) 乳酸乳球菌，并对其生理特点进行 了鉴定，他们以耐n i s i n 的肠膜明串珠菌和耐n i s i n 的乳酸乳球菌作为发酵的起始 微生物，可以抑制对n i s i n 敏感的植物乳杆菌，从而使肠膜明串珠菌快速繁殖到最 大细胞浓度，从而延长异型发酵阶段，提高酸菜品质。c h o i 等发现在韩国泡菜发 扬州大学硕士学位论文 6 酵过程中，使用低浓度的n i s i n 能降低自然发酵中的含酸量，如果使用高浓度n i s i n 或不添加耐n i s i n 的菌种，就会使革兰氏阳性菌大大减少，而革兰氏阴性菌大大增 加，从而引起产品腐败。国内，王禾等【l2 】以嗜酸乳杆菌为主要发酵菌种，使之与 经耐氧驯化的青春双歧杆菌混合培养，可以制出质地、风味、营养具佳的酸白菜。 毕金峰等【l 习从自然发酵的酸菜汁中分离出一株明串珠菌，用其发酵酸白菜，显示 出发酵初期生长快、产酸率高、风味柔和的特点。沈国华等f 1 4 】以筛选出的综合性 状较优的植物乳杆菌和干酪乳杆菌为主要发酵菌种，可制得品质稳定、口味上乘 的优质泡菜，其发酵速度比自然发酵至少提高了3 2 6 倍。 1 2 2 泡菜工业化生产工艺 随着对发酵蔬菜微生物学的研究，泡菜发酵工艺也取得了较大的成就，主要 集中在接种发酵生产、盐浓度、温度和p h 值对泡菜生长的影响【1 5 】。p e d e r s o n 和 a l b u r y 【1 6 】在19 6 1 年率先将纯菌接种发酵技术应用于泡菜的研究。随后，c a l d w e l l b i o f e r m e n t a t i o nc a n a d ai n c 在1 9 9 8 年获得了复合菌种接种发酵蔬菜的专利技术。 p e t a i a 等在2 0 0 0 年报道了发酵酸菜用小球菌接种比用乳杆菌或自然发酵产酸的能 力强，但当p h 值降到3 5 以下时，酵母菌就开始生长，因此应采用乳杆菌或混合 菌种发酵，我国成都市调味品研究所李幼筠等在1 9 9 6 年分离出于酪乳杆菌和短乳 杆菌，并申请了专利。蒋和体【1 7 】认为生产泡菜的纯接种应是植物乳杆菌、发酵乳 杆菌和肠膜明串珠菌这3 种菌以3 ：1 ：1 比例混合最佳。而罗云伯【l8 j 却认为以上3 种菌的混合比例应为5 ：3 ：2 最佳。孙利军等【1 9 】研究了纯接种植物乳杆菌对泡菜风 味品质的影响。杨瑞等【2 0 】探讨了温度与食盐浓度对乳酸菌区系的影响。阎征等【2 1 】 研究了p h 值对乳酸菌生长和乳酸产量的影响：终产物乳酸的积累是抑制乳酸菌生 长和导致乳酸产量下家的直接原因，该情况随发酵液中p h 值的降低而增强。 1 2 3 泡菜发酵过程中各物质的变化规律 曾凡坤等【2 2 】研究了四川泡菜罐头加工过程中的主要变化：v c 的破坏主要发生 在杀菌和预腌过程，乳酸发酵有利v c 的保存；发酵中还原糖、氨态氮降低，酸度 增加。苏扬等在2 0 0 1 年探讨了泡菜的风味化学及呈味机理：蔬菜组织中的糖与酸 互相消长极为明显，乳酸菌消耗糖产生大量的乳酸；v c 在低酸性隔氧泡菜中的损 失很少；含氮物质有所减少；钙与钠等矿物质显著高于新鲜原料，磷和铁的化合 物减少：泡菜水分基本上没有变化。杨瑞等1 2 3 j 也探讨了泡菜在发酵过程中总酸、 还原糖、氨态氮和v c 的变化规律。 1 2 4 泡菜的营养、安全性研究 近年来对泡酸菜的营养和功能的研究成为一个热点，泡酸菜中含有多种对人 体有益的乳酸菌，而乳酸菌被美国f d a 等机构列入公认安全范围。k i s h i d a 等从一 种乳酸杆菌发酵蔬菜中分离得到一株短乳杆菌凝集亚种，经人体实验证明可以刺 薛凌燕：泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究 7 一 激人体产生抗干扰素，增强人体免疫力。韩国研究人员发现，韩国泡菜有显著的 抗突变活性。l u c h e 等报道肠膜明串珠菌所生成的d ( 一) 乳酸不能被人体代谢利用， 婴儿和小孩不能食用，在德国利用短乳杆菌生产的l ( + ) 酸菜，被作为一种保健 食品出售。贾树彪等【2 4 】采用了l 一型乳酸的麦芽香乳杆菌和经诱变的3 个菌种( 肠 膜明串珠菌、短乳杆菌、植物乳杆菌) 进行了酸菜发酵试验，制得了一种l 一型乳 酸含量高的酸菜。居述林等【2 5 】报道以胡萝卜和卷心菜制成的泡菜汁可在体外使双 歧杆菌增殖4 8 倍。黄君红等【2 6 1 ，林燕文等2 7 】都对提高泡菜中的乳酸含量进行了 研究，以制得泡菜强化食品及利用泡菜开发廉价天然微生态调节剂。对泡酸菜安 全性的研究主要集中在生物胺和亚硝酸盐含量的研究上。影响泡菜亚硝酸盐含量 的因素主要集中在以下几个方面。( 1 ) 接种乳酸菌发酵能显著降低亚硝酸盐生成： 杨性民研究了人工接种对泡菜品质及亚硝酸盐含量的影响，结果表明人工接种亚 硝酸盐含量低，且无亚硝酸盐高峰。陆盛民等研究了不同发酵方法对泡雷笋品质 的影响：加入3 的陈泡雷笋水的泡菜其口感和品质最佳；接入植物乳杆菌的泡雷 笋产酸速度最快，亚硝酸盐含量最低，感官品质次之；自然发酵的发酵速度最慢， 感官品质最差，亚硝酸盐含量明显高于其他两种；( 2 ) 食盐浓度对泡菜中亚硝酸盐 含量的影响：段韩英、徐振相等研究发现食盐浓度对蔬菜腌渍发酵过程中“亚硝 峰 有很明显的影响，食盐浓度愈低，“亚硝峰”形成愈快、出现愈早，且峰值较 低；食盐浓度越高，亚硝酸盐生成越慢，亚硝酸盐峰值出现越晚，但其峰值较高， 最终产品中的亚硝酸盐含量也较高；( 3 ) 发酵温度对泡菜中亚硝酸盐的影响：郑桂 富等研究发现再发酵温度范围内( 7 3 0 ) ，温度高“亚硝峰”生成早，峰值低： 温度低“亚硝峰”生成较晚，且峰值高。徐振相等也研究得出：高温发酵，亚硝 酸盐生成快，但峰值低且消失得快；低温发酵，亚硝酸盐生成慢，含量高，高峰 持续时间长；( 4 ) p h 值对泡菜中亚硝酸盐得影响：酸性环境能抑制亚硝酸盐得生成， 发酵产酸的旺盛期即为亚硝峰的回降期。发酵初期，凡能迅速形成较高酸度的各 种措施，都能降低产品中的亚硝酸盐的含量，加酸能迅速降低发酵液的酸度。纪 淑娟研究了大白菜发酵过程中亚硝酸盐消长规律：通过调整p i 值，使p h 值在3 5 4 之间，利用高酸度来抑制亚硝峰的形成，加酸处理的亚硝峰水平低，亚硝峰不明 显。张庆芳等发现当p h 为4 0 时，亚硝酸盐开始进行酸降解，并且随着p h 值的 下降，这种酸降解逐渐增加，也即亚硝酸盐迅速分解。 1 3 泡菜中乳酸菌 泡菜发酵过程中主要有下面菌种参与：肠膜明串珠菌( 三p “c d n d s f d c 拼口s 口玎纪厂d f 如s ) 、植物乳杆菌( 三口c f d 6 口c f z z 甜sp 坛聆f 口r 钍掰) 、短乳杆菌( 三日。配6 凹矗如s 6 r p 0 括) 、薛氏丙酸杆菌( p 加p f 彻f 6 口c 地，f 姗2s 力8 ，- 肌口以豇) 、赖氏乳杆菌( a c f d 6 日c ! ，z “s ：一 沱f c 朋n ，z 玎f i ) 、干酪乳杆菌( 三口c ，dz ，口c f ，“jc 口s 口f ) 、戊糖醋酸乳r 杆菌、一双歧杆菌 扬州大学硕士学位论文 8 一 ( 曰力五如6 口c ，口r f “，竹) 等【2 8 】。 1 3 1 乳酸菌概述 在泡菜发酵的初期，好氧菌和酵母菌是占优势的微生物，而乳酸菌的数量较 少【2 8 。但在适当的盐浓度、温度以及缺氧条件下，乳酸菌的生长繁殖处于优势。 由乳酸菌引起的乳酸发酵是泡制过程中最主要的发酵作用。乳酸的产生不仅使酸 度降低，抑制不耐酸性杂菌的生长，而且对产品风味的形成具有重要的意义【32 1 。 乳酸细菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的细菌统称，这个名称就细菌分类 学而言实属一非正式、非规范的名称。这类细菌在自然界分布广泛，在土壤、植 物根际和许多的人类食品、动物的饲料，还有自然界的湖泊和河水、污泥以及一 些临床样品中都发现有乳酸细菌的存在。随着细菌分类学对各类细菌在生物进化 中地位研究的不断深入，进一步阐明和确立了乳酸类群细菌有关属种的位置，尚 有不少新发现。近年来乳酸类群细菌的属种变动较大，新属新种不断涌现。乳酸 细菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值很高。相当 多的乳酸细菌对人、畜的健康起着有益的作用，但其中有些菌也能对人、畜致病， 甚至是临床上重要的病原菌【3 3 j 。 乳酸菌可分为乳杆菌属( 三口c f 0 6 疗c f z ，“s ) 、链球菌属( & 厂p p 励c d c 彭5 ) 、明串珠菌 属( 三p 甜c d 刀o s 幻厂) 、双歧杆菌属( 曰f 力咖6 口c 砌一f “聊) 和片球菌属( p g d f d c d c c ”j ) 等 2 3 个属【3 4 】，其中上述5 个属对食品工业最为重要。如德氏乳杆菌( 三口c f d6 口c f z z “s ) 、 植物乳杆菌( 口c r d 6 口c f z z “s p 坛玎f 口，“m ) 和双叉乳酸杆菌( 口c f d6 口c f z f “s 6 泸d 甜s ) 等 【3 3 】 口 1 。3 。2 泡菜中乳酸菌的生理功能3 5 御】 具有净肠和抗菌作用：泡菜中的乳酸菌含量很高，达1 07 1 0 8 c f u m l 。乳酸菌 是参与调节人体肠道微生态平衡的主要菌系。泡菜中的乳酸菌菌体及其代谢产生 的有机酸和维生素对人体具有多种保健功能，可促进胃肠道蠕动，帮助消化，防 止便秘等。乳酸菌产生的有机酸对食品中微生物也具有较好的抑制作用。 c h a n g h 0 0 nk a n g 等【4 0 】将6 种肠致病菌接种到大白菜种发酵，当p h 值3 9 时，已 检不出大肠杆菌，当p h 3 7 时，梭菌属、埃希式菌，沙门菌属和葡萄状球菌均未 被检出。e l a i n e e 等试验表明，由甘蓝、番茄上分离得到的乳酸菌可产生抑制金黄 色葡萄球菌的细菌素。乳酸链球菌素n i s i n 对革兰阳性菌具有广谱的抑制作用，目 前作为天然防腐剂已在许多国家和地区使用。 抗突变活性和预防脑溢血：p a r k k y 【4 1 】研究发现，泡菜在a m e s 试验和s o s 显 色试验中均显示出显著的抗突变活性。h e u id o n gp a r k 等【4 2 】从泡菜中分离出来的 三口c 幻6 口c f z ，“sp 肠以砌，“m 具有较强的抗突变活性。 抗癌效果：泡菜中丰富的v c 和胡萝卜素能起抗癌作用。w b o n y o u gc h o i 等【4 3 l 薛凌燕：泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究 9 用甲醇提取发酵6 d 后的卷心菜，将提取物用来喂养患有a g s 一胃癌细胞的老鼠， 结果6 0 7 的胃癌细胞的生长受到抑制，并减少了癌细胞的生成，延长了试验组 老鼠的寿命。k e u n o kj u n g 等【4 4 】将发酵的韭菜汁经二氯甲烷蒸馏后用来研究它对 人类胃腺癌和结肠癌的治疗效果：服用0 1 m g m 1 提取物4 周后，能将a g s 一胃腺癌 和h t 一结肠癌细胞的存活率分别降低到1 9 和3 7 。 抗动脉硬化和抗肥胖作用：泡菜中辣椒的成分c a p s a i s i n 能促进代谢，分解 体内脂肪。s u n m ic h o i 等【4 5 1 研究发现泡菜中辣椒对老鼠体重具有显著减轻作用， 且能有效克制血栓的形成，预防动脉硬化。泡菜属于高纤维、低热量食品，有助 于消化，可减少脂肪积累，具有减肥作用，这一点已在动物试验中得到证实。日 本京都大学对人体做的试验结果也显示，泡菜有减肥的特效。 抗衰老作用：j o n g h y e nk i m 等【4 6 】研究了泡菜对小鼠大脑中抗氧化酶活性和自 由基产生的影响，研究表明，泡菜有延缓衰老的作用。 1 3 3 乳酸菌的乳酸发酵作用印 泡酸菜发酵过程中的有益微生物发酵主要有乳酸发酵、酒精发酵和醋酸发酵。 其中乳酸发酵起主导和决定性作用【35 1 。 乳酸菌以单糖( 葡萄糖、果糖、半乳糖) 、二糖( 蔗糖、麦芽糖、乳糖) 为基 质，外界还必须提供氨基酸、维生素等多种生长因子，代谢产物主要是乳酸。有 些乳酸菌属耐气性厌氧微生物，它们的产能不需氧，但在有无氧的条件下都能进 行典型的乳酸发酵。 大多数乳酸杆菌能通过特殊的透膜酶作用，转移进入细胞，并经b 一半乳糖苷 酶将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖再由李洛氏途径转变为葡萄糖，然后通 过糖酵解途径进一步转化为乳酸。少数乳酸杆菌和大多数乳酸链球菌则通过磷酸 转化酶作用，将乳糖磷酸化后进入细胞，水解成葡萄糖和6 一磷酸半乳糖，后者经 6 一磷酸塔洛糖进入糖酵解途径【4 7 】。由于菌体内酶系统的差异，乳酸菌发酵有异型 发酵和同型发酵两种途径。 1 3 4 乳酸菌的代谢产物【4 8 】 乳酸菌产生的代谢产物，为食品提供芳香风味和良好的质地，防止食品腐败 变质，同时具有减少蔬菜在发酵过程中的营养损失，抑制发酵食品中可能的病原 菌的生长等多种功效。 1 3 4 1 酸性末端产物 乳酸菌对人体的良好作用，大部分归功于它们的酸性代谢产物。它们通过同 型发酵核异型发酵作用，产生乳酸、乙酸等主要有机酸，这些酸性末端产物具有 很强的抑菌作用，酸的产生伴随着p h 值下降，延长了敏感细菌生长时的迟滞期。 1 3 4 2 双乙酰 扬州大学硕士学位论文 1 0 双乙酰属于芳香风味物质，可由乳酸菌的各个属的菌产生。它对许多微生物 包括病原菌如结核分支杆菌有抑制作用。s p i l l m a n 等实验证明，几个p p m 的双乙酰 就能抑制大肠杆菌，而且，随着p h 值的降低，抑菌活性逐渐加强。j a y 也证明， 低p h 对双乙酰的抗菌活性具有增效作用。双乙酰是通过革兰氏阴性菌的精氨酸结 合蛋白反应干扰对精氨酸的利用，从而达到抑制生长的目的。 1 3 4 3 乙醛 乙醛是碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸等代谢的重要中间产物，乙醛主要 由短乳杆菌产生。 1 3 4 4 细菌素 “ 乳酸菌产生的抗菌物质大多是肽或蛋白质，被称为细菌素。很多乳酸菌都能 产生细菌素。r o g e r s 第一个报道了由乳酸乳球菌产生的对保加利亚乳杆菌有抑制 作用的物质n i s i n ( 乳链球菌素) ，它的抗菌谱包括抑制链球菌、葡萄球菌、芽孢菌 中的一些种、梭菌及其它乳杆菌，特别是抑制芽孢的形成，而对人未发现毒性， 因此，成为一种新型食品添加剂。 1 3 5 乳酸菌鉴定技术【4 9 】 选择适宜的菌种做发酵剂是得到优良发酵制品的先决条件【5 0 1 。筛选菌种应遵 循的原则为：性状稳定，生长繁殖迅速，在蔬菜发酵环境中具有较强的生存竞争 能力，易保存且存活期长，产酸缓和，产香性强，对亚硝酸盐的降解能力强，且 不产生生物胺等【5 1 1 。对于泡菜乳酸菌的筛选，有些乳酸菌有产生生物胺的能力， 如乳酸杆菌属的某些细菌可以脱去特定的氨基酸的羧基而生成酪胺、苯基乙胺、 组胺、腐胺和尸胺等，这些化合物对人类的健康非常不利。因此，筛选没有氨基 酸脱羧能力的乳酸菌应用于生产，能提高产品的安全性【5 2 1 。 乳酸菌的鉴定方法与一般细菌的鉴定方法类似，大体上可分为表形特征鉴定 方法，化学分类法和基于d n a 、r n a 的分子生物学及基因水平的鉴定方法【43 1 。 1 3 5 1 表型特征鉴定方法【3 3 ，5 3 ，5 4 】 ( 1 ) 形态和生理生化特征鉴定法。形态和生理生化特征鉴定是实验室进行菌 种鉴定中最常用和最关键的环节，其中形态特征包括群体形态特征和个体形态特 征。群体形态特征又分为( a ) 平板上的菌落特征，包括菌落形状、大小、边缘、 表面及质地( 光滑、粗糙、湿润、烦躁与光泽等) 、隆起程度、易挑取性或粘稠度、 透明度与色泽等；( b ) 液体培养特征，包括生长量、生长类型与分布、混浊度、 表面生长状态、沉淀物、气味和颜色等。对乳酸菌来说，对鉴定具有重要意义的 个体形态特征主要又革兰氏染色、细胞形状、大小和排列方式、运动性、是否有 芽孢、鞭毛等。 细菌生理生化特征鉴定经常测定的项目包括：水解大分子的能力，如淀粉水 薛凌燕：泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究 解、油脂水解、明胶液化等试验；分解糖或醇类产酸产气试验：其他产物的种类 与数量，如糖或醇类发酵试验、甲基红试验、v p 试验；分解蛋白胨中氨基酸的能 力，如吲哚试验和h 。s 试验。此外，还有硝酸盐还原试验、柠檬酸盐或丙酸盐利用 试验和丙二酸盐利用试验等。用作分类鉴定特征的酶主要有：氧化酶、过氧化氢 酶、凝固酶、氨基酸脱羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脱氨酶等。对乳酸菌鉴定 来说，比较重要的生理生化试验包括：氧化酶试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还 原试验、明胶液化试验、各种糖发酵试验等。 ( 2 ) 抗菌谱试验分类法。不同种类的细菌对不同抗菌药物的敏感性不一，同 一种细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也常存在差异，不过后者的差异仍 有一定的范围，对抗菌药物的敏感性的差异程度往往显示了不同种类细菌所具有 的特征，所以这种特征可以成为细菌分类鉴定上的指正。在乳酸菌的鉴定中也是 如此，不同的乳酸菌都有其各自的抗菌谱，而对每一种抗生素，不同的乳酸菌会 表现出不同的敏感度，从而做出判断。 1 3 5 2 化学分类法【弱，4 7 5 6 j 化学分类法是应用电泳、色谱和质谱等分析技术，根据微生物细胞的组分、 代谢产物的组成与图谱等化学分类特征进行分类的方法。乳酸菌的菌体组分或代 谢产物在不同种属间存在差异，通过测定这些成分的含量，可以进行菌种鉴定。 如：乳酸茵代谢葡萄糖产生乳酸的量及其旋光性的测定，乳酸茵含有的醌分析， 细胞壁肽聚糖组分和结构分析、菌体脂肪酸组分、菌体单糖及其它生物大分子分 析等。目前在国家标准检测方法中，利用气相色谱法对双歧杆菌和乳酸杆菌进行 属间鉴定已成为必做项目之一。 1 3 5 3d n a 的分子生物学及基因水平的鉴定方法【3 3 ，4 6 ，4 8 ，5 5 】 随着细胞学、分子生物学和遗传学等学科的发展及其研究方法和技术对细菌 分类学的渗透，使细菌分类学逐渐提高到了一个新的水平。从2 0 世纪6 0 年代以 后细菌分类学步入分子生物学时代，使细菌分类工作在研究自然界各类群细菌种 类及其相互间的亲缘关系、探索建立自然分类系统方面加速了前进的步伐。 主要包括：( 1 ) 保守生物大分子分析【4 9 】；( 2 ) d n a 指纹图谱技术：( 3 ) 基因组全 序列杂交核酸是遗传物质的基础，除r n a 病毒外，其他生物的遗传性状都是由d n a 上核苷酸编码的。d n a 同源性分析是确定正确的分类地位、建立自然分类系统的最 直接的方法，而d n a d n a 杂交是分析d n a 同源性的一种有效手段。利用d n a d n a 杂交可以在总体水平上研究微生物间的关系，用于种水平上的分类学研究。 1 4 论文研究背景和意义 我国是蔬菜种植大国，近年来，蔬菜年产量均在5 亿吨以上，蔬菜的品种数 量、总产量、人均消费和出口均居世界前列。但目前蔬菜深加工水平还很低，常 扬州大学硕士学位论文 1 2 出现新鲜蔬菜供过于求、大量新鲜蔬菜积压变质等现象，严重影响了农民种植蔬 菜积极性。而改进蔬菜深加工方法正是解决问题的有效途径之一。蔬菜发酵是一 种冷加工方式，对原料无需多加处理，能极大程度地保持原料风味和营养，还可 节省能源，是一种营养简便的蔬菜加工方法。而且现代微生物技术在传统加工业 的应用，使泡菜逐渐实现工业化、规模化、标准化的生产。虽然，近年来我国的 蔬菜出口也在逐年增长，出口品种日趋多样化，出口市场日益扩大。但我国的蔬 菜出口业务仍然面临着许多问题，如产品结构单一、质量较差，国际蔬菜市场竞 争日趋激烈等等。目前，韩国泡菜和日式泡菜日益盛行，占据了广大的国际市场： 韩国和日本正在致力于泡菜制作工艺的改进，并且不断扩大它们的国际泡菜市场， 拟将打进中国和东南亚。这必将对我国的泡菜产业产生巨大的冲击，因此保护我 国传统的发酵蔬菜制品，使其在激烈的国际竞争中占有一席之地，生产出具有高 质量的泡菜制品势在必行。 蔬菜的乳酸发酵是一种传统的蔬菜保藏方法和风味产品的制作方法【57 1 。传统 的泡菜主要依靠天然附着在蔬菜表面的微生物( 主要是乳酸菌) 进行乳酸发酵，加上 食盐( 6 16 ) 的高渗透作用抑制其它杂菌的生长，达到泡制保存的目的。这样传 统的发酵泡菜中存在着很多的问题：( 1 ) 食盐浓度过高食用过多的食盐会使人 的某些器官和肾脉、心血管系统造成永久性损伤1 5 引。日本也提倡低盐少糖适酸的 腌菜【5 9 1 ；( 2 ) 质量不稳定传统的发酵泡菜的质量极不稳定，在储存过程中质构 易软化，表面“生花”等引起发酵泡菜的风味改变；( 3 ) 产生有毒物质传统发 酵食品中除含有大量的乳酸菌以外，还含有其它大量的杂菌，其中包括腐败菌的 存在。某些杂菌能产生硝酸盐的还原酶，使亚硝酸盐的含量增加【6 引。低盐发酵泡 菜对人体有益，但是低盐往往使发酵泡菜过酸，过酸的发酵泡菜绝大多数消费者 不能接受，而且酸度太大，对人体的胃具有强烈的刺激作用。 鉴于上面传统发酵泡菜的种种弊端，所以分离乳酸菌，对泡菜进行纯种发酵 有了必要。所以从发酵菌株方面改进我国泡菜生产质量具有很大的经济价值和实 际意义。人工接种发酵能明显改善以上不足，并且由于人工接种后能明显降低泡 菜中亚硝酸盐的含量及能提前达到亚硝峰，提高了泡菜的食用安全度；然而接种 发酵产品的风味比较单调，不如自然发酵法生产的产品丰厚饱满。所以筛选优良 发酵菌种，再利用混合发酵技术模拟自然条件接种发酵，并结合其它发酵工艺， 目的是在提高产品风味和质量的同时缩短发酵周期，不仅具有理论价值，更有实 践的指导意义。 本研究旨在从多种泡菜中筛选出较优的发酵菌种，对其生长特性进行研究， 从而得到产酸快，发酵风味良好的新菌株。研究成果对促进和加快泡菜这一传统 食品的现代化生产，缩短泡菜生产周期，降低成本，提高产品质量和产品生产的 薛凌燕：泡菜中优良发酵剂的筛选及初步研究 技术含量及经济效益具有重要意义。 1 5 本论文研究的主要内容 研究的主要内容有： ( 1 ) 泡菜的制作 ( 2 ) 从不同来源的泡菜中初步筛选出优良菌株 ( 3 ) 对所选菌株进行鉴定，生长性能测定，并做进一步筛选 ( 4 ) 选取较优的菌株进行优良发酵剂的筛选 ( 5 ) 优良发酵剂发酵性能的初步研究 扬州大学硕士学位论文 2 材料与试验方法 2 1 试验材料、试剂与仪器设备 2 1 1 试验材料 大白菜，刀豆，萝卜，胡萝卜( 购于本地菜市场) 食盐，八角，生姜，陈皮，白酒，白沙糖( 购于大润发超市) 各种市售泡菜成品( 购于东关街市场) 2 1 。2 主要试剂 蛋白胨： ，一一 天津市大茂化学试剂厂 酵母提取物：北京鼎国生物技术发展中心 牛肉膏：上海生物制品研究所生化试剂厂 吐温8 0 ：上海生物制品研究所生化试剂厂 琼脂：上海青析化工科技有限公司 生化鉴定管：杭州天河微生物试剂有限公司 葡萄糖天津科密欧试剂有限公司 3 ，5 一二硝基水杨酸上海试剂二厂 柠檬酸三铵、乙酸钠、磷酸氢二钾、葡萄糖、m n s 0 4 h 2 0 、m g s 0 4 7 h 2 0