（分析化学专业论文）小叶丁香抗肝纤维化正丁醇部位药物化学研究.pdf

小叶丁香抗肝纤维化正丁醇部位药物化学研究 摘要 川、叶丁香( s y r j n g a p u b e s c e n s ) 又名毛( 叶) 丁香，雀舌花，巧玲花， 系木犀科( o l e a c e a c e ) 丁香属植物，分布于辽宁、河北、河南、山西、 陕西和甘肃。长期以来，民间以其花泡茶饮用治疗慢性肝炎、肠炎、 食管癌、肝硬化、肝癌等病，疗效显著。经文献检索和查阅大量文献， 其花的药用至今尚未被开发利用。河南省医学科学研究所药理室对该 植物进行了临床疗效及资源方面的实地考察，并经河南农业大学朱长 山教授鉴定了该植物。随即对该花的水提物进行的动物药效初试显 示，该粗提物抗肝纤维化疗效显著，治愈平稳持久，且无毒副作用。 随后，河南医科所与河南省化学研究所天然产物室合作，对该植物的 有效部位进行了系统的提取分离，从中分得了13 个单体化合物，其 中，小叶丁香甙i 为新化合物，首次发现于自然界。对该花抗肝纤维 化有效部位的药理试验显示，二有效部位( 正丁醇部位和乙酸乙脂水 溶部位) 对慢性肝纤维化不仅有明显的治疗作用，且有良好的预防效 果y 本文拄上述研究成果的基础上￥对小叶丁香抗肝纤维化主要有效 部位一一正丁醇部位作了下列药物化学研究： 1 在对抗肝纤维化正丁醇部位继续进行的分离、鉴定过程中发 现，此部位除含有大量裂环环烯醚萜甙类化合物外( 前期工作中已分 离、鉴定出橄榄苦甙和小叶丁香甙a 两种) ，还含有少量黄酮类化合 物一一山奈甙。重点综述了主要有效成分橄榄苦甙近三十年来的相关 研究成孙i 发现橄榄苦甙广泛存在于木犀科的木犀榄属( o l e a ) 、丁 一 香属( s y r i n g a ) 、丰岑属( f r a x i f l u s ) 、女贞属( l i g u s t r u m ) 、木犀属 ( o s m a n t h u s ) 和荣莉属( j a s m i l 3 u m ) 植物中( 已提取分离出橄榄苦 甙的木犀科植物至少在2 5 种以上) ；橄榄苦甙有多种药理作用，国外 中文摘要 对其药理作用的研究已相当深入。近十年来，对橄榄苦甙各种性质的 研究一直呈上升趋势，至1 9 9 9 年，仅上半年c a ( 美国化学文摘) 中 有关橄榄苦甙的文献就有1 8 篇，说明橄榄苦甙已成为研究热点。j 2 通过正交实验，确定了抗肝纤维化正丁醇部位的最佳提取工 艺。漏：佳工艺条件为：采用回流方式，用9 0 乙醇提取两次，每次3 小时，第一萃取剂选用环已烷一乙酸乙酯( 2 ：8 ) 。经过工艺改造，把 正丁醇浸膏经济地处理成了粉末状。利用最佳提取工艺得到的小叶丁 香素收率较高( 约为9 5 ) 。经高压液相检测，所有小叶丁香素样品 中主要有效成分橄榄苦甙的含量均已超过药典中规定的有效部位含量 大于8 0 的标准。： 一 3 根据中国药典2 0 0 0 年版( 二部) 及中药新药研究指南 对从小叶丁香花中提取分离得到的抗肝纤维化正丁醇部位一一小叶丁 香素作了含量限度、鉴别、酸度、溶解度、干燥失重、含量测定和稳 定性试验等方面的系统研究。( 拟定了小叶丁香素( 生产用药品原料) 的质量标准及起草说明，同时为成品制药质量标准建立提供了科学依 据和可行性论证方面的相关资料。对中成药质量控制中最关键的含量 测定部分，本文采用准确度高的反相高效液相色谱法，并通过研究对 此法进行了各项方法学考察。 本项研究填补了小叶丁香抗肝纤维化有效部位在药物化学研究方 面的空白，必将对开发小叶丁香这一民间药用资源、创制防治肝纤维 j， 化新药和实现中药现代化产生重要影响。 7 f 、一， 关键词：小叶丁香抗肝鲆维化正丁醇部位橄榄苦甙山奈甙 、 v 提取工艺小叶丁香素质量控制含量测定 、 ： 、 2 茎奎塑窭 p h a r m a c e u t i c a i c h e m i s t r ys t u d i e so nt h ea n t i - o ir r h o s i s n b u 0 h p o s itio nf r o ms y r i n g ap u b e s c e n s a b a s t r a c t s y r i n g ap u b e s c e n si sas h r u bw i t haw i d ed i s t r i b u t i o ni nc h i n ai t sf l o w e r sh a v e l o n gb e e nu s e dt ot r e a tc h r o n i ch e p a t i t i s ，e n t e r i t i s ，c a n c e ro ft h ee s o p h a g u s ，c i r r h o s i s ， a n dc a n c e ro ft h el i v e ra m o n gt h ep e o p l eb u tt h em e d i c a lb s eo fi t sf l o w e r sh a sn o t b e e n o f f i c i a l l yd e v e l o p e d t od a t ei no u rp r e v i o u sw o r k ，w ee x a m i n e dt h ew a t e r - s o l u b l e c o n s t i t u e n t so ft h i s p l a n t a n dd e t e r m i n e dt h en - b u o hp o s i t i o na st h e m a j o ra n t i - c i r r h o s i sp o s i t i o n ，s t u d i e so nt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t so ft h en - b u o h p o s i t i o nr e s u l t e d i nt h ei s o l a t i o no ft w os e c o i r i d o i dg l u c o s i d e s ：o l e u r o p e i na n do l e o s i d e11 一m e t h y le s t e r i nt h i sp a p e r , w em a d ea t h o r o u g hp h a r m a c e u t i c a l c h e m i s t r yi n v e s t i g a t i o na n ds t u d yo n t h ea n t i c i r r h o s i sn - b u o hp o s i t i o n o u rs h o r t - t e r ma c h i e v e m e n t sa r ee s t a b l i s h e da s f o l l o w s ： 1 t h r o u g hp e r p e n d i c u l a re x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sw e r e d e t e r m i n e da s t h i s ：a d o p t i n g r e f l u xm o d e ，t h ei n i t i a le x t r a c t i o ns o l v e n tu s i n g9 0 i n d u s t r i a le t h a n o l ，t h ea v e r a g er e f l u xt i m eb e i n g3h o u r sa n dt h ef i r s te x t r a c t i o ns o l v e n t b e i n gc y c l o h e x a n e e t h y la c e t a t e ( 2 ：8 ) l a t e r , t h en b u o ho i n t m e n tw a sd i s p o s e di n t o p o w d e r a f t e rt r a n s f o r m i n gt h er e a r m o s tt e c h n o l o g y a sar e s u l t ，t h ee x t r a c t i o nr a t i oo f t h er a wm e d i c i n e ( n a m e l y “x i a o y e d i n g x i a n g s u ”) i sf a i r l yg o o d ( a b o u t9 5 ) b y h p l cd e t e c t i o n t h ec o n t e n to ft h em a i ne f f e c t i v ec o n s t i t u e n t o l e u r o p e i ni n t h e s a m p l e s h a sa l le x c e e d e d8 8 2 a c c o r d i n gt oc h i n e s ep h a r m a c o p o e i aa n dt h es t u d yi n d e xo f n e wt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e ，w en o to n l ys t u d i e dt h ec o n t e n tl i m i t a t i o n , i d e n t i f i c a t i o n ，a c i d i t y , s o l u b i l i t y , d r y i n gt e s t ，q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，a n ds t a b i l i t yt e s t i n go f t h es e m i f i n i s h e d m e d i c i n e ，b u ta l s oe s t a b l i s h e dt h eq u a l i t ys t a n d a r d o ft h er a wm e d i c i n ea l o n gw i t h d r a f t i n ge x p l a n a t i o n t oq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，t h ec r u xp a r to fq u a l i t yc o n t r o l ，w e m a d e u s eo f r p - h p l cw h i c hh a sh i g ha c c u r a c ya n ds t u d i e dt h em e t h o d o l o g yo f i t 3t h ei s o l a t i o na n ds t r u c t u r ee l u c i d a t i o no faf l a v o n o i d - t y p eg l u c o s i d en a m e d k a e m p f e r i t r i n i sr e p o r t e d 3 英文摘要 t h e s ew o r k sm li nt h e g a p so ft h en - b u o hp o s i t i o ni nt h ep h a r m a c e u t i c a l c h e m i s t r yf i e l d ，a n da r eb o u n d t oe x e r ta ni m p o r t a n ti n f l u e n c eo nt h ed e v e l o p m e n to f s y r i n g ap u b e s c e n s , t h ef o r m u l a t i o no f an e wa n t i - c i r r h o s i sd r u ga n dt h em o d e r n i z a t i o n o f t h et r a d i t i o n a ic h i n e s em e d i c i n e k e yw o r d s ：s y r i n g ap u b e s c e n s a n t i c i r r h o s i sn - b u o hp o s i t i o n o l e u r o p e i n e x t r a c t i o n t e c h n o l o g yx i a o y e d i n g x i a n g s uq u a l i t y c o n t r o l q u a n t i t a t i v e a n a l y s i sk a e m p f e r i t r i n 4 前言 前言 小叶丁香( s y r i n g ap u b e s c e n s ) 为木犀科丁香属植物，灌木。又名毛( 叶) 丁香，雀舌花，巧玲花【2 。3 1 ，产自河南、河北、陕西等省”1 ，我省主要分布在 伏牛山区和太行山区【4 1 。中国高等植物图鉴中对该植物有详细记载：“巧玲 花，小灌木，高卜3 米；幼枝无毛。叶圆卵形、椭圆状卵形、菱状卵形或卵 形，长( 1 一) 3 7 厘米，下面沿叶脉有柔毛，偶见一枝上混有有毛和无毛者。花 序由侧芽发出；花较密，长5 1 2 厘米；花冠紫色或淡紫色，直径约8 毫米， 简细瘦，盛开时长1 1 5 厘米；花药着生于花冠筒中部略靠上，带紫色。蒴 果长8 - 1 4 毫米，有疣状突起。分布于辽宁、河北、河南、山西、陕西、甘肃。 生海拔8 0 0 2 0 0 0 米山地沟内或崖石上。庭园栽培；花作香料；茎入药。”本 草纲目、新华本草纲目、秦岭植志和东北木本图志等著作中对该 植物也有记载。经中国中医药文献检索中心河南分中心对1 9 8 7 1 9 9 9 年的文 献检索和查阅大量文献，该花的药用未发现有文献记载，所有我国药典和药 志均不见收录。也未见系统的化学成分的研究报道。但该属其他植物药学、 化学报道广泛。而在当地民间，群众采集小叶丁香花泡茶饮用，用于治疗慢 性肝炎、肠炎、食管癌、肝硬化、肝癌等病由来以久。 小叶丁香在治愈肝疾方面的神奇功能引起了河南医学科学研究所( 卫生 部肝炎研究基地) 药理教研室李月华老师等医务工作者的关注和兴趣。自1 9 9 3 年起，在李月华老师的带领下，该所以嵩县车村为中心点，对该植物进行了 临床疗效及资源方面的实地考察，并深入白云山、石人山区采集植物。随后 对该花水提物进行的动物药效作用初试结果显示： 1 该提取物对动物化学性、免疫性慢性肝纤维化有良好的治疗作用。 2 对呼吸道、消化道常见细菌有一定的抑制作用。 3 可提高动物的免疫功能。 4 对小鼠肉瘤s 。，有明显的抑制作用。 5 对乙肝病毒表现了抑制趋势。 前言 6 小鼠服用相当于临床用量9 6 0 倍的药物时未发现急性毒性。 7 大鼠服用相当于i 临床用量6 0 倍的剂量，连续2 个月，未发现积蓄毒性。 上述试验结果令人鼓舞，在此基础上，李月华老师等确定了对该植物的 研究主要定位于防治慢性肝纤维化的方向上。 肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬变发展的必经阶段，如得不到及时治疗 控制，会严重危害患者生命。拒统计，现全球约有2 8 亿人携带乙肝表面抗 原( h b s a g ) ，其中约有1 0 的患者转为慢性，2 的患者转为肝硬变，而肝炎后 肝硬变病变中约有1 5 病发肝细胞癌，有一些地区甚至达3 2 1 。以上资料充 分警示专业工作者应着眼于该病的早期防治，这对减少肝硬变与肝癌的发生 具有重要意义。现代病理学认为肝纤维化具有进展渐变性、病变可逆性、最 终难治性【5 l 。近年来，中医药在治疗肝纤维化方面作了许多工作，并取得了一 些进展5 i ：着眼于导致肝纤维化的病因治疗，阻止或延缓肝纤维化的发生和 发展中药可通过保肝( 如茵陈、当归、丹皮、芍药等) 、消除炎症( 如连翘、 败酱草、板蓝根、杭菊、芍药、虎杖等) 和抑制免疫反应( 如甘草、黄芩、鸡 血藤、红花、丹参等) 而起抗纤维化作用。而一些中药在抗乙型肝炎病毒( h b v ) 的同时又有抗纤维化作用，如苏氏报道用甘草甜素治疗乙肝患者，结果1 7 例 h b s a g 阳性患者经治疗后有8 例转阴，1 0 例h b s a g 阳性患者经治疗后有5 例 转阴，说明甘草甜素有一定的抗h b v 作用；观察甘草甜素和甘草次酸对复合 病因所致大鼠实验性肝硬化模型的影响，结果甘草甜素治疗的1 1 只大鼠中仅 1 只形成肝硬变，而对照组l o 只中有7 只形成肝硬变，即甘草甜素有诱导干 扰素的作用，而干扰素亦有抗纤维化作用。肝纤维化后，促其逆转肝纤 维化主要决定于胶原合成、沉积、降解和吸收的动态平衡，因此，抑制胶原 合成、沉积，促使其降解和吸收成为重点。有报道小柴胡汤和大柴胡汤可直 接抑制肝细胞纤维化的形成。经丹参治疗的实验性肝纤维化动物，其肝纤维 化较对照组明显减轻，且肝脏胶原蛋白含量亦明显低于对照组，说明丹参可 促进胶原纤维的降解。但鉴于肝纤维化致病机理的复杂性，至今国内外科学 工作者对肝纤维化的治疗仍在探索中。目前国内外对肝纤维化尚缺乏有效的 治疗，虽然干扰索、阿糖腺素、无环鸟甙等抗病毒药物有一定疗效，但药物 6 前言 昂贵，副作用多，不能被广泛应用。因此，将小叶丁香中的有效成分研制成 防治肝纤维化的创新药物具有重大意义。 由于“中药西制”即可保留中草药的疗效显著、安全性高等特点，又可 克服传统汤药服用不方便、质量无法控制等缺点，近年来我国制药工业的发 展又为这一中药现代化的捷径提供了充分条件，“中药西制”引起了人们的极 大兴趣，这一领域也成为当今化学和医学科学的前沿领域之一。基于此思路， 在已发现小叶丁香在治疗肝疾方面的重要保肝价值后，河南医科所与河南省 科学院化学研究所协作，对小叶丁香的有效部位进行了系统的提取、分离、 和鉴定( 这部分工作由尹卫平老师和赵天增老师完成，在第一章中将作详细介 绍) ，并经药物活性成分的追踪筛选，确定了小叶丁香抗肝纤维化的主要有效 成分。对抗肝纤维化有效部位的动物急性毒性试验及化学性慢性纤维化的防 治试验结果显示： 1 二有效部位( 正丁醇部位和乙酸乙酯水溶部位) 的急性毒性均低于水 提物。 2 二有效部位( 正丁醇部位和乙酸乙酯水溶部位) 对慢性肝纤维化不仅 有明显的治疗作用，且有良好的预防效果。 本文在前期工作的基础上，继续作了一些分离、鉴定工作，并根据新药( 中 药制剂) 申报项目( 第二部分药学资料) 的要求深入研究了小叶丁香抗肝纤 维化正丁醇部位的提取工艺和质量标准，从而为生产用原料药和成品制药质 量标准建立提供科学依据和可行性论证方面的相关资料。 参考文献 【1 】陈嵘，等中国树木分类学，上海科技出版社，1 9 5 9 ，1 0 5 l 【2 】谢宗万，余友芩全国中草药名鉴，人民卫生出版社，1 9 9 6 ，6 7 8 3 】中国科学院植物研究所，中国高等植物图鉴，科学出版社，1 9 7 4 ，3 4 2 4 朱长山，等河南种子植物检索表，兰州大学出版社，1 9 9 4 ，3 1 8 【5 王永兵，毛福林，王强，等中草药治疗乙型肝炎的研究进展，中国野生植物资 源2 0 0 0 ，1 9 ( 5 ) ，5 - 8 7 第一章小叶丁香抗肝纤维化有效部位的化学成分 第一章小叶丁香抗肝纤维化有效部位的化学成分 小叶丁香抗肝纤维化有效部位分为正丁醇部位和乙酸乙酯水溶部位两部 分”1 。其系统分离流程图如下： 小叶丁香花 士7 5 乙醇浸泡 浸液 l 渗漉( 2 ) 审减压浓缩 粗浸膏 l 加水溶解，过滤 乙酸乙酯萃取 厂 油层水层 l 减压 j 浓缩 乙酸乙酯浸膏 l 加水溶解后， 乙醚萃取 厂 水层油层 l 减压( x ) j 浓缩 粗提物 0 柱层析 寡糖链酯糖甙 及醇、糖化合 物( 抗肝纤维化) 水层 ( x ) 油层 上， 正丁醇浸膏 j 柱层析 裂环环烯醚萜 甙类等化合物 ( 抗肝纤维化) 第一章小叶丁香抗肝纤维化有效部位的化学成分 小叶丁香抗肝纤维化有效部位的成分比较复杂，其分离、鉴定工作仍在 继续进行中，本文重点介绍正丁醇部位。 一、正丁醇部位 正丁醇部位是小叶丁香抗肝纤维化的有效部位，其中主要为裂环环烯 醚萜甙类化合物。 1 裂环环烯醚萜甙类 裂环环烯醚萜甙( s e c o i r d o i dg l u e o s i d e s ) 属一萜类苦味素，该类化合物广 泛分布在植物界，尤以龙胆科( g e n t i a n a c e a e ) 和木犀科( o l e a c e a e ) 最为普遍。 龙胆类苦味素可作为裂环环烯醚萜甙的代表。属于龙胆科的许多植物，特别 是龙胆属( g e n t i a n a ) 和獐牙菜属( s w e r t i c a ) 很多品种的全草和根都含有类似 的苦味甙，是这些草药中用作苦味健胃剂的苦味有效成分【2 】。例如，当药 ( s w e r t i ac h i n e n s i s f r a n c h ) 全草中含有的獐牙菜甙( s w e r o s i d e ) 、山茱萸( c o r n u s o f f i c i n a l iss e tz ) 叶中含有的忍冬苦甙( 1 0 n i c e r o s i d e ) 、长毛败酱 ( p a t r i n i av i l l o s aj u s s ) 底下部分中含有的莫诺甙( m o r r o n i s i d e ) 和接骨 木中含有的金吉甙( k i n g i s i d e ) 等均具有苦补健胃的作用【2 1 。木犀科约2 0 属 5 0 0 种，广泛分布在温带、亚热带及热带地区。我国有1 2 属，2 0 0 种，南北 各省均有分布川。目前，从木犀科的木犀榄属( 0 1 e a ) 、丁香属( s y r i n g a ) 、 茉莉属( j a s m i n u m ) 、楞属( f r a x i n u s ) 、女贞属( l i g u s t r u m ) 、木犀属 ( o s m a n t h u s ) 、连翘属( f o r s y t h i a ) 和雪柳属( f o n t a n e s i a ) 等的多种植物中均 已分离出裂环环烯醚萜甙类化学成分。 裂环环烯醚萜甙均为结晶固体或无定形具有吸湿性的粉末。由于这类 化合物分子量都不大，且往往含有极性功能基，所以在溶解性方面虽然甙元 比甙的亲脂性强，但总的来说都偏于亲水性。故这类成分大多易溶于水和甲 醇，可溶于乙醇、丙酮、正丁醇，难溶于氯仿、苯、石油醚等亲脂性有机溶 齐1 j 。这类化合物分子中c 。，c 。，c 。多形成手性碳原子，使整个分子失去对称 第一章小叶丁香抗肝纤维化有效部位的化学成分 因素，故皆具有旋光活性f 4 1 。 裂环环烯醚萜甙对酸很敏感，甙键易为酸水解断裂，所得甙元因具有半 缩醛结构，性质活泼，容易进一步发生氧化聚合等反应。故水解后不但难得 到原甙的甙元，且随水解条件的不同( 温度、酸的浓度) 产生不同颜色的沉 淀【4 l 。此类成分分子中的环烯醚部分的双键由于受临位氧原子的影响，性质 活泼，在冷甲醇溶液中易与溴反应生成溴及甲氧基的加成产物。 许多裂环环烯醚萜甙的分子中c 。上结有“一c o o ”基团，它与环烯醚中 的双键形成了a ，b 一不饱和羰基，所以在紫外吸收光谱中出现2 3 5 毫微米 左右的最大吸收峰，红外光谱中也具有相应的吸收峰，而在核磁共振谱中环 烯醚键上的烯氢也能表现出清楚的吸收峰( 约7 3l p p m ) 2 1 0 橄榄苦甙( o l e u r o p e i n ) 并h 小叶丁香甙a ( o l e s i d e1 1 - m e t h y le s t e r ) 是从小叶 丁香正丁醇部位分离出的两个裂环环烯醚萜甙类化合物，其中橄榄苦甙为正 丁醇部位的主要成分。 1l 橄榄苦甙 橄榄苦甙是比较重要的一种苯酚类裂环环烯醚萜甙，广泛存在于木犀科 的木犀榄属、丁香属、孝岑属、女贞属、木犀属和茉莉属植物中。 1 1 1 化学名5 1 2 h - p y r a n 一4 一a c e t i ca c i d ，3 - e t h y li d e n e 一2 一( b d - g l u c o p y r a n o s y l o x y ) 一3 ，4 - d i h y d r o 一5 一( m e t h o x y c a r b o n y l ) 一，2 ，( 3 ，4 - d i h y d r o x y p h e n y l ) e t h y l e s t e r ， 2 s - ( 2d ，3 e ，4b ) 卜 1 l 2 结构式1 5 1 l o i 1 3 分子式及分子量1 5 】 c 2 s h 3 2 0 1 3 ：5 4 0 4 3 1 1 4 理化性质 小结晶( 醋酸乙酯) ”或无定形粉末睁”，熔点8 7 9 c ，吸湿。 口 g 。- 1 4 7 。 ( c = i ，水，乙醇或丙醇) ，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶、冰醋酸和5 0 氢 氧化钠溶液，溶于水、丁醇、二氧六环、醋酸乙酯和醋酸丁酯，几乎不溶于乙 醚、石油醚、氯仿、苯和四氯化碳”1 。u v 拶( n m ) ( 1 0 9e ) ：2 3 2 5 ( 4 1 9 ) ， 2 8 2 5 ( 3 4 7 ) 6 1 ：i r 愦m _ 1 3 4 2 5 ，1 7 3 8 ，1 7 1 3 ，1 6 3 4 ，1 5 2 1 ，1 0 7 6 。8 1 6 t 6 】：s i m s m z ：5 6 3 m + n a + ，5 4 1 m + h + ，3 6 1 ，1 6 5 ，1 3 71 6 1 ：1h n m r ( c d 3 0 d ) ：67 5 0 ( s ，h - 3 ) ，6 7 9 ( d ，j = 8 o h z ，h - 7 ”) ，6 6 6 ( d ，j = t 9 h z ，h - 4 ”) ，6 5 4 ( d d ，j - 8 0 h za n dj ：1 9 h z ，h - 8 ”) ，6 0 7 ( b rq ，j = 7 2 h z ，h 一8 ) ，5 9 0 ( b rs ，h - i ) ，4 2 0 ( d r ， j = 1 0 7 h z a n d j = 7 o h z ，h , - 1 ”) ，4 0 9 ( d t ，j = l o 7 h z a n d j = 7 o h z ，一1 ”) ， 3 9 6 ( d d ，j = 9 2 h za n dj = 4 4 h z ，h - 5 ) ，3 7 0 ( 3 h ，s ，c o o m e ) ，2 7 5 ( 2 h ，t ，j = 7 0 h z ，h 一2 ”) ，2 7 0 ( d d ，j = 1 4 i h z a n d j = 4 4h z ，h - 6 ) ，2 4 2 ( d d ，j = 1 4 i h z a n d j = 9 2 h z ，h b - 6 ) ，1 6 5 ( d d ，3 = 7 2 h za n d3 = i 3 h z ，1 0 一m e ) ，4 8 1 ( d ，j = 7 6h z ， h - i ) i | 1 ：1 3c n m r ( c d 3 0 d ) 和d e p t 数据：69 5 0 ( c - i ，c h ) ，1 5 4 9 ( c - 3 ，c h ) ， 一墨二童! ：壁! 量墓墅堑堡些宣整塑竺塑些堂堕坌 1 0 9 1 ( c 一4 ，c ) ，3 1 5 ( c 一5 ，c h ) ，4 1 0 ( c 一6 ，c h 2 ) ，1 7 2 9 ( c 一7 ，c ) ，1 2 4 6 ( c 一8 。 c h ) ，1 3 0 3 ( c 一9 ，c ) ，1 3 2 ( c l o ，c h 3 ) ，1 6 8 5 ( c 1 1 ，c ) ，1 0 0 7 ( c 一1 ，c h ) ， 7 4 5 ( c 一2 ，c h ) ，7 8 1 ( c 一3 ，c h ) ，7 1 2 ( c 一4 ，c h ) ，7 7 7 ( c 一5 ，c h ) ， 6 2 5 ( c - 6 7 ，c 心) ，1 3 0 5 ( c 一3 ”，c ) ，1 1 6 2 ( c 一4 ”，c h ) ，1 4 6 0 ( c 一5 ”，c ) ， 1 4 4 7 ( c 一6 ”，c ) ，1 1 6 8 ( c 一7 ”，c h ) ，1 2 1 0 ( c 一8 ”，c h ) ，6 8 6 ( c 一1 ”，c h 2 ) ， 3 5 1 ( c - 2 ”，c h 2 ) ，5 3 0 ( m e o ，c h 3 ) ”。 1 1 5 植物来源 橄榄苦甙广泛存在于木犀科的木犀榄属( o l e a ) 、丁香属( s y r i n g a ) 、 丰岑属( f r a x i n u s ) 、女贞属( l i g u s t r u m ) 、木犀属( o s m a n t h u s ) 和茉莉属 ( j a s m i n u m ) 植物中。到目前为止，已提取分离出橄榄苦甙的木犀科植物至 少在2 5 种以上： a 木犀榄属( o l e a ) ：洋橄榄0 1 e ae r u o p a e al 叶【9 】，o i e aa f r i c a n a 1 “， 0 1 e ac a p e n s i s 1 。 b 丁香属( s y r i n g a ) ：野丁香s y r i n g av u l g a r i s i n - 1 2 】s y r i n g a r e t i c u l a t a ( b l u m e ) h a r a ! ”l 。 c 孝岑属( f r a x i n u s ) ：日本白蜡树f r a x i n u sj a p o n i c ab l u m e 叶4 1 ， f r a x i n u sm a n d s h u r i c aj a p o n i c a ! ”1 ，f r a x i n u s a n g u s t i f o l i a t l 6 1 7 1 ，白蜡树 f r a x i n u sc h i n e n s i s ，f r a x i n u si n s u l a r i s 【1 9 j ，欧洲白蜡树f r a x i n u s e x c e l s i o rb a r k t 8 l ，f r a x i n u so x y c a r b al e a v e l 2 “，花白蜡树f r a x i n u so r n u s b a r k ”i ，p h i l l y r e aa n g u s t i f o l i al 1 2 2 1 。 d 女贞属( l i g u s t r u m ) ：女贞l i g u s t r u ml u c i d u ma i t 果实【2 3 1 ，日 本女贞l i g u s t r u mj a p a n i c at h u n b 果实【2 3 i ，l i g u s t r u mo b t u s i f o l i u m t “1 ， l i g u s t r u mj a p o n i c u mt h u n b1 2 ”，欧洲女贞l i g u s t r u mv u l g a r e 2 6 - 2 7 1 ：非利女 贞p h i1 1 y r e am e d i a l 1 1 】。 e 木犀属( o s m a n t h u s ) ：刺叶桂花o s m a n t h u si li c o f o l i u s t ”1 ，齿叶 第一章小叶丁香抗肝纤维化有效部位的化学成分 木犀o s m a n t h u sf o r t u n e ic a r r t 2 9 ，0 s m a n t h u sa s i a t i c u sb a r k l 3 0 - 3 q 。 f 茉莉属( j a s m i n u m ) ：j a s m i n u mp o l y a n t h u mf r a n c h i “ 3 2 - 3 3 1 j a s m i n u m m u l t i f l o r u m 3 “。 1 1 6 药理作用 a 心血管作用：橄榄苦甙对正常血压的麻醉猫和诱导高血压的清醒犬有 降血压作用。 狗静脉注射1 0 m g k g 和3 0 m g k g ，收缩压下降6 0 ，舒张压 下降7 0 ；猫3 0 m g k g ，血压下降3 6 。橄榄苦甙在体外可加速分离的兔、 猫心脏的冠状动脉流动。橄榄苦甙还有抗心律不齐的作用 3 5 - 3 6 】。c c i r c o s t a 等作了鼠和兔的体内及体外实验，研究了多种洋橄榄提取物的心血管性能， 并报道橄榄苦甙具有较高的活性【3 7 1 。f d r i s s 等研究了橄榄苦甙在体外对血 小板聚集、红细胞畸形和红细胞膜脂肪酸预氧化感受性的影响，发现橄榄苦 甙可改善红血球畸形【3 8 1 。 b 抗菌作用：从洋橄榄中分离出的苯酚化合物橄榄苦甙有抗胚芽乳杆菌 的作用。加热处理过的橄榄苦甙也有杀菌作用，但用碱处理过的橄榄苦甙对 大多数胚芽乳杆菌不起作用1 3 9 1 。c ct a s s o n 和gj e n y c h a s 研究了在肠 形菌培养基和复制牛乳( 模型食物系统) 中橄榄苦甙对肠炎沙门氏菌的抑制 作用。结果发现，在肠形菌培养基中，接种体最初尺寸、介质p h 值和附加 物浓度对抑制作用有影响，低p h 值和低尺寸时抑制作用较大；而在复制牛 乳中抑制作用不明显。在n z a + 和b h i + 中，低浓度( o 1 w v ) 橄榄苦甙的 存在，可抑制金黄色酿脓葡萄球菌的生长【4 l 】。c c t a s s o n 和g j e n y e h a s 还发现在培养基和复制牛乳中橄榄苦甙对金黄色酿脓葡萄球菌均有抑制作用 【4 2 i 。橄榄苦甙对蜡样芽胞杆菌有抑制作用 4 3 1 。橄榄苦甙浓度为0 4 m g m l 时可完全抑制大肠肝菌、肺炎肝菌、蜡样芽胞杆菌的生长i “。橄榄苦甙可 抑制弧菌属、葡萄球菌属和沙门氏菌属细菌( m i c 值在6 2 5 5 0 0 1 t gm l _ 1 之间) 的生长，但对嗜血杆菌属和摩拉克菌属不起作用【“。 一 兰二兰尘生工垂苎墅堑丝些互垫塑垒塑些堂堕坌 c 抗真菌作用：橄榄苦甙对黄曲霉和寄生曲霉均有抑制作用i 删。h g o u r a m a 和lb b u l l e r m a n 研究了2 5 c 条件下橄榄苦甙对黄曲霉毒素生长 的作用，发现橄榄苦甙浓度为2 ，4 和6 m g m l 时，g a n 培养基对曲霉生长 和孢子形成有抑制作用【4 “。橄榄苦甙浓度为0 2 ，o 4 和o 6 时，对真菌 生长稍有刺激作用i4 ”。 d 抗炎作用：m d eg a r m e nr e c i o 等用角叉菜胶诱导鼠爪水肿和t p a 诱 导鼠耳水肿两种模型研究了1 2 种环烯醚萜甙的抗炎作用，结果作者基于不 同取代模式( 尤其羟基化，酰基化) 建立了物质结构与抗炎作用的关系1 4 s 】。 b f e h r i 等的角叉菜胶诱导鼠爪水肿模型显示洋橄榄提取物有较强的抗炎作 用，这种作用在角叉菜胶诱导后可持续2 4 小时l 。n i v a n o v a k s 等所作的 f r a x i n u so x y c a r p a 甲醇提取物的动物体内、外实验显示，对角叉菜胶诱导鼠 爪水肿模型的抑制作用大约为4 8 ，对眼镜蛇毒液诱导水肿模型的抑制作 用大约为8 0 【”1 。 e 抗病毒作用：橄榄苦甙有抗疱疹病毒的作用】。 f 抗氧化作用：在5 0 。避光条件下作抗氧化实验。用预氧化值和共扼二 烯在2 3 2 n m 处的吸收估计抗氧化速率。五种化合物的相对抑制效应以下列 顺序排列；h y d r o x y t y r o l c a f f e i ca c i d b h t o l e u r o p e i n t y r o s o l t ”】。橄榄 苦甙以2 5 或5 0 m g k g 的剂量注入w i s t a r 菌株雄鼠体内三周，通过t l c f i d 测试发现动物体内胆甾烯脂量增加，三甘油脂量减少。在5 0 m g 橄榄苦甙组 ( 神经) 鞘磷脂和溶血卵磷脂量有所增加，在2 5 m g 橄榄苦甙组则无此现象。 另外，动物心脏极性类脂中亚麻酸量显著减少。治疗后，注入鼠心脏的橄榄 苦甙量在逐步增加，a 一和b 一维生素e 量则在减少。因此，橄榄苦甙可在 心脏中作为天然抗氧化剂的替代品j 。f v i s i o l i 和c g a l l i 通过对多种 参数的评估，发现橄榄苦甙浓度为l o 。5 m 时可有效阻止c u s 0 4 诱导的l d l 氧 化i s 4 】。五种化合物胶束的抗氧化性以下列顺序增加：b h t t y r o s o l c a f f e i c 第一章小叶丁香抗肝纤维化有效部位的化学成分 a c i d 2 选用上述色谱条件，可以把小叶丁香素很好地分成以四个以上主要色谱峰， 分离结果见附录图3 - 3 。 塑三兰尘! ! 重垫墅堑丝垡垩i 壁塑垡塑堕量叁! ! 堑塞 51 2 限度 以橄榄苦甙为对照品，按含量测定项下方法操作，测定五批小叶丁香素中橄 榄苦甙的含量，结果表明橄榄苦甙含量均在8 8 以上。据此，在含量限度项下规 定，橄榄苦甙含量不得低于8 8 ( 见表3 5 ) 。 5 2 高效液相含量测定方法学研究 5 21 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的橄榄苦甙适量，以流动相为溶剂，配制成2 5 m g m l 的 溶液，作为对照品溶液。 522 供试品溶液的制备 精密称取适量样品，加入5 m l 流动相，超声振荡后，定容至l o m l ，作为供试 品溶液。 5 23 线性关系考察： 精密吸取对照品溶液1 0 r a l 、5 m l 、4 m l 、3 m l 、2 m ! 、l m l ，置于l o m l 容量瓶 中，稀释至刻度。摇匀后，进样lul ，测定。同一浓度测三次，取其平均值( 见 表3 1 3 、附录图3 8 ) 。以对照品的量( m g m 1 ) 为横坐标，橄榄苦甙的峰面积为纵 坐标，得回归方程( 线性回归程序见附录4 ) ；y = 3 3 7 x1 0 5 x + 1 7 7 1 0 3 ，r = o9 9 9 9 ， 线性范围：o2 5 25 0 表3 1 3 线性回归试验结果表 5 2 4 精密度试验 按上述色谱条件，用浓度为l1 1 m g m l 的橄榄苦甙进样8 次，每次1ul ，分别 测得各次峰面积，结果r s d 值为o 8 2 ( 见表3 - 1 4 ) 。 一兰三兰尘生工童垫墅竺丝些垩! 壁塑鱼塑重量丝! ! 塑窒 表3 - 1 4 精密度试验结果表 3 9 0 4 1 73 8 4 7 2 73 8 9 3 9 33 8 7 9 1 2 3 2 7 40 8 2 3 8 5 7 9 53 8 5 6 0 4 5 24 样品测定 按上述方法精密吸取供试品溶液l ou1 ，进样测定。 5 25 加样回收率实验 精密称取已知橄榄苦甙含量的样品5 份，其中4 份加入0 0 5 9 橄榄苦甙对照品， 1 份不加，按样品测定项下操作，测得平均回收率为1 0 1 4 8 ，r s d = 2 0 6 ( 见表 3 1 5 、附录图3 9 ) 。 表3 1 5 加样回收率试验结果表 样品号本底量实际加a万总检出量检出加回收率 量里( 堑2 5 9 2 6 4 9 1 4 0 1 3 2 70 0 5 0 95 7 2 0 7 95 7 9 5 1 70 1 8 5 400 5 2 71 0 3 5 5 7 3 8 2 3 5 6 2 2 3 0 o1 3 2 00 0 4 9 45 6 1 9 7 85 7 1 5 1 6o 1 8 2 80 0 4 8 89 8 8 5 9 0 3 4 1 回收率平均值( ) r s d 平均值( ) 1 0 1 4 2 1 6 l 一一墨三苎尘! 工重垫墅竺丝些垩i 壁塑垡塑堕墨丝! ! 墅塞 参考文献 1 刘振武和李满飞，中药产业的可持续发展与g a p ，中草药1 9 9 9 ，3 0 0 1 ) ，附 4 7 【2 林启寿，中草药成分化学，科学出版社，1 9 7 7 ，8 0 8 1 【3 】徐任生和陈仲良，中草药有效成分的提取与分离，上海科学技术出版社，1 2 1 4 【4 】林启寿，中草药成分化学，科学出版社，1 9 7 7 ，6 1 1 - 6 1 2 5 林启寿，中草药成分化学，科学出版社，1 9 7 7 ，3 1 1 3 1 5 【6 国家药典委员会，中华人民共和国药典