酶法分析PPT课件.ppt

Cha-4酶法分析,羧肽酶,1,.,4.1酶法分析的原理,酶法分析:利用酶作为分析工具或分析试剂,测定样品中用一般化学方法难以检测的物质（这些物质可以是酶的底物，也可以是酶的抑制剂或活化剂以及酶的辅酶因子）的方法称为酶法分析。根据测定原理，主要有终点法、反应速率法、循环放大法等。,2,4.1.1酶的一般性质,酶是生物催化剂。绝大部分酶是蛋白质，还有一些核糖核酸RNA具有催化作用，称为核酶（ribozyme）。,细胞的代谢由成千上万的化学反应组成，几乎所有的反应都是由酶（enzyme）催化的。酶对于动物机体的生理活动有重要意义，不可或缺。酶在生产实践中有广泛应用。,3,高效性酶的催化作用可使反应速度比非催化反应提高108-1020倍。比其他催化反应高106-1013倍例如：过氧化氢分解2H2O22H2O+O2Fe3+催化，效率为6104mol/mol.S过氧化氢酶催化，效率为6106mol/mol.S专一性即对底物的选择性或特异性。一种酶只催化一种或一类底物转变成相应的产物。,酶的特点,4,酶容易变性这是酶的化学本质（蛋白质）所决定的。酶的可调节性抑制和激活（activationandinhibition）反馈控制(feedback)酶原激活(activationofproenzyme)变构酶(allostericenzyme)化学修饰(chemicalmodification)多酶复合体(multienzymecomplex),5,已知的上千种酶绝大部分是蛋白质单纯酶：少数，例如：溶菌酶结合酶：大多数结合酶=酶蛋白+辅因子辅因子包括:辅酶、辅基和金属离子。,酶的组成与维生素,酶的化学本质,6,4.1.2酶法测定的原则,1、酶活性酶活性(enzymeactivity)指酶的催化能力，用反应速度来衡量，即单位时间里产物的增加或底物的减少。V=dP/dt=-dS/dt测定方法：吸光度测定、气体分析、电化学分析等。2、代谢物浓度3、酶底物复合物,7,4.1.3酶反应动力学,米氏双曲线,8,米氏方程的推导首先假设：1.反应在最适条件下进行2.pH、温度和酶的浓度是固定的,变化的是底物浓度3.反应在起始阶段，逆反应可忽略4.反应体系处在稳态（stablestate）,9,E+SESE+P,k+1,k-1,k+2,根据中间产物学说，在稳态时，ES的生成速度与其分解速度相等。有以下关系式：V1=V-1+V+2(1)k+1ES=k-1ES+k+2ES=ES（k-1+k+2）ES=ES（k-1+k+2）/k+1(2)令（k-1+k+2）/k+1=Km(米氏常数)ES=ESKm(3),10,Et是自由酶E的浓度与结合酶ES的浓度之和，即Et=ES+E(4)总的反应速度V应该等于V+2=k+2ES(5)将(4),(5)代入(3),整理得到米氏方程:V=VmS/(Km+S)V速度Vm最大速度S底物浓度Km米氏常数,11,米氏常数是反应最大速度一半时所对应的底物浓度当Sm时，vm，呈零级反应,米氏双曲线,12,某些酶的Km值,酶底物Km(mmol/L),乳酸脱氢酶丙酮酸0.017己糖激酶D-葡萄糖0.05D-果糖1.5-半乳糖苷酶D-乳糖4.0碳酸酐酶H2CO39.0过氧化氢酶H2O225蔗糖酶蔗糖28糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸108,13,由米氏方程可知，米氏常数是反应最大速度一半时所对应的底物浓度,即当v=1/2Vm时，Km=S米氏常数Km=(k-1+k+2)/k+1在反应的起始阶段，k+2k-1，mk-1k+1平解离此时，m越大，说明和之间的亲和力越小，复合物越不稳定。当m越小时，说明和的亲和力越大，复合物越稳定，也越有利于反应。米氏常数m对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个米氏常数。,米氏常数及其意义,14,米氏常数的求法,双倒数作图法,双倒数方程和双倒数曲线,15,4.1.4酶法分析注意点酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须一定被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。测定应注意的问题。（1）被测物是酶的底物：当底物浓度Skm时，酶反应相对底物而言具有一级反应性态，即酶反应速度与底物浓度成正比，ukS，因此测定酶反应速度可以得知其浓度。,16,（2）被测物是辅酶：需要NAD（P）、coA之类辅酶的反应可看作是双底物反应，这些辅酶可看作是底物之一。当另一类底物浓度足够高时，反应变为单底物反应；那么反应速度将与其成正比。以CoA的测定为例，它是-酮戊二酸脱氢酶的辅酶：此反应可通过340nm吸收度的变化来测定，当另外二种底物处于足够高的浓度时，反应速度与CoA的浓度成正比。（3）被测物为活化剂：当其他条件最适且一定时，活化剂在低浓度范围内，酶反应速度随活化剂浓度增大而升高，并在一定范围内具有线性比例关系。但是用动力学方法测定时有两个问题应注意：活化剂浓度超过一定水平后常导致抑制；对于某一种酶，相似的离子往往也能表现出活化作用，因此测定不专一，易受到干扰。,17,（4）被测物是抑制剂：不可逆抑制剂对酶反应产生的抑制程度，随抑制剂浓度呈线性增加，而且酶反应的最终抑制程度由抑制剂的绝对量决定。可逆抑制剂在底物浓度一定时，在低的抑制剂浓度范围内，酶反应速度随抑制剂浓度升高呈线性降低。例如，胆碱酯酶能用于检测10l0g水平的有机磷化合物。这种测定应注意的是：某些抑制剂能抑制多种酶；而有些酶能被几种相似的抑制剂所控制，因而如果“工具酶”选择不当，就易受到干扰。,18,对酶分析法来说，在建立了适宜的反应和测定系统后，还必须制备一条酶反应速度相对于相应的被测物浓度的标准曲线，以便对未知样品的量进行检测。值得强调的是，在测定未知样品时，所采用的反应、测定系统和制备标准曲线时所用的系统应完全相同，而且待测样品的浓度还应控制在这一曲线范围以内。,19,4.1.5酶法分析的发展的历史,过氧化氢：过氧化物酶。140年以前，麦芽提取物为酶源，以愈创木酚为共底物或指示剂测定。蔗糖：转化酶。100余年以前，酶母提取液为酶源。尿素：尿酶。1914年。临床实验：转氨酶。1958年，诊断肝病和心脏病。20世纪50年代以前，近60种物质能借助于酶法分析。进展：取决于能否以合理的价格提供纯酶、底物和辅助因子。,20,4.2终点测定法,紫外-可见分光光度法UV-VIS（略）,21,4.2.1终点法的重要条件又称为平衡法或终点法。根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用反应后，借助物理化学方法测出其总变化量，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。终点法要获得好的测定结果，重要条件是：被测底物的浓度应很小，并控制反应于1级反应水平。因为这样可以使反应速度达到平衡点；防止过多的产物生成，避免逆反应。其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。酶比较昂贵，因此有一个适宜的用量问题。一般而言，工具酶用量可控制在12km单位（UmL）左右。而终点法的测定时间多控制在210min。,22,注意点：底物特异性（绝对专一性、相对专一性）反应的平衡(酶反应的方向;提高第二底物浓度;pH;除去反应产物；用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原用辅酶）,S+NAD+H2OP+NADH+H+乳酸乳酸脱氢酶丙酮酸,S脱氢酶,23,反应液（酶量，第一反应1km1,指示酶12个km指）反应产物的抑制（反应物除去；再生系统偶联),S+ATPP+ADP丙酮酸丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸,S激酶,24,4.2.2终点法种类,1、一般酶反应定量法（1）底物减少量的测定底物能接近完全转化，且具有特征性质根据此原理可以定量的物质有胞嘧啶（使用胞嘧啶脱氢酶反应，测定280nm吸光度的减少）、腺嘌呤（原理同前）以及尿酸等。例1：尿酸的定量测定尿酸+2H2O+02CO2+H2O2+尿囊素尿酸在293或297纳米有特征吸收峰,尿酸酶,25,试验室尿酸定量测定的方法:0.1M硼酸缓冲液(pH9.5)，0.3%甘油，45mM/L猪肝尿酸酶，待测样品（尿酸浓度在25mol/L以下）共四种组成反应液，在室温下放置15分钟，然后再293nm在测定吸光度A；空白对照吸光度为A0。求得差值A1=A0-A另在同一波长下检测与反应液有相同浓度的尿酸酶的吸光度A2。则A3=A1A2代表系统由尿酸消失而引起的吸光度的减少。,26,临床血尿酸（UA）的测定,血液尿酸增高常见于肾脏疾病、痛风、白血病与肿瘤及其他疾病如慢性铅中毒引起的肾损害、长期禁食等酶比色法尿酸酶催化UA氧化生成尿囊素和H2O2，过氧化氢在过氧化物酶的存在下与苯酚、4-氨基安替比林氧化缩和成红色醌式染料，此染料在500nm处有最大吸收峰，其吸光度值与UA含量成正比。,27,例2胰蛋白酶效价测定本品系自牛、羊、猪的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键，酰胺键及酯键。其水解速率为酯键酰胺键肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。可选用酪蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物。目前均采用专属性较高的N-苯甲酰酰L精氨酸乙酯（BAEE）作为本品的底物。,28,样品溶液的制备精密称取本品适量，用0.001mol/L盐酸液溶解并制成每1m1中含5060胰蛋白酶单位的溶液。底物溶液的制备取N-苯甲酰-L精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg，加水溶解使成100ml，作为底物原液。精密量取10ml，用磷酸盐缓冲液（取0.067mmol/L磷酸二氢钾溶液13ml与0.067molL磷酸氢二钠溶液87ml混合，pH7.6）稀释成100ml，恒温于25.00.5，在253nm波长处，以水做空白，测定吸收度，必要时可用磷酸盐缓冲液（pH7.6）或上述底物原液调节，使吸收度在0.5750.585之间，作为底物溶液。底物溶液应在制成2h内使用。,29,检测方法取底物溶液3.0ml与0.001molL盐酸液0.2ml，混匀，作为空白。另取供试品溶液0.2ml与底物溶液（预热至250.5）3.0m1，立即计时并摇匀，比色池内的温度应保持在25士0.5，在253nm波长处，每隔30s读取吸收度，共5min。吸收度为纵坐标，时间为横坐标，作图；每30s吸收度的改变应恒定在0.0150.018之间，呈线性关系的时间不得少于3min。若不符合上述要求，应调整供试品溶液的浓度，重新测定。在上述吸收度对时间的关系图中，取呈直线部分上的吸收度。,30,影响本试验效价测定的因素（1）酶浓度：在固定底物浓度、反应温度、pH等条件下，调整反应液的酶浓度是效价测定的关键，酶浓度过高或过低都不能使反应速率保持恒定，最佳的测定浓度为5060IUml。（2）温度：温度变化对酶促反应速率较敏感，温度每升高1，活力单位约增高5，反之，则下降。为准确控制反应温度，除调节水浴温度或室温外，由于在测定时受仪器散热和光照等影响，故必须随时测量比色池内反应物的温度，以保证测定结果的准确性。（3）底物：因BAEE酶键易水解，其水溶液不稳定，故该底物溶液应在配制后3h内使用BAEE底物测定本品酶活力，操作简便，准确度高，RSD一般可控制在5以下。,31,（2）产物增加量的测定底物基本上都转变为产物，而且产物又具有专一地进行定量测定的性质。借助相应的专一脱羧酶，再用瓦式呼吸计测定生成的CO2，如各种氨基酸草酸等在某种酶的作用下，形成的产物具有特征的吸收谱带，如黄嘌呤和次黄嘌呤等。,32,例1：草酸的定量测定草酸芥子苷（227.5nm无吸光度）烯丙基异硫氰酸（227.5nm下具有最高吸光度）,草酸脱羧酶,芥子苷酶,甲酸+CO2,33,例2胃蛋白酶的活力测定自猪、羊或牛的胃粘膜中提取的胃蛋白酶，具有催化蛋白质水解的能力。在实验条件下，胃蛋白酶催化血红蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用水解产物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酶氨酸和色氨酸有紫外吸收，用紫外分光光度法直接测定，并计算出本品的酶活力。每1g检品中含蛋白酶活力不得少于3800单位。对照品溶液的制备精确称取经105干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液（取1molL盐酸溶液65时，加水至1000ml）制成每1ml中含05mg的溶液。供试品溶液的制备取本品适量，精密称定，用上述盐酸溶液制成每1ml中约含0.20.4单位的溶液。,34,测定法取试管6支，其中3支各精确加入对照品溶液1时，另3支加入供试品溶液1ml，置37土0.5水浴中，保温5min，加入预热至370.5的血红蛋白试液5ml，摇匀，并精确计时，在37土0.5水浴中反应10min。立即加入5三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置370.5水浴中保温10min，再加入5三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取续滤液，（测定时，滤液须澄清，否则将影响结果的准确度及精密度。）,35,分别作为供试品和对照品的空白对照，照分光光度法，在275nm的波长处测定吸收度，算出平均值As和A。在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1mol酶氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。本法是通过酶促反应动力学和正交试验研究，确定酶和作用物的浓度、反应时间、温度和pH等最佳反应条件而建立的，具有灵敏度高、操作简便等优点。,36,例3肌酐(CREA)的测定,肌肝+H2O肌酸肌酸+H2O（肌酐酶）肌氨酸+尿素肌氨酸+H2O+O2氨基乙酸+H2O2+甲醛H2O2+苯酚+4-氨基安替比林醌亚胺（红色）4H2O醌亚胺在500nm处有最大吸收峰，其吸光度值与CREA含量成正比。,37,其他酶比色法举例,1.血清胆固醇测定用于评估动脉硬化的风险以及对脂类/脂蛋白的代谢紊乱进行诊断和监测治疗。增高见于糖尿病昏迷患者，原发性高胆固醇血症、动脉粥样硬化、肾病综合征等。降低见于恶性贫血、溶血性贫血、甲状腺功能亢进、感染、营养不良、肝硬化、急性肝坏死等。胆固醇酯在胆固醇酯酶的作用下分解生成胆固醇，胆固醇在胆固醇氧化酶及过氧化物酶作用下最终生成醌亚胺，醌亚胺的颜色深浅与胆固醇的浓度成正比。,38,2.甘油三脂TG,甘油三酯的升高与冠心病的发生也有很大关系。增高：脂肪肝、阻塞性黄疸、动脉粥样硬化、高脂血症等；降低：严重肝衰、甲状腺功能减退等磷酸甘油氧化酶法甘油三脂在脂肪酶、甘油激酶等酶的作用下，生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物。其显色程度与TG成正比。（波长500nm）,39,3、游离脂肪酸FFA,游离脂肪酸在乙酰辅酶A合成酶(ACS)和乙酰辅酶A氧化酶(ACO)的作用下，生成过氧化氢（H2O2）。生成的过氧化氢（H2O2）在过氧化酶和显色剂的作用下产生美兰，美兰在一定光波长具有吸收峰，吸光度的大小与游离脂肪酸的浓度成正相关。,40,（3）当底物或反应产物都没有易于鉴定的吸收带时,引入辅助酶和指示剂构成的酶系,怎么办？,41,被测底物,指示剂酶的底物(Pn),NAD+260nm,NADH340nm,PnH2,引发酶,辅助酶,42,技术关键,批示剂酶的量远超过辅助酶的量。使用过量的反应物:NAD(P)或NAD(P)H，是被测组分浓度的5-10倍，甚至100倍（乳酸脱氢酶测定乳酸）。改变pH：丙酮酸pH7.6，乳酸pH9.5采用一种捕集剂：与非指示剂产物作用，如乳酸测定中加入肼捕集丙酮酸（产物）改变反应物：加入共底物，改变平衡常数，利于有副反应伴随的反应过程的测定。,43,例：L-谷氨酸的定量测定（NADH生成量的测定）,L-谷氨酸+NAD+H2O,-酮戊二酸+NADH+NH4+,谷氨酸脱氢酶,此反应平衡偏向左方，可添加肼捕捉酮酸，并加过量的NAD+，反应在碱性条件pH9下进行，谷氨酸浓度在60mol/L以下时,反应基本定量的向右进行.方法：将含有0.3甘氨酸-肼缓冲液（用硫酸调至pH9）、1.0mmol/LADP、1.6m-NAD、样品（含谷氨酸在60mol/L以下）以及155g(4.5U)/ml以上的谷氨酸脱氢酶的反应液（3.35ml)置于光学检测系统中，在340nm处测定添加NAD后60分钟的吸光度（A1）；另外以不加酶的相同溶液系统作为空白，同样在NAD添加后60分钟（和反应液测定时间要刚好相同）测定340nm的吸光度（A2），,44,NAD和肼能够形成在紫外区有吸收的络合物，所以空白值相当高，这种络合物的形成在开始时很快，以后逐渐减慢，所以如果时间不一致，就会产生误差。A=A1-A2与NADH的生成量相对应，故根据NADH的吸光度可以算出NADH的实际生成量，进而求得谷氨酸量。,45,2、和指示酶反应偶联测定法,这种定量方法常用于以下二种情况：一是反应产物和底物在用物理化学手段无法区别时，往往可借助酶来加以识别，在这种情况下，如该酶可用做指示酶反应，则就有可能能过和它耦联进行定量分析。二是测定反应所用酶的专一性不高，而样品中又夹杂着能作为它们的底物的其化物质，这时往往只用一种酶进行定量是困难的，可以再耦联一个酶，通过耦联酶的专一性加以区别定量。,46,根据耦联的指示酶反应所用酶的不同分为以下二大类：（1）以脱氢酶为指示亮剂用为作为耦联指示剂的酶中应用得最广泛的是以NAD或NADP为辅酶的脱氢酶。例1：1磷酸葡萄糖（G1P）的定量测定将磷酸葡萄糖变位酶反应与G6P脱氢酶反应耦联，因NADPH的生成量同G1P的减少量成正比例，因此可以通过340nm吸收度的测定量G1P。,47,方法：将含有88mmol/L三乙醇胺缓冲液（pH7.6）、1.7mmol/LEDTA、4.4mmol/LMg2+、0.5mmol/LNADP、样品和G-6-P脱氢酶混合液放置反应5分钟，测定吸光度A1，然后加入变位酶约4分钟后测定吸光度A2，根据A2-A1可计算G-1-P的量。,G-1-P,G-6-P,磷酸葡萄糖变位酶,1，6-二磷酸-葡萄糖,G-6-P,6-磷酸葡萄糖醛酸+NADPH+H+,6-磷酸-葡萄糖脱氢酶,1，6-二磷酸-葡萄糖,48,对于此共存的混合液来说，用乳酸脱氢酶作用时，反应定量地向右进行，根据340nm吸收度的减少便可算出丙酮酸量；如再加丙酮酸激酶，使丙酮酸激酶反应与乳酸脱氢酶反应成偶联反应，则NADH的减少和磷酸烯醇式丙酮酸量成正比；进一步加烯醇化酶，使烯醇化酶反应和丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶偶联，则NADH的减少与D-2PGA的量成正比。（反应在一个比色杯中进行）,D-2PGA（D-2-磷酸甘油酸）,例2：丙酮酸、磷酸烯酸丙酮酸和D-2-磷酸甘油酸的定量测定,PEP（磷酸烯醇丙酮酸）,PEP+ADP,丙酮酸+ATP,丙酮酸+NADH+H+,乳酸+NAD+,烯醇化酶,丙酮酸激酶,乳酸脱氢酶（LDH）,49,（2）脱氢酶以外的酶脱氢酶类作指示酶使用最广泛，其他还有少量，例如参与色素氧化还原的酶。例如p-79的D-葡萄糖和L-谷氨酸的定量测定,50,4.3反应速度法,优点：测定速度较高（1-5min)；成本较低，酶用量较少；不致于因酶制剂不纯而产生严重的误差；不需要考虑反应是否进行完全；易于安排自动测定。方法：斜率法；固定浓度或变化时间法；固定时间法,51,4.3.1几种反应速率法,斜率法测定反应物（被测组分）、产物或指示剂的浓度随时间变化的曲线，曲线的起始斜率由外推至时间为零而得。酶浓度固定时，测得的斜率与反应物的浓度有关。测定参数：吸光度、荧光度、pH例如:2,3-二磷酸甘油酸的定量测定肝素的定量测定,52,尿素(UREA)的测定,临床实验室常采用脲酶速率法脲酶催化尿素水解产生NH3和CO2。在谷氨酸脱氢酶催化下，NH3与-酮戊二酸和NADH反应生成NAD+。NADH在340nm处有特异性吸收峰，通过测定NADH下降速率与同样处理的标准比较，得出尿素含量。,53,其他方法固定浓度（变化时间）法,记录使反应物（被测组分）或产物达到额定浓度所需时间。测定指标：所有能显示出反应物浓度的任何理化特征，如吸光度、荧光度、pH时间与反应物浓度成反比。,54,变化时间法自动化测定：反应由注入酶而开始。30s后自动计时。当吸光度或荧光度达到额定值时，计时器自动关闭。被测组分实际浓度与所需时间成反比。,固定时间法反应进行一额定的时间间隔后，依据理化特性的变化测定其中某一反应物或产物的浓度变化。,55,4.3.2连续检测法,医药学上主要血清酶学检查，如各种肝脏和肠道酶的异常改变。例1谷氨酸氨基转移酶（谷丙转氨酶，ALT）ALT催化L-丙氨酸的氨基转移，生成丙酮酸。丙酮酸与NADH在LDH的催化下反应生成乳酸和NAD+。NADH在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中ALT的活性成正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出ALT活性。,56,例2天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶，AST）,AST催化L-天冬氨酸的氨基转移与MDH催化的反应偶联，使NADH氧化生成NAD+。NADH在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中AST的活性成正比，在340nm处测定NADH下降速率，即可测出AST活性。,57,例3碱性磷酸酶（ALP）的测定（胆道梗阻的酶）连续监测法无色的对-硝基苯磷酸二钠在ALP作用下，生成在405nm处有特异吸收峰的淡黄色对-硝基苯酚，通过测定在405nm处吸光度的变化速率计算ALP活性。,58,4-谷氨酰转肽酶（GGT）的检测,原理：GGT分布在胆管或胆道系统连续监测法r-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺和双甘肽在-GT作用下，生成对硝基苯胺及r-谷氨酰双甘肽，所释放出的对硝基苯胺与-GT活性成正比，通过在405nm处测定对硝基苯胺的变化，可求出-GT活力。,59,4.4酶循环放大法,是一种超微分析法，利用底物的专一性，使微量的底物“增幅放大”以达到定量目的。4.4.1循环放大原理基本步骤转换反应：以试样中的待测组分为底物，经特异反应生成与待测组分相应的定量循环底物。循环反应：生成的循环底物反复参加两个酶反应组成的偶联反应，所得产物量为循环底物的若干倍。指示反应：采用酶法测定反应产物。由反应产物量及循环次数，计算出循环底物量，再推算试样中待测组分的量。,60,以超微量前列腺素（PG）的定量分析加以说明。1.转换反应试样中的PG在过量NAD存在下，经前列腺素脱氢酶（PGDH）催化进行转换反应。生成与PG相当的NADH。,PG+NAD+,15-脱羧-PG+NADH+H+,PGDH,2.循环反应用一定方法除去剩余的NAD后进行循环反应，在过理的3磷酸甘油醛酮二酸和铵盐存在下，经磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和谷氨酸脱氢酶（GDH）催化。NADH被氧化成NAD，并生成与NADH量相当的谷氨酸。随后，NAD又被还原成NADH，并产生与NADH量相当的3磷酸甘油酸。如果反复进行n次，则蓄积的谷氨酸及3磷酸甘油酸的量即n倍于NADH。,61,3.指示反应蓄积的谷氨酸在过量NAD存在下，经谷氨酸脱氢酶能进行指示反应。利用终点法测得谷氨酸的量。由谷氨酸的量及循环次数n则可求出待测物PG的量。在循环反应中各成员的浓度应符合一定的要求。底物Sa和Sb的浓度比相应酶Ea和Eb的米氏常数值为大。循环底物A和B的浓度（与待测组分浓度相当/应比相应酶Ea和Eb的米氏常数值要小。,谷氨酸+NAD+,-酮戊二酸+NADH+H+,GDH,62,反应,4.4.2循环反应是关键高灵敏，较强特异性。NAD循环，NADP循环，CoQ循环等,63,4.4.3举例,葡萄糖+ATP,6-磷酸-葡萄糖+ADP,HK（己糖激酶）,6-磷酸-葡萄糖+NADP+,6-磷酸-葡萄糖醛酸+NADPH+H+,G6PDH,64,胆汁酸测定,酶循环法胆汁酸被3-羟基类固醇脱氢酶及Thio-NAD特异性地氧化，生成3-酮类固醇及Thio-NADH，3-酮类固醇在3-羟基类固醇脱氢酶及NADH存在下，生成胆汁酸和NAD，循环往复从而放大微量的胆汁酸量，测定生成的Thio-NADH的吸光度与标准比较，得出胆汁酸含量。,65,临床意义,血清总胆汁酸升高肝损害：肝炎、肝硬化、肝癌胆道阻塞：胆管梗阻门脉分流,66,4.5生物传感器与酶传感器,4.5.1生物传感器生物传感器(Biosensor)是指用固定化的生物体成分或生物体本身作为敏感元件的传感器，是一种将生物化学反应能转换成电信号的分析测试装置。,67,生物传感器的模型,是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术。应用领域：环境监测、食品分析、生物医学,68,一、概述,1.定义敏感材料由生物体成分（或本身）组成的传感器利用生物活性物质具有的分子识别功能，专一、灵敏。,69,敏感元件：,酶、抗体、核酸、细胞等。,转换器：,电化学电极、光学检测元件、场效应晶体管、压电石英晶体、表面等离子共振。,酶(Enzyme),抗体(Antibody),DNA,70,2.分类根据输出信号产生的方式生物亲和型、代谢型、催化型根据生物分子识别元件上的敏感物质酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器、基因传感器等根据信号转化器电化学生物传感器、半导体生物传感器等其他分类被测对象、大小、功能,71,72,3.生物传感器的特点,高选择性。生物传感器是由选择性好的主体材料构成的分子一识别元件，因此，一般不需进行样品的预处理。测定时一般不需另加其它试剂。,体积小、可以实现连续在位监测。,响应快、样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。,传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪器，因而便于推广普及。,73,74,4.5.2电化学生物传感器的分类（根据敏感物质分类）,酶传感器免疫传感器组织传感器、细胞传感器等,75,（一）酶传感器酶电极电化学电极顶端紧贴一层酶膜,朱建中,周衍.传感器世界.1997,4:18,76,1、酶的固定化技术,惰性载体物理吸附法离子载体交换法活化载体共价结合法物理包埋法,77,78,物理吸附法酶分子通过极性键、氢键、疏水力或电子相互作用等吸附于不溶性载体上。常用的载体有：多孔玻璃、活性炭、氧化铝、石英砂、纤维素酯、葡聚糖、琼脂精、聚氯乙烯、聚苯乙烯已用此法固定化的酶如：脂肪酶、D葡萄糖苷酶、过氧化物酶等,交换法选用具有离子交换剂的载体，在适宜的pH下，使酶分子与离子交换剂通过离子键结合起来，形成固定化酶。常用的带有离子交换剂的载体如下：DEAE一纤维素、TEAE一纤维素、AE纤维素、CM纤维素、DEAE一葡萄糖、肌酸激酶,79,共价结合法a.重氮b.迭氮c.卤化氰d.缩合e.烷基化法,物理包埋法将酶分子包埋在凝胶的细微格子里制成固定化。常用的凝胶有：聚丙烯酸胺、淀粉、明胶、聚乙烯醇、海藻酸钙、硅树脂用凝胶包埋法制备的固定化酶如：木瓜蛋白酶、纤维素酶、乳酸脱氢酶,80,2.酶电极及酶传感器实例,81,生物分子识别元件：葡萄糖氧化酶膜可用的测量量：O2的减少量，葡萄糖酸或H2O2的产生量信号转换元件：氧电极，pH电极及H2O2电极,（1）葡萄糖氧化酶电极,82,一种葡萄糖传感器-Glucowatch,GlucosepulledthroughtheskinbychargedmoleculesTheionsmigratetotheanode(+)andcathode(-)GlucosereactswithglucoseoxidasetoformhydrogenperoxideThereactionproducesanelectrochemicalmeasuredbytheAutoSensor,83,葡萄糖传感器应用,（1）葡萄糖传感器大肠杆菌改良型葡萄糖传感器MWCNTs-HRP葡萄糖传感器检测血清中葡萄糖浓度,84,大肠杆菌改良型葡萄糖传感器,利用大肠杆菌中的葡萄糖脱氢酶(mGDH)对氧分子的不敏感性而降低干扰。此传感器把大肠杆菌细胞固定在附有苯醌的石墨电极上，中间夹有一层透析膜。检测葡萄糖浓度达0.2-10mM，响应时间在2min左右，此葡萄糖传感器用EDTA处理后可再度使用。,ItoY,YamazakiS,BiosensBioelectron.2002,17(11-12):993-8,85,MWCNTs-HRP葡萄糖传感器,施加电压为-300mv时，可避免抗坏血酸、尿酸等干扰，对葡萄糖在GOD作用下生成的过氧化氢有高的灵敏度。MWCNTs和HRP混合物固定在电极上，制成MWCNTs-HRP改进型电极。检测限达1.0 x10(-7)mol/L,还可在线检测葡萄糖。,YamamotoK,ShiG.Analyst.2003,128(3):249-54,86,检测血清中葡萄糖浓度,在普通葡萄糖电极上加一层多功能膜，使测量不受血液中其它金属离子以及抗坏血酸、尿酸等干扰物质的影响。此多功能膜为磷酸胆碱，甲基丙稀酰胺和纤维素的聚合物。检测血清中葡萄糖浓度达5-650mg/dl，响应时间小于60s，有很好的重现性和稳定性。,ChenCY,IshiharaK.BiomedMicrodevices.1998,1(2):155-66,87,（2）脲电极,Urea+2H2O2NH4+2HCO3-,脲酶,产生的2NH4+为阳离子电极感应。,此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3,88,生物分子识别元件：乙醇氧化酶膜信号转换元件：氧电极,（3）乙醇传感器,生物分子识别元件：乙醇脱氢酶膜信号转换元件：Ox电子传递介质（二茂铁、四硫富瓦烯）15秒，10-610-4mol/L,89,生物分子识别元件：丙酮酸氧化酶信号转换元件：氧电极，H2O2电极及