（生物物理学专业论文）脂筏结构拆离与重建的原子力显微镜研究.pdf

脂筏结构拆离与重建的原子力显微镜研究 专业生物物理学 研究生郝长春指导教师孙润广 摘要目的：通过系统的研究人工制备双层生物膜中卵磷脂、脑磷脂、胆固醇、 鞘磷脂、神经酰胺的相互作用，从分子动力学角度分析结构形成的原因。研究分 子具有的官能团在形成结构中作用，从而为组装生物膜的脂筏结构奠定基础。再 通过体外模拟和体内分离相结合的方法，从细胞中分离脂筏，对其结构、组成成 分、物理性质和化学性质进行研究，探索脂筏结构和功能的生物学特性。 方法：1 利用l b 技术测试单分子层膜的平均分子面积和表面压力等温线， 采用y 型提膜方法保持一定的膜压在新解离的云母片上制备脂双层膜。2 用原 子力显微镜检测不同脂成份形成的脂双层膜结构。3 通过蔗糖密度梯度离心，用 去垢剂处理质膜样品提取脂筏成份。 结果：1 对于单元系统，磷脂酰胆碱单层膜的等温线都表现出明显的相变点， 而鞘磷脂、胆固醇没有明显的相变点。原子力显微镜观察到磷脂酰胆碱分子结构 容易形成聚团的微区囊泡结构，鞘磷脂则易于形成结构均一的双层膜结构。胆固 醇易于聚团，形成片层结构。通过单元系统的实验，熟悉掌握了制备人工双层膜 系统，为下一步进行多元系统实验奠定基础。 ， 2 对于二元系统系统，等摩尔配比的鞘磷脂( s m ) 磷脂酰胆碱( p c ) 、鞘磷 脂( s m ) 磷脂酰乙醇胺( p e ) 和鞘磷脂( s m ) ，胆固醇( c h 0 1 ) 表现出不同的结 构特征。s m p c 能形成具有周期性的波纹结构，在较大的膜压下能形成圆形的微 区结构，飘浮在液态p c 上。在膜压最大时，双层膜表现为稳定地片层结构。对于 s m p e 组成的系统，在较低膜压下，形成了边界非常明显的微区结构，微区内部 两组份形成了聚集体结构。在较大的膜压情况下，形成大片层和紧密的聚集体结 构。而s m c h o l 则在低膜压下形成均一的结构，云母表面的覆盖率在6 0 以上， 均匀分布，结构鲜明。当在较高膜压时能形成稳定的具有许多孔洞的片层结构。 3 对于三元系统系统，主要研究了等摩尔配比的s m c h o l p c 、s m c h o l p e 和s m c h o l 神经酰胺( c e r a m i d e ) 混合物的双层膜结构特性。同时研究了不同比 例的c h o l 在s m p c 中的分布。结果表明，s m c h 0 1 p c 能在中间膜压情况下形成 圆形的结构微区，s m c h o l 形成紧密的液态有序相，大小约为2 0 0 h m 。在膜压较 高的情况形成了多孔洞的片层结构。对于s m c h o i p e 不能形成规则的微区结构， 易于形成脂质体小泡状结构。而s m c h o l c e r a m i d e 在低膜压下形成均匀的分散的 多片层结构，在中间膜压形成了更加紧密聚集的颗粒结构，颗粒表现为中间低边 缘高的结构特性，这与提出的脂筏结构相似。当在s m p c 中逐渐加入c h o l 时，实 验发现，胆固醇和带饱和脂肪酸链的磷脂发生相互作用形成微区结构，随着胆固 醇含量的增加，微区的面积逐渐增大，形成了稳定的片层结构。在三元系统的基 础上，对多元系统的结构进行了观测，研究了不同比例的c e r a m i d e 在等摩尔 s m p c 伦h o l 中的分布。随着神经酰胺比例的增加，先形成紧密的聚集态结构，然 后逐渐演变成具有特定微区的网状结构。 4 提取细胞脂质成分组装和脂筏分离的结构检测。用蔗糖密度梯度离心法从 人血红细胞中分离不溶于去垢剂t r i t o nx 1 0 0 的膜筏成份。原子力显微镜三维结构 测定表明单个脂筏以颗粒聚集体的形式存在，直径约2 1 0 竹小的扁圆形中间凹陷结 构。分离干燥血影成份的l b 膜结构表现为稳定的片层和聚集体共存结构，具有特 定的结构微区特性。实验数据表明体外进行细胞膜脂筏结构模拟组装与在体分离 方面具有相同的结构。 结论：l b 双层膜的制备与多种因素有关，如温度、p h 值、浓度等。不同分 子所具有的官能团决定了结构的形成。不同的官能团赋予了分子具有不同的氢键 结合能力形成微区结构，在研究系统中，胆固醇与其它分子发生相互作用的优先 顺序为：神经酰胺) 鞘磷脂，磷脂酰胆碱。脂筏颗粒聚集体易形成扁圆形中间凹陷 结构，这些微区结构可能在细胞信号传导等生理活动中起到重要的作用。 关键词：原子力显微镜l b 技术脂筏蔗糖密度梯度离心技术 s t u d yo nt h ei s o l a t i o na n dr e c o n s t r u c t i o no fl i p i dr a f t s w i t ha t o m i cf o r c em i c r o s c o p y m a j o r ：b i o p h y s i c s p o s t g r a d u a t e ：h a 0c h a n g - c h u n a d v i s o r ：s u n r u n g u a n g a b s t r a c ta i m ：t h em o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sw e r e s t u d i e di nt h ep r e p a r e db i l a y e r s c o m p o s e d o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ， c h o l e s t e r o l , s p h i n g o m y e l i na n de c r a m i d e w ea n a l y z e dt h er e a s o no ft h ef o r m a t i o no fd i f f e r e n t s t m c t u r a sa n df u n c t i o no ft h eg r o u p so fe a c hm o l e c u l ei no r d e r e dt or e c o n s t r u c tt h el i p i d r a f t ss t r u c t u r e w ed ot h er e s e a r c ha b o u tl i p i dr a f t su s i n gp r e p a r i n gt h el i p i dr a f t sf r o m t h ec e l l sa n ds i m u l a t i n gi nv i t r o ，i n c l u d i n gt h es t r u c t u r e ，c o m p o s i t i o n s ，a n dt h ep h y s i c a l a n dc h e m i c a lp r o p e r t y f u r t h e rs t u d yr e v e a l e dt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fl i p i dr a f t s m e t h o d s ：1 w ec o u l do b t a i nt h em e a nm o l e c u l a ra r e aa n ds u r f a c ep r e s s u r e i s o t h e r m so fm o n o l a y e rb yl bt e c h n i q u ea n dp r e p a r et h eb i l a y e r so nt h er e f r e s hm i c a k e e p i n gt h ec e r t a i ns u r f a c ep r e s s u r eu s i n gyt y p em e t h o d 2 o b s e r v a t i o nt h es t m c t o r e s o f b i l a y e r sc o m p o s e d o fd i f f e r e n t l i p i d sb y a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y 3 d e t e r g e n t - r e s i s t a n tm e m b r a n e sf r a c t i o no fh u m a ne r y t h r o c y t ew a s ；i s o l a t e db yt r i t o n x - 1 0 0u s i n gs u o o s ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o nm e t h o d r e s u l t ：1 t h es i n g l es y s t e m ，t h em o n o l a y e ro fp h o s p h a t i d y l c h o l i n es h o w e dt w o c l e a rp h a s ep o i n t ，b u tf o rc h o l e s t e r o la n ds p h i n g o m y e l i nw ec o u l dn o to b s e r v et h ep h a s e p o i n t n ea f me x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ep cm o l e c u l e sc o u l dt e n dt of o r mt h e c o m p l e xs t r u c t u r e ，m e a n w h i l e ，t h es ma p p e a r e df l a t ，u n i f o r m l y i ns h a p e t h e c h o l e s t e r o lf o r m e dt h es t e a d ys h e e tl a y e r a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t ，m a s t e rt h e m e t h o do fp r e p a r i n gt h eb i l a y e r st oe s t a b l i s hf o u n d a t i o nt of u r t h e rs t u d yt h ec o m p l e x s y s t e m s 2 f o rt h eb i n a r ys y s t e m , t h ee q u i m o l a rs m p c ，s m p e s m c h o ls h o w e d d i f f e r e n tc h a r a c t e ro fs t r u c t u r e s m 【d o p cc o u l df o r mb i l a y e r sw i t hc o r r u g a t e d s t r u c t u r e sa tt h el o ws u r f a c ep r e s s u r e w h e ni n c r e a s e dt h es u r f a c ep r e s s u r e ，t h eb i l a y e r s t o o ko nr o u n dm i c r o d o m a i ns t r u c t u r e ，f l o a t i n go nt h el i q u i dp c t h e yc o u l df o r mt h e s h e e tl a y e ra st h es u r f a c ep r e s s u r er e a c h e dt ot h em a x i m u m f o rt h es m p es y s t e m ，a t t h el o ws u r f a c ep r e s s u r e ，t h e yc o u l df o r mm i c r o d o m a i ns t r u c t u r ew i t hc l e a rb o u n d a r y ，i n t h em i d d l eo fi t ，t h e r ew e r em a n yc o m p l e x e s a tt h eh i g l ls u r f a c ep r e s s u r e ，t h e ys h o w e d b i gf l a ts h e e ta n dc o n d e n s e ds t r u c t u r e s f o rs m c h 0 1 t h e r ea p p e a r e du n i f o r ms t r u c t u r e w i t hc o v e r e dm i c aa b o u t6 0 t h e yc o u l df o r mt h ec o n d e n s e ds t r u c t u r ew i t hm a n y s m a l lh o l e si ni t 3 f o rt h et e r n a r ys y s t e m ，w ec h o s et h ee q u i m o l a rs m c h o i p c ，s m c h o l p ea n d s m c h o l c e r a m i d em i x t u r e sa sm a t e r i a l st op r e p a r et h eb i l a y e r s m e a n w h i l e ，w es t u d i e d t h ee f f e c to fd i f f e r e n tc h o l e s t e r o lc o n t e n ti nt h ee q u i m o l a rs m c h o lb i n a r yb i l a y e r s t h e r e s u l t so fe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tl a r g ed i f f e r e n c e si nt h es i z ea n ds h a p eo fd o m a i n si n t h ed i f f e r e n tm i x t u r e s f o rs m c h o ls y s t e m s ，t h em o r p h o l o g i c a la n a l y s i sr e v e a l e dt h a t t h e r ew a sr e g u l a r , f l a tm i c r o d o m a i n s a d d i n gd o p c ，t h e r ea p p e a r e dr e g u l a r , r o u n d m i c r o d o m a i n s s t r u c t u r e ，b u t f o rd o p e , i tw a sd i f f i c u l tt of o r mt h e r e g u l a r m i c r o d o m a i n s t h e yc o u l df o r ml i p i dv e s i c l es t r u c t u r e w h e na d d i n gt h ec e r a m i d e ，t h e i m a g e ss h o w e dt h e r ew e r em a n yg r a n u l e so nt h em i c a t h es t r u c t u r ew a sr o u n dw i t h h o l l o wo nt h ec e n t e r ；i tw a ss i m i l a rw i t hp r o p o s e dl i p i dr a f t s t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e d t h a tc h o l e s t e r o lc o u l di n t e r a c tw i t hs mo fs a t u r a t e dl i p i dc h a i nt of o r mt h e m i c r o d o m a i n ss t r u c t u r e t h em i c r o d o m a i n ss t r u c t u r eb e c a m eg r a d u a l l yl a r g e ra n dl a r g e r w i t ht h ei n c r e a s i n gc h o l e s t e r 0 1 i nt h ee n d ，t h e yf o r m e dt h es t a b l es h e e ts t r u c t u r e s b a s e do na b o v er e s e a r c h ，f o rt h em o r ei n g r e d i e n t ss y s t e m ，a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y h a db e e nu s e dt os t u d yt h ee f f e c to fc e r a m i d ei nt h ee q u i m o l a rs m d o p c c h o lt c r u a r y b i l a y e r s t h es t r u c t u r ef o r m e dt h ec o m p l e xf i r s t l y , a n dt h e ne v o l v e dt h ep a r t i c u l a r n e t - s h a p e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fc e r a m i d e 4 t h ei s o l a t i o na n dm e a s u r e m e n to fl i p i dr a f t s d e t e r g e n t - r e s i s t a n tm e m b r a n e s f r a c t i o no fh u m a ne r y t h r o c y t ew a si s o l a t e db yt r i t o nx 一1 0 0u s i n gs u c r o s ed e n s i t y g r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o nm e t h o d t h ea f mi m a g e ss h o wt h a tt h es i n g l el i p i dr a f te x i s t e d i nt h ef o r mo fp a r t i c l ec o m p l e xw i t ht h ed i a m e t e ro f2 1 0n n t h es t r u c t u r ew a sr o u n d w i t hh o l l o wo nt h ec e n t r e t h el bb i l a y e r so fi s o l a t e d “g h o s t s h o w e dt h a tt h es t a b l e s l i c ef o r m e dw i t hm a n yc o m p l e x e s ，w h i c hh a dc e r t a i ns t r u c t u r ep r o p e r t y t h ed a t ao f e x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e dt h a t t h es i m u l a t i o no fl i p i dr a f t sw a ss i m i l a rw i t hi s o l a t e d l i p i dr a f t si nt h ea s p e c to fm o r p h o l o g y c o n c l u s i o n s ：t h ep r e p a r i n go fl bb i l a y e r sw a sr e l a t i o nw i t hm a n yi n g r e d i e n t s ， s u c h 鹋t e m p e r a t u r e ，p hv a l u e ，i n t e n s i t ya n ds oo n t h es t u d ys h o w e dt h ef o r m a t i o n so f c e r t a i ns t r u c t u r e sw e r em a i n l yd u et ot h ei n t e r a c t i o no fd i f f e r e n tf u n c t i o n a lg r o u p so f e a c hm o l e c u l e d i f f e r e n tf u n c t i o n a l g r o u p sm a d et h em o l e c u l e sp o s s e s sd i f f e r e n t h y d r o g e nb o n dc a p a c i t yt of o r mt h em i c r o d o m a i ns t r u c t u r e i no u rs y s t e m s ，t h e i v s e q u e n c eo fc h o l e s t e r o li n t e r a c t i o nw i t ho t h e tm o l e c u l e sw a sc e r a m i d e s m d o p c t h e s em i c r o d o m a i n st h a tf o r m e dt h el i p i dr a f t s c o m p l e x e s s t r u c t u r em a yh a v e i m p l i c a t i o n sf o rc e l l u l a rs i g n a l i n g k e y w o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y l bt e c h n i q u e f i p i dr a f t s s u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o nt e c h n i q u e v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：壶至丝查日期：! z ：丝：! i 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：盘丝查日期：塑! ! 、堕 第一章绪论 生物膜是由脂类和蛋白质以共价键相互作用、v a l l d e r w a a l s 相互作用、疏水亲 水相互作用而形成的二维流动体系，膜厚约5 8 n m 。在膜中，脂类分子呈双分子 层排列，而蛋白质分子则以各种形式结合在脂类双分子层表面或镶嵌在其中。人 们对生物膜的认识经历了一个很长的过程。从蛋白质磷脂蛋白质形成的“三明治” 式结构模型到“流体镶嵌模型”，以及后来对流体镶嵌模型作了重要的补充提出了 “板块镶嵌模型”。1 9 9 7 年，s i l i l 衄s i l 】提出了细胞膜中的“筏”状结构模型。脂筏就是 细胞膜上一种有序的稳定结构，它的提出对细胞膜模型作了进一步完善。对生物 膜的研究有效途径是通过离体研究，目的是弄清楚生物膜各个组份的功能，并最 终揭示整个生物膜行使生理功能的机制的有效途径。主要的方法有：1 脂单分子层 技术；2 固态表面支撑膜技术；3 平面脂双层技术；4 脂质体技术；5 去垢剂分离 膜成份进行研究。 1 1 脂筏的定义和研究进展 脂筏( 1 i p i dr a f t s ) 是细胞膜上特殊的结构域，它的主要脂质成分是胆固醇、鞘磷脂 和神经节苷脂。文献报道具有不同相变温度的磷脂分子间相互作用可以形成筏状 微区结构。鞘磷脂有着较长的饱和酰基链，而且通过和胆固醇的相互作用，形成了一 种脂质有序相0 i p i d - o r d c r e dp h a s e ) 1 埘，这种结构比周围的细胞膜区域具有更高的有 序性和稳定性，这种特殊的性质使得这种膜结构低温时不溶于非离子去垢剂t r i t o n x 1 0 0 ，从而利用密度梯度离心可以将其分离纯化1 4 j 。脂筏与信号传导事件有很重要 的关系1 5 1 。研究发现有多种类型的信号分子与脂筏相关，如受体分子类、离子通道 和泵相关分子、蛋白激酶、g t p 结合蛋白、配体蛋白、c a 2 + 结合蛋白、黏附分子、 细胞骨架相关蛋白质类、转录因子和脂类等。目前，脂筏的模拟研究主要是通过 含有饱和脂肪酸链的磷脂与胆固醇间相互作用来实现【2 1 。对其研究常用的方法主 要有膜泡融合法、l b 膜方法、原子力显微镜、x 射线衍射、荧光标记技术、差示 量热技术、核磁共振技术等。制备双层膜结构主要是l b 技术，检测结构中最常用 的技术就是原子力显微镜1 1 ”1 1 。下面介绍本论文中使用的主要实验方法。 1 2l b 膜方法简介 1 2 1l b 膜的基本原理 l a n g m u i r - b l o d g c t t ( l b ) 膜是从空气水( 液体) 界面转移到固体衬底上的单 层或多层膜，获得有序分子装配的一种最有效的方法。多层膜可以由一种成份构 成也可以由多种成份构成。l b 膜仪主要由五部分组成，分别为：铺展单分子层 的水槽，槽表面通常用惰性材料涂覆( 如聚氯乙烯) ，便于清洗，不易污染；两 个独立的挡板，它使形成的单分子层为固定在一定面积的屏障内。挡板由马达驱 动，改变表面压和面积；随时监测表面压变化的压力传感器，常用的为膜天平， 用来监测单分子层内表面压的变化引起的表面压力的变化；沉积提拉装置用来 固定载片，速度可调，平稳往复穿过膜水界面：电路反馈系统，将表面压测试、 挡板驱动马达及提拉装置相联系，实现拉膜过程中表面压恒定，此时漂浮的单分 子膜面积自动相应的调整i ”j 。 l a n g m u i r 膜天平是l b 膜仪中最重要的组成部分。利用l a n g m u i r 膜天平最大 的作用是表面膜压的测定。由于气液界面上单分子层的存在，使亚相的表面压力 由丫0 降低为丫，定义表面膜压石为： 玎。y o y 记录膜压随时间的变化过程获得很重要的单层膜动态信息。在等温条件下改 变挡板的位置，记录石的变化，对玎和平均分子面积a 作图，得到单层膜的石- a 曲线，不同分子的石- a 曲线不一样，石a 曲线是描述单分子层的特征曲线【2 1 】。 l a n g m u i r - b l o d g e t t ( l b ) 膜技术是在水界面上将不溶解的成膜材料分子加以紧 密有序的排列，形成单分子膜，然后再转移到固体衬底上的一种精确控制薄膜厚度 和分子排列的单分子膜制备技术。借助l b 膜技术，可以实现分子组装。l b 膜具 有诸多优点：( 1 ) l b 膜有序超薄，能在分子水平上( 纳米级) 控制其结构和物理、 化学性能；( 2 ) 可实现分子排列组合，组建超分子结构和超微复合材料；( 3 ) 可 在常温常压下形成，需要的生成能量少且不破坏高分子结构；( 4 ) 可有效的利用 l b 膜分子自身的组织能力形成新的化合物i 矧。l b 技术是一种可在分子水平上对 生物膜进行模拟和调控的组装方法，利用l b 技术可以通过组装不同生物分子得到 具有分子有序的纳米薄膜，并可以方便地研究不同表面活性剂、磷脂及蛋白质的相 互作用。 1 2 2l b 膜的制各方法 l b 膜的制备：( 1 ) 首先将成膜材料溶解在有机溶剂中，然后用微量进样器逐 滴铺在亚相上铺展开来，使单层分子吸附在液气界面上。( 2 ) 静置1 5 m i n 待有机 溶剂挥发后，通过移动挡板减少每一分子所占的面积( 即水面面积滴入的分子数) 。 在一定表面压力下，所有分子在亚相表面上形成取向排列并密集填充的单分子层。 ( 3 ) 以一定的速度降下基片，将单分子层转移到固定基片上。 制备多层l b 膜的方法有两种，垂直提拉法和水平提拉法。垂直提拉法是垂直 提拉法是将单层膜保持在一定压力下，用事先处理好的固体载片沿着垂直方向缓 2 慢地伸入和提拉出亚相，单层膜就被连续地转移到固体表面上；水平提拉法是将 表面经过疏水处理的载片水平地放在亚相上，使单层膜同时吸附转移到载片上( 图 1 1 ) 。l b 膜在固体载片上的排列方式有三种：x 、y 和z 型如图1 2 。 图1 1 垂直( 左面) 和水平( 右面) 提拉法制备l b 膜示意图 f i g1 1t h ev e r t i c a la n dh o r i z o n t a lm e t h o d so fp r e p a r i n gl bm e m b r a n e 鳓幽燃 x yz 图1 2l b 膜在固体栽片上的三种排列方式 f i g1 2t h et h r e em o d e so fa r r a y i n go fl b o nt h es o l i ds l i c e l 2 i 。3 s 。3 b4 0 l 1 2 jl b 技术的应用 目前l b 膜在生物学上的应用主要集中在以下几个方面： ( 1 ) 脂类之间以及脂类与蛋白质之间的相互作用的研究。 ( 2 ) 与细胞识别有关问题的研究。 ( 3 ) 膜的粘着与融合。 ( 4 ) 二维蛋白的形成及其结构的研究。 ( 5 ) 生物传感器和分子期间的研究。 1 3 原子力显微镜技术简介 。一一一。一一一。一一一。一一一。 勃期剿丛翦 1 3 1 原子力显微镜基本组成部分 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 系统可分成三个部分：力检 测部分、位置检测部分、反馈系统。力检测部分：在原子力显微镜( a f m ) 的 系统中，所要检测的力是原子与原子之间的范德华力。所以在本系统中是使用微 小悬臂( c a n t i l e v e r ) 来检测原子之间力的变化量。这微小悬臂有一定的规格，例 如：长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状，而这些规格的选择是依照样品的特 性，以及操作模式的不同，而选择不同类型的探针。位置检测部分：在原子力 显微镜( a f m ) 的系统中，当针尖与样品之间有了交互作用之后，会使得悬臂 c a n t i l e v e r 摆动，所以当激光照射在c a n t i l e v e r 的末端时，其反射光的位置也会因为 c a n t i l e v e r 摆动而有所改变，这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光 斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号，以供s p m 控制器作信号处理。 反馈系统：在原子力显微镜( a f m ) 的系统中，将信号经由激光检测器取入之 后，在反馈系统中会将此信号当作反馈信号，作为内部的调整信号，并驱使通常 由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动，以保持样品与针尖保持合适的作用力 1 3 l l 。 1 3 2 原子力显微镜基本原理 图1 3 原子力显微镜工作原理示意图 f i 9 1 3t h ep r i n c i p l eo f a f m 原子力显微镜的基本原理是：将一个对微弱力极敏感的微悬臂端固定，另 一端有一微小的针尖，针尖与样品表面轻轻接触，由于针尖尖端原予与样品表面 原子间存在极微弱的排斥力，通过在扫描时控制这种力的恒定，带有针尖的微悬 臂将对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起 伏运动。利用光学检测法或隧道电流检测法，可测得微悬臂对应于扫描各点的位 置变化，从而可以获得样品表面形貌的信息。 4 1 j 0 原子力显微镜成像模式及图像分析 a f m 检测样品表面微观形貌时，采用三种不同的扫描成像模式： 接触扫描成像模式( c o n t a c tm o d e ) 。采用接触扫描成像模式时，探针尖始终 与样品表面接触并在表面上滑动。针尖和样品间的相互作用力，是接触原子的外 层电子相互排斥的库仑力，库仑力大小为1 0 1 1 1 0 一n 。优点：可以稳定的获得高 分辨的样品表面微观形貌图像，有可能达到原子级的测量分辨率。缺点：对较软 的样品在针尖力的作用下会发生变形或划伤；在空气中测量时毛细现象引起额外 的黏附力，造成成像的畸变；针尖和样品接触并滑行，容易损坏探针尖。 非接触扫描成像模式( n o n - c o n t a c t m o d e ) 。测量力以范德华力为主的吸引力， 针尖和样品间距离大致为5 2 0 n m 。优点：不容易损伤样品。缺点：分辨率不高。 轻敲扫描成像模式( t a p p i n gm o d e ) 。扫描时微悬臂是振荡的，所以对样品 和针尖的损伤都较小。也可以获得较高的分辨率。 a f m 检测图像分析： 在a f i v l 采用接触测量时，实测高度将小于样品表面真实的起伏。 在恒力测量模式时，测出的样品廓形高低幅度大于真实的高低幅度，即有 放大作用。 在a f m 测量时，针尖的预置力越大，纵向测量结果的放大作用也越大。 针尖大小影响成像的分辨率，通常探针尖的大小为2 0 n m 、1 0 n m 和5 n m 。 1 3 4 原子力显微镜在生物学中的应用 原子力显微镜( a f m ) 本身的优势是其在生物学中得以迅速发展的主要原因。首 先，原子力显微镜( a f m ) 技术的样品制备简单，无需对样品进行特殊处理，因此， 其破坏性较其它生物学常用技术( 如电子显微镜) 要小得多；第二，原子力显微镜 ( a f m ) 能在多种环境( 包括空气、液体和真空) 中运作，生物分子可在生理条件下直 接成像，也可对活细胞进行实时动态观察；第三，原子力显微镜( a f m ) 能提供生物 分子和生物表面的分子亚分子分辨率的三维图像；第四，原子力显微镜( a f m ) 能 以纳米尺度的分辨率观察局部的电荷密度和物理特性，测量分子间( 如受体和配体) 的相互作用力；第五，原子力显微镜( a f m ) 能对单个生物分子进行操纵；另外，由 原子力显微镜( 朋m f ) 获得的信息还能与其它的分析技术和显微镜技术互补1 3 冽。 1 4 本论文选题依据及主要研究内容 1 4 1 本论文选题依据 生物膜中脂筏问题的研究成为了当前化学和生物学中最活跃的领域之一。脂 筏( 1 i p i dr a f 0 由美国的s i m o n s l 9 9 7 年提出的，一般大小为5 5 3 0 0 r i m ，是生物膜不被 5 去垢剂所溶解的部分，又称d e t e r g e n t i n s o l u b l eg l y c o l i p i d d c h e dd o m a i n s ( d i g s ) ，或 称d e t e r g e n t r e s i s t a n tf r a c t i o n s ( d r f ) 。研究结果表明，脂筏就像一个蛋白质停泊的 平台，与膜的信号转导、蛋白质分选、离子通道的调节、膜的粘连、细胞的生长、 分化、衰老、凋亡以及应急反应都有密切的关系，还与肿瘤、糖尿病、神经退行 性疾病( 如老年痴呆症，帕金森氏症，阿尔兹罕默氏病等) 的发生有关联p 列。因 此，如果能了解质膜微囊和脂筏的形成机制以及结构和功能，不仅对于阐明生物 膜微区结构的形成机制具有重要的意义，而且对于理解信号传导途径等生物过程 并进一步指导临床实践均有重要的意义。 针对脂筏成份的拆离和组装的研究起步较晚，在脂筏的拆离方面有人使用蔗 糖密度梯度离心方法分离动物红细胞膜中的脂筏成分都取得了一定的进展；但直 到近几年在组装方面人们才开始利用不同比例成份的配比来模拟研究脂筏成份中 脂类与蛋白质蛋白质和蛋白质间的相互作用，从形态方面实现脂筏的组装。 脂筏独特的成分在低温下不溶于许多常见的去垢剂，如t r i t o n x 1 0 0 等。这种 性质使得通过密度梯度离心获得脂筏成为可能，但是细胞膜上不同种类的筏对不 同的去垢剂的敏感性也不同。系统的探索不同的去垢剂对膜上不同成份的作用十 分常有必要的。另外，脂筏的分析是通过拆离低温下去垢剂密度梯度离心的溶解 产物而得。这些在低温条件下用去垢剂抽提出来的物质是否是筏上物质的本身性 质，同时脂筏中的许多成份是否会因为去垢剂的抽提而丧失，去垢剂的出现是否 出现有效成份间的粘连和脂成份的相变等都有待于迸一步的研究。 人工组装脂筏研究是理解脂筏形成的基本物理性质的主要途径之一，是通过 确定的脂筏成分的混合比例来实现组装，但是不同种类的细胞的筏的成分的比例 会不同，这样就具有一定的盲目性；并且在人工脂筏构筑研究中，鞘磷脂、鞘糖 脂、蛋白质、胆固醇等有效成份间的分子作用机制仍不很清楚，所以，系统的研 究各种分子与其他分子间的作用及分子结构的形成是很重要的。在此方面，如果 能系统的从细胞膜的脂筏成份的拆离出发，分析生理条件下各组分的配比进行模 拟组装就显得至关重要。目前，有关于此方法组装的文献报道尚不多见。 基于目前的研究进展，相信该课题研究能够在脂筏的拆离和结构重建的机理 和实验方法中取得一定的进展，为生物膜脂筏的组装提供系统的技术和方法。 1 4 2 本论文主要研究内容 对脂筏拆离研究主要是通过运用蔗糖密度梯度离心来分离。围绕该问题，试 验选用红细胞为材料，使用合适的去垢剂，找到拆离有效成份的最佳浓度和温度 等条件。 6 模拟脂筏的构筑主要是通过不同比例的脂类( 磷脂、糖鞘脂) 、胆固醇和蛋白 等进行配比通过l b 技术制备单分子层从而实现组装。我们设计了系统的实验方案 来进行模拟组装。第一种途径就是对提取出来的脂筏成份进行进一步纯化后，利 用l b 技术方法进行模拟组装，进行动态分析研究其生理作用。只有这样才能更接 近生物膜本身的组份比例，更接近真实情况。第二种途径是利用商品生化试剂进 行各种成份配比，研究组份之间的相互作用，研究其动态属性并与提取的脂筏成 份组装进行对比。 7 第二章脂筏结构模拟组装双层脂膜的研究 磷脂分子广泛存在于生物体中，是生物膜的重要组成成分，在生物体中起着代 谢和结构形成的作用。液晶态磷脂脂质体和l b 膜经常作为研究生物膜的简单模型 系统【2 3 珊j 。其结构与特性一直是研究热点。磷脂分子形成的脂质体、单层和多层 l b 膜被广泛用作生物膜的模型研究【批3 0 1 。研究表明酸性磷脂分子在质子泵膜中分 布较多，起着捕获和传导质子的作用，研究者认为在磷脂脂双层结构中，酸性分 子极性头基团形成的分子间氢键作用在质子沿生物膜侧向传导中起着重要的作 用。 磷脂分子具有双亲分子结构：两个脂肪酸尾链为疏水基团，磷酸和胆碱头部 基团为亲水基。磷脂酰胆碱就是磷脂中的一种，它在脑、神经组织、肝、肾上腺 和红细胞中含量较高。由于磷脂酰胆碱在生物膜中具有重要的作用，可选磷脂酰 胆碱作为成膜材料，通过仿制生物膜结构，研究生物膜在生物现象中的能量转换 和物质传输过程中的各种功能。 原子力显微镜( a f m ) 与隧道扫描显微镜共同被誉为是继光学显微镜、电子 显微镜发展之后的第三代显微镜。二者的结合可以用于原子尺度分辨率的微观形 貌观察，并进行数据的处理及传递工作。原子力显微镜通过检测探针和样品之间 的微小作用力，可以观测从原子及到几百纳米级的结构特征，可以对细胞及生物 大分子的形态结构进行观测。原子力显微镜( a f m ) 具有分辨率高( 可达l n m ) 、 直观、更接近生理条件等优点。原子力显微镜( f m ) 对研究生物膜是一个非常 新颖且十分有效的方法。实验证明，用原子力显微镜对l b 膜的结构观测是比较理 想的工具，它对其结构不产生破坏。它不仅可在纳米范围得到生物样品表面形状 的图像，而且可以在分子水平上对作用力进行测量p b 3 4 1 。 使用模型系统对理解微区的形成和结构的特性是很重要的工具，要想获得理 想的模拟效果，系统的研究单层膜的稳定因素是很必要的。脂筏的模拟研究近几 年来一直是研究的热点，其主要通过膜泡融合法和l b 膜法加以模拟研究，这样 l b 膜的稳定性的研究显得就尤为重要，我们的目的是确定一个