（生物化学与分子生物学专业论文）真菌新snorna基因簇Ⅱ的鉴定与表达分析.pdf

羹蕉真菌新s i 、o r n a 基随簇l 鉴定与寝运分析南昌大学硕士学位论文2 0 0 6 摘要 核仁小分子r n a ( s m a un u e l e o l a rr n a ，s n o r n a ) 是一类最主要的菲编鹃 r n a ，它在真孩生物孩糖体的生物台成中起关键作用，主要参与核糖体r n a 前 体的剪切船工和指导r g n a 上特定位点的27 o 一核糖甲基化以及尿嘧睫肉假尿 崤啶的转换等转录后修饰。s n o r n a 在结构、功能以及基因组织等多方面存在着 多样性，因此，对s n o r n a 的研究已成为了r n a 级学研究的热点。 酿酒静母s n o r n a 基因簇i i 是由三个b o x c d 类s n o r n a 紧密连锁担 列在一 起的多顺反子s n o r n a 基因簇。本文遂过b l a s t 搜索襄藩基因缀数据库，在3 e 种真菌中发现了s n o r n a 基因簇i i ，表明s n o r n a 基函簇i i 在真菌中是普遍存在 的。在所有的瓤鉴定的3 0 个s n o r n a 基因簇i i 中，仅l o 个是以独立享专录的 s n o r n a 基因簇的形式存在，其余2 0 个则是由非蛋是编码基魍的内含孑绽玛购。 k f - p c r 实验遴一步验证了这些s n o r n a 基因簇的存在。 比较鉴定宜不简菌种的s n o r n a 基因簇i i ，发现s n r 5 7 仅存在于少数低等的 酵母菌中，通过同源分板在裹等的动植物中也未能找到s n r 5 7 的功能同源分子， 这些结果都显示s n r 5 7 仅，汉是s n o r n a 系统进化过程中的一个过窖，它短暂的存 在予低等真核生物体，联系到s n r 5 7 中采用的菲标准拘b o x 綦序，s n r 5 7 的消亡 也是必然的结果，从中也迸一步证明了b o x c 与b o x d 基序对于该类s n o r n a 的 存在具有重要意义。 解指邵氏酵母s n o r n a 基因簇l i 的宿主基因是一个；# 蛋白编码萋因，三个紧 密耦连的内含予依次编码s n r 5 7 、s n r 5 5 和s n r 6 1s n o r n a 。r t - p c r 和测序结果 分辑，发现这个非编鸦r n a 基因通过逸撵性剪接产生两种不同趵转最产物。其 一，各内含子随机切除，形成个楣对长的转录产物；其二，编码s n r 5 5 秘s n r 6 1 的两个内含予作为整体从前体剪接下来，连接二者的外显子亦不畿存在于终产物 中，而导致产生一个相对短朐转录产物。在本课题的研究中意外士c 甄发现的非蛋白 编码基陵的选择性剪接现象，是在低等翼核生物中的罄次发现。 在汉逊氏德巴利酵姆s n o r n a 基因簇i l 的宿主基因也是一个菲蛋据编码基 因，在这非蟹自编鸦基因中发现了种独特的基因结构：分莉编码s n r 5 7 和 s n r 5 5 的殛个内含予在剪接位点辐互重叠，琢为重璺内食子。r t - p c r 分章厅鞠溅 序结果显示，在成熟过程中，这一独特结构中的一个内含予曹先被剪接后，另一 龚熹 粪蓥新s n 。r k a 鼙固簸 | 的鉴定与表达分老母 枣基大学顼士学位论文2 0 0 6 个看似不完整的内含子利用被剪接内含子上游或下游的鸟苷酸重新组合成个 完整的剪接位点，并参加到掰一轮的转酯反应。这个重叠内含子的研究对进一步 豹阐明基因豹结构以及内含子的赵源靼结构有重要的意义。 邋过对真莲s n o r n a 基因簇i i 兹系绞研究，不仅发现了繇有的重爨内含予瓤 n c r n a 酌选择性蒡接蕊象，也探讨了s n o r n a 基因簇i l 瓣结梅萃蟊表达方式。这 些研究成柴丰富了对s n o r n a 基因簇的认识，为避一步阐疆s n o r n a 蒸因簇的起 源和进化提供依据。 关键词：真菌，s n o r n a 基因簇i i ，n c r n a ，选择性剪接，熏叠内含子 l i 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇i l 的鉴定与表达分析 南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 a b s t r a c t s m a l ln u c l e o l a rr n a s ，am a j o rp a r to fs m a l ln o n c o d i n gr n a ，p l a ya l li m p o r t a n t r o l ei nr i b o s o m eb i o g e n e s i s af e ws n o r n a sa r ei n v o l v e di nc l e a v a g eo fp r e r r n a ， w h e r e a sm o s to f t h e mh a v eb e e ns h o w nt od e t e r m i n ep o s t - t r a n s c r i p t i o n a lm o d i f i c a t i o n i np r e r r n a s ：g u i d e ds i t e s p e c i f i c2 一o r i b o s em e t h y l a t i o na n dp s e u d o u r i d y l a t i o ni n p r e r r n a d u et ot h ed i v e r s i t yo fs n o r n ai ns t r u c t u r e ，f u n c t i o na n do r g a n i z a t i o n ， s n o r n a sh a v er e c e n t l yb e c o m eah o ts p o ti nr n o m i c sr e s e a r c h t h es n o r n ag e n ec l u s t e ri ii d e n t i f i e df r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，w h i c h c o n t a i n st h r e em e m b e r so fb o x c df a m i l i e s ，i st r a n s c r i b e di n d e p e n d e n t l yf r o mt h e i r o w r lp r o m o t e r i nt h i sp a p e r , t h i r t yn o v e ls n o r n ag e n ec l u s t e r si id e r i v e df r o m t h i r t ys p e c i e so ff u n g iw e r ei d e n t i f i e dt h r o u g hb l a s t s e a r c hi nt h eg e n o m i cd a t a b a s e o ff u n g i t h i sr e s u l tr e v e a l e dt h a ts n o r n ag e n ec l u s t e r1 1w a sc o m p r e h e n s i v e l y e x i s t e di nf u n g i i nt h e s et h i r t ys n o r n ag e n ec l u s t e r si i ，o n l yt e nw e r ee x i s t e d t h r o u g hi n d e p e n d e n ts n o r n ag e n ec l u s t e r ，t h eo t h e r sw e r ee n c o d e db yi n t r o n so f n o n c o d i n gr n ag e n e s r t - p c re x p e r i m e n t s a l s op r o v e dt h e s eg e n ec l u s t e r st oe x i s t c o m p a r e ds n o r n ag e n ec l u s t e r si id e r i v e df r o md i f f e r e n to r g a n i s m s ，t h es n r 5 7 s n o r n aw a so n l yf o u n di ns o m el o w e rs a c c h a r o m y c o g n a m o r e o v e gt h o s es n r 5 7 s n o r n a si nl o w e rs a c c h a r o m y c o t i n aa d o p tn o n s t a n d a r db o x ca n db o x dm o t i f s t h i s d e m o n s t r a t e dt h a t ，b o x ca n db o x dm o t i f sw e r ei m p o r t a n tt on o to n l ys t r u c t u r ea n d f u n c t i o ni nb o xc ds n o r n a ，b u ta l s os t e a d yi n h e r i t a n c e t h eh o s tg e n eo fs n o r n ag e n ec l u s t e ri ii ny a r r o w i at i p o t i c aw a san o n - c o d i n g r n ag e n e ，i nw h i c ht h r e es n o r n a sw e r ee n c o d e di nt h r e ea d j a c e n ti n t r o n s ， r e s p e c t i v e l y a n a l y s i so fr t - p c ra n ds e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a tt h en c r n a g e n eh a d t w od i f f e r e n tt r a n s c r i p t st h r o u g ha l t e r n a t i v e l ys p l i c i n gp a t t e m o n ep r o c e s sp r o d u c e d ac o m p a r a t i v e l yl o n gt r a n s c r i p ti nw h i c ht h r e ei n t r o n sw e r er a n d o m l ys p l i t o t h e r w i s e ， i nt h ep r o c e s so fp o s t t r a n s c r i p t i o n ，t w oi n t r o n sw h i c he n c o d e ds n r 5 5a n ds n r 6 1 w e r es p l i tt o g e t h e ra saw h o l e d u et os p l i tt h ee x o nl i n k i n gt h et w oi n t r o n s ，t h es m a l l t r a n s c r i p tw a so b t a i n e d t h ep h e n o m e n ao fa l t e r n a t i v e l ys p l i c i n gi nn c r n a f o u n di n o u rr e s e a r c h ，w a sf i r s t l yr e p o r t e di nl o w e re u c a r y o t a i i i 蕤熹粪蓖毅鼬o r n a 蕤尽鹱l 斡鉴定与表达分攒南最失学壤学位论文 2 0 0 6 t h eh o s tg e n eo fs n o r n ag e n ec l u s t e ri ii nd e b a r y o m y c e sh a n s e n i iw a sa l s oa n o n - c o d i n gr n ag e n e ，i nw h i c hw ed e t e c t e da l le s p e c i a lg e n es t r u c t u r e t h es p l i c e s i t e so f t w oi n t r o n sw h i c he n c o d e ds n r 5 7a n ds n r 5 5w e r eo v e r l a p p e d ，w en a m e di ta s o v e r l a p p i n gi n t r o n 。a n a l y s i so f r t - p c r a n ds e q u e n c i n g ，r e v e a l e dt h a ta f t e ro n ei n t r o n w a ss p l i t ，t h eo t h e rc a r lu t i l i z eu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a mn u c l e o t i d e1 0r e c o m b i n ea n e wa n di n t e g r a t i v es p l i c es i t e ，t h e nr e l e a s e d i ti si m p o r t a n tt oc l a r i f yt h es t r u c t u r eo f g e n ea n de v l u f i o no f i n t r o n i n t h i sr e s e a r c h ，w ei d e n t i f i e dal a r g en u m b e ro fs n o r n ag e n ec l u s t e ri ia n d d i s c u s s e dt h es t r u c t u r ea n de x p r e s s i o no fc l u s t e ri i f u r t h e r m o r e ，w ed i s c o v e r e da p e c u l i a ro v e r l a p p i n gi n t r o na n da na l t e r n a t i v es p l i c i n gi nn c r n a t h e s er e s u l t s i n c r e a s e dt ot h ek n o w l e d g eo ft h es n o r n ag e n eo r g a n i z a t i o na n de x p r e s s i o n , a n d p r o v i d e dc l u e st oc l a r i f y t h ee x p r e s s i o na n df u n c t i o no f n c r n a k e y w o r d s ：f u n g i ，s n o r n ag e n ec l u s t e r si i ，n c r n a ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g ，o v e r l a p p i n g i n t r o n i v 独创性声明 率入声瞻所呈交的学位论文是本久在导筛指导下进行的磅究工作及取得静研究 成果。握我所知，赊了文中特别加以标注和致谢的地方辨，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成柴，也不包含为获得盘釜叁鲎或其他教育机构的学位 或证书而使焉过的材料。与我一同工作抟同志对本溪究所傲的任何贡献均已在论文 中作了嫂确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：东裹。 签字日裙妒唣6 月：f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文 ，乒者完全了鳃遗量盘茎有关保凳、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和储阅。 本人授投壹噩兰量登可以将学位论文韵全部或部分内容编入有关数摄瘁进行捡索， 可以采购影印、缩印戏扫拭等复铡手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 鞭 导师签名 了善，蕊 签字日期罗冬月：；固 签字日期p 蟛午占月2 曰 学位论文作者毕业后去向： 工作难位： 通讯地址： 电话： 邮编： 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析 南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 第一章综述 第一节非编码i a 及其研究现状 随着对r n a 研究的不断深入，人们发现除了过去所熟知的m r n a 、r r n a 、 t p , n a # b ，在生物体中还存在着一类直被忽视的不编码蛋白但有功能的r n a ， 这就是非编码r n a ( n o n c o d i n gr n a ，n c r n a ) 1 1o 由于一直以来人们受中心法 则的影响，忽视了n c i 州a 的作用，因此它的发现是出乎意料而断断续续的。目前 发现的n c r n a 种类繁多，大小不一，既包括约1 7 k b 的x i s t r n a ，也包括仅2 1 - 2 3 m 的m i c m r n a 。但大部分为2 0 5 0 0 n t ，比多数m r n a d 、得多，因而又被称为 s n m r n a ( s m a l ln o n m e s s e n g e ra n a ) 。 n c r n a 在细菌、真菌、哺乳动物等许多生物体的重要生命活动中发挥着极广 泛的调控作用，如在染色体的转录与失活、r r n a 的加工与修饰、基因的表达与 关闭、细胞周期乃至个体发育等过程中均具有重要的作用 2 j 。近年来，在线虫、 果蝇、哺乳动物以及植物中发现的m i c r o r n a ( m i r n a ) ，能与m r n a 形成相互配 对的双链结构，从而起到抑制m r n a 的翻译或诱导m r n a 的降解的作用口“】；在 果蝇中发现m i r n a 参与了细胞增殖、细胞凋亡和脂肪代谢的调控过程1 5 “7 j ；在 植物中也发现了调控花叶发育的m i r n a i “9 1 , 这些都表明了m i r n a 可能在基因表 达、细胞周期以及个体发育过程的调控领域起着超乎预料的重要的作用。另一种 普遍研究和应用的小分子r n a 是s i r n a ，它是与m i r n a 具有相似大小的d s r n a 分子，参与r n a 干涉( r n a i ) 过程，具有诱导m r n a 降解而使基因表达沉默的 功能。将脊椎动物的免疫系统和r n a i 现象进行比较之后，认为两者具有相似性， 都是为了区分“自我”和“非自我”，因此r n a i 被认为是一种基因组的免疫系统。 利用r n a i 技术，在r n a t 7 o ) 均可以使用，但是d n a 的洗脱率通常要底2 0 左右。 9 2 操作步骤 1 ) 用琼脂糖凝胶电泳将目的d n a 片段与其它d n a 尽可能分开，然后用干净 的手术刀割下含需回收d n a 的琼脂块，放入1 5 m l 离心管中。判定d n a 片段的位置时尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能 短。 2 ) 按4 0 0 1 1 0 0 m g 琼脂糖凝胶的比例加入b i n d i n gb u f f e r ，置于5 0 6 0 c 7 j 浴中1 0 m i n ，使胶彻底融化，加热融胶时，每2 m i nn n - - 次。 3 ) 将融化的胶溶液转移到套放于收集管内的u n i q - i 0 柱中，室温放置2 r a i n ， 8 0 0 r p m 离心l m i n 。 4 ) 取下u n i q 一1 0 柱，倒掉收集管中的废液，将u n i q 1 0 柱放入同一个收集 管中，加入5 0 0 p lw a s hs o l u t i o n ，8 0 0 r p m 室温离心l m i n 。 5 ) 重复步骤4 一次。 6 )取下u y l q 一1 0 柱，倒掉收集管中的废液，将u n i q ，1 0 柱放八同一个收集 1 n y 2 j l ， 1 c c l 1 口 吣 出 血 4 3 3 l 5 龚熹 真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析南昌大学硕士学位论文2 0 0 6 管中，1 2 0 0 0 r p m 室温离心1 5 s e c 。 7 ) 将u n i q 一1 0 柱放入一根新的1 0 5 m l 离心管中，在柱子膜中央加3 0 u 1e 1 u t i o n b u f f e r 或水( p h 7 o ) ，室温或3 7 。c 放置2 m i n 。 8 ) 1 2 0 0 0 r p m 室温离一t 3l m i n ，离心管中的液体即为回收的d n a 片段，可立即 使用或保存于一2 0 备用。 1 0 构建重组体 i ) 在微量离心管中制备下述连接反应液，全量为1 0 1 t l 。 试剂 用量 p m d l 8 - tv e c t o rd n a 纯化的p c r 产物 d h 2 0 s o l u t i o ni 1 1 1 1 ( 5 0 n g ) 1 l l l 3 u 1 5 u l 2 ) 1 6 。c 反应3 0 r a i n 。如果连接效率偏底，可适当延长连接时间至数小时。 1 1 ，制备冰冻的感受态细胞 1 1 1 主要试剂： 1 ) 溶液i ： 醋酸钾0 ，7 3 6 9 终浓度为3 0 r a m 氯化铷3 0 2 3 9 终浓度为1 0 0 r a m 氯化钙o 2 7 7 9 终浓度为1 0 m m 氯化锰2 4 7 4 9 终浓度为5 0 r a m 水1 0 0 m l 甘油 3 7 5 m l终浓度为1 5 ( v v ) 用0 2 m 的醋酸调p h 至5 8 ，定容至2 5 0 m l ，过滤灭菌。 2 ) 溶液i i m o p s o 2 0 9 9 终浓度为10 r a m 氯化钙o 8 3 2g终浓度为7 5 m m 氯化铷o 1 2 1 9终浓度为1 0 m m 水5 0 m l 甘油 1 5 r n l终浓度为1 5 ( v v ) 3 1 龚嘉真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析 南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 用k o h 调p h 6 5 ，定容至1 0 0 m l ，过滤灭菌。 1 1 2 主要步骤： 1 ) 在2 y t 平板培养基上划线接种大肠杆菌t g l 细胞，3 7 倒置培养过夜。 2 ) 挑单菌落至5 m l 培养液中，3 7 。c 振荡培养2 小时( 至o d 5 5 0 = 0 3 ) 3 ) 以1 2 0 接种量转入1 0 0 m l 预热至3 7 。c 液体培养基中，3 7 。c 振荡培养2 小时 4 ) 5 ) 6 ) 7 ) 8 ) ( o d 5 5 0 = 0 4 8 ) 。 在冰浴中冷却培养物，4 6 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，收集细胞。 将细胞悬浮于冰上预冷的l 3 体积溶液i 中( 原培养液体积即1 0 0 m l 的v 3 ) 。 将细胞置冰浴中1 5 m i n ，4 6 0 0 0 r p m 离心5 r a i n ，收集细胞。 将细胞重悬于1 1 2 5 体积( 原培养液体积即l o o m 的1 1 1 2 5 ) 的溶液i i 中，冰 浴放置1 5 m i n 。 将悬浮菌分装于预先冷却的e p p e n d o r f 管中，每管2 0 0 1 t l ，在液氮或干冰中 迅速冷却，7 0 。c 保存。 1 2 选择性培养基的制备 取1 0 0 m l2 x y t 固体培养基加热融化，待冷却至5 5 。c 时，加入氨苄青霉素使 终浓度为1 0 0 9 9 m l 。倾倒4 5 个平板，凝固后倒置于3 7 。c 培养箱烘至水滴蒸发 干净。每个平板涂8 0 0 t gi p t g 和8 0 0 9 9x g a i 。具体操作：取4 u li p t g ( 2 0 0 m g m i ) 和4 0 u l x g a l ( 2 0 m g m 1 ) ，加入等体积的灭菌3 d h 2 0 ，混匀。然后均匀涂布于平板， 正面向上放置3 4 小时以上方可使用。 1 3 用重组质粒转化细菌 1 ) 取3 个灭菌的1 5 m le p p e n d o r f 管，分别做好“转化”、“正对照”和“负对照” 标记，插入冰上。 2 ) 将含有连接产物的离心管瞬时离心，使连接产物集中到管底。 3 ) 将全部连接产物( 1 0 1 t 1 ) j l ：l “转化”管，向“正对照”管加入l n g 未切断的已知 质粒d n a ，向“负对照”管加入l g l1 x t e b u f f e r ( p h 8 o ) 。 4 ) 从一7 0 v 冰箱中取出冰冻的感受态细胞，将其放在冰浴中直至刚好融化( 约 需2 0 分钟) 。 轻弹试管混匀细胞。 5 )向步骤3 准备好的小离心管中分别小心地加入2 0 0 p 1 感受态细胞。 6 ) 轻弹离心管混匀溶液，将其在冰上放置2 0 m i n 3 2 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 7 ) 在4 2 水浴中热击9 0 s e c ( 不要摇动) 。 8 ) 立即将离心管放置冰上2 r a i n 。 9 ) 每个离心管中加入8 0 0j x l 温度为室温的2 x y t 培养基。 1 0 ) 于3 7 。c 约1 5 0 r p m 条件下培养i 5 小时。 1 1 ) 取4 个达到室温的2 x y t 氨苄青霉素i p t p x g a l 平板，用1 0 0 i t t l ( 或 2 0 0 9 1 ) 培养液涂板。转化组涂2 个平板，正负对照组各涂一个。也可将剩 余的8 0 0 9 l ( 或9 0 0 1 t 1 ) 培养液离心，然后用2 0 0 i - t 1 2 x y t 悬浮细胞，在涂板。 1 2 ) 将平板于3 7 倒置培养过夜。 1 4 克隆子的筛选( 菌落p c r ) 1 ) p c r 反应体系组成( 5 0 个反应) 2 ) 将上述反应液充分混匀，分装至5 0 个p c r 管，每管2 0 p l 。 3 ) 在超净工作台上用灭菌牙签挑取单菌落少许，先将牙签在2 y t 氨苄青 霉素i p t p x g a l 平板上轻轻划线用以保种，再在反应液中插2 3 下， 进行p c r 反应。 4 ) 菌落p c r 热循环参数同r t - p c r 参数 944min 9 4 。c3 0 s e c 5 2 。c 3 0 s e c 3 0 c y c l e s ，z s 。r n i j 7 2 5 m i n 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析 南昌大学硕士学位论文2 0 0 6 反应结束后，p c r 产物用2 琼脂糖凝胶电泳检查。该方法可检测质粒 中是否插入了外源片段及了解插入片段的大小，确定目的菌落。 1 5 目的菌落的液体培养 1 ) 在盛有3 m l 已灭菌的2 x y t 培养基的试管中加入3 9 l 浓度为1 0 0 “g 仉i 的 a m p ，混匀。 2 ) 接入1 经菌落p c r 筛选的阳性克隆单菌落，3 7 。c1 8 0 r p m 震荡培养1 6 1 8 小时。 1 6 重组体质粒的提取 采取上海生工u n i q 1 0 柱式质粒小量抽提试剂盒提取。 1 6 1 试剂盒组成 1 ) u n i q 一1 0c o l u m n 、2 - m lc o l l e c t i o nt u b e 、b o i l e dr n a s ea ( 1 0 m g m 1 ) 、 s o l u t i o ni 、s o l u t i o ni i 、s o l u t i o n l i i 、w a s hs o l u t i o n 、e l u t i o nb u f f e r 。 2 ) 首次使用是将b o i l e dt 州r a s ea 全部加入到s o l u t i o ni 中，充分混匀备用， 每次实验结束后放于4 保存，长期保存于2 0 。c 。首次使用前必须在w a s h s o l u t i o n 瓶中加入4 倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。，使用后应将瓶 盖拧紧，以保持w a s hs o l u t i o n 中的乙醇含量。e l u t i o nb u f f e r 为2 0 m m t r i s - h c l ，p h 8 o 8 5 ，实验后4 保存，t ep h 8 0 或者水( p h 7 0 ) 均可 以使用，但是d n a 的洗脱率通常要底2 0 左右。 1 6 2 操作步骤 1 ) 将培养物分两次倒入1 5 m le p p e n d o r f 微i 离心管中，1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 s e c ， 弃培养液。 2 ) 加入1 0 0 , 1 的s o l u t i o ni ，用枪头或震荡器充分悬浮细菌。 3 ) 加入2 0 0 9 l 的s o l u t i o n i i ，立即上下颠倒5 1 0 次，室温放置2 m i n 。 4 ) 加入3 5 0 1 a l 的s o l u t i o n i i i ，立即上下颠倒5 1 0 次，使之充分中和，室温 放置2 m i n 。 5 ) 1 2 0 0 0 r p m ，离心5 m i n 。 6 ) 将步骤5 中上清转移至套放于2 0 m l 收集管内的u n i q 一1 0 柱中，1 0 0 0 0 r p m 室温离心1 5 s e c 。 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 7 ) 弃收集管中的废液，将u n i q 一1 0 柱放入同一支收集管中，吸取5 0 0 p _ lw a s h s o l u t i o n 到t n , a q 一1 0 柱，1 0 0 0 0 r p m 室温离心3 0 s e c 。 8 ) 重复步骤7 。 9 ) 弃收集管中的废液，将u n i q 一1 0 柱放入同一支收集管中，1 0 0 0 0 r p m 室温 离心3 0 s e c 以彻底去处w a s hs o l u t i o n 。 1 0 ) 将u n i q 一1 0 柱放入新的洁净1 5 m l 离心管中，加入5 0 9 l e l u t i o nb u f f e r ，室 温放置2 m i n 后，1 0 0 0 0 r p m 室温离心l m i n ，离心管中的溶液即为所抽提的 质粒d n a 。 1 7 测序 1 ) 在p c r 管中配制以下测序反应液 试剂 用量 1 0 x b u t 士e r b i g d y e t mt e r m i n a t o rr rm i x m 9 2 + ( 2 5 m m ) p 4 7 p 4 8 引物( o 0 2 9 9 9 1 ) 质粒( 2 0 0 - 4 0 0 n g 9 1 ) m i l l i - q 超纯水 o 9 2 5 9 l 0 ，5 u 1 0 7 u l 0 5 u l 0 5 1 u l 至1 0 u 1 2 ) 9 6 。c1 分钟；而后9 5 。c1 0 秒，5 0 。c5 秒，6 0 。c4 分钟，循环2 9 次。 3 ) 加入5 0 9 l8 0 冰冷的无水乙醇，混匀。 4 ) 4 0 0 0 r p m 离心3 0 分钟，弃上清。 5 ) 沉淀于真空干燥仪干燥。 6 ) 加入1 0 9 lh i d if o r m a m i d e ，瞬时离心。 7 ) 样品于9 u c 变性2 分钟，置冰上冷却。 8 ) 将样品置于a b ip r i s m3 1 0 0 型全自动d n a 测序仪内，进行毛细管电泳 电泳6 小时后采集波形文件和序列文件两部分实验结果。 龚熹 真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 第三章结果与分析 第一节各真菌s n o r n a 基因簇的搜索与分析 1 真菌s n o r n a 基因簇的发现 根据b o x c d 类s n o r n a 在一级结构上相当保守的特点，利用各个s n o r n a 的保守的功能序列在不同生物基因组数据库中搜索功能同源的b o x c d 类 s n o r n a 是目前国际上比较通用的方法。本课题以真菌s n o r n a 基因簇i i 作为研 究对象，利用已知的酿酒酵母s n o r n a 基因簇对国际基因组数据库真菌数据库进 行b l a s t 检索。在本课题的实际操作中，由于s n r 5 5 位于的中间，很自然的我 们选取s n r 5 5 的功能序列c a t g c a t c a c c a 进行比对，从所获得的序列中搜索 b o x c ( t g a t g a ) 和b o x dc t g a ) ，确定s n r 5 5 。在s n r 5 5 被确定之后，在其上 下游搜索s n r 5 7 和s n r 6 1 ，从而确定整个基因簇。 目前，对真菌的测序工作正在大规模的进行当中，4 4 个物种的5 0 个菌株的 测序结果放于国际基因组数据库中，其中1 1 个已经完成全基因组的染色体的组 装工作，通过上述方法对这些累积数据进行分析，除在s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 、 e r e m o t h e c i u mg o s s y p i i 和s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e 中的这三个s n o r n a 已经公 布外，在其它3 4 个物种中也发现了s n r 5 5 的存在，3 0 个是以簇的形式存在的， 其中1 2 个是与s n r 5 7 和s n r 6 1 紧密连锁排列在一起的，而1 8 个只与s n r 6 1 紧 密连锁排列在一起。我们分别将它们命名为：k l u y v e r o m y c e si a c t i ss n o r n a 基因 簇i i 、k t u y v e r o m y c e sw a l t i is n o r n a 基因簇i i 、s a c c h a r o m y c e sk l u y v e r is n o r n a 基因簇i i 、s a c c h a r o m y c e sk u d r i a v z e v i is n o r n a 基因簇i i 、s a c c h a r o m y c e sb a y a n u s s n o r n a 基因簇i i 、s a c c h a r o m y c e sp a r a d o x u ss n o r n a 基因簇i i 、c l a v i s p o r a l u s i t a n i a es n o r n a 基因簇i i 、s a c c h a r o m y c e sc a s t e l l i is n o r n a 基因簇i i 、 勋c c h d r o m y c e 5m i k a t a es n o r n a 基因簇i i 、c a n d i d ag l a b r a t as n o r n a 基因簇i i 、 y a r r o w i al i p o l y l i c as n o r n a 基因簇i i 、d e b a r y o m y c e sh a n s e n i is n o r n a 基因簇i i 、 n e u r o s p o r ac r a s s as n o r n a 基因簇i i 、c h a e t o m i u mg l o b o s u m s n o r n a 基因簇i i 、 姒聊? a p o r t h eg r i s e a s n o r n a 基因簇i i 、g i b b e r e l l az e a es n o r n a 基因簇i i 、 c o c c i d i o i d e si m m i t i ss n o r n a 基因簇i i 、a s p e r g i l l u st e r r e u ss n o r n a 基因簇i i 、 a s p e r g i l t u s f l a v u s s n o r n an n n - i i 、f i c h i ag u i l l i e r m o n d i is n o r n a 基因簇i i 、 3 6 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇1 1 的鉴定与表达分析 南昌大学哩堂垡堡塞! ! 塑 r h i z o p u so r y z a es n o r n a 基因簇i i 、a s p e r g i l l u sf u m i g a t u ss n o r n a 基因簇i i 、 g i b b p r e l l am o ”i l i f o r m i ss n o r n a 基因簇i i 、s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m s n o r n a 基因 簇i i 、b o t r y o t i n i a f u c k e l i a n as n o r n a 基因簇i i 、n e o s a r t o r y a f i s c h e r is n o r n a 基 因簇i i 、a s p e r g i l l u sc l a v a t u ss n o r n a 基因簇i i 、a s p e r g i l l u s n i d u l a n ss n o r n a 基 因簇i i 、t r i c h o d e r m ar e e s e is n o r n a 基因簇i i 、u n c i n o c a r p u sr e e s i is n o r n a 基因 簇i i 。 2 各真菌s n o r n a 基因簇的结构与基因组织分析 采用在线分析软件： h t t p ：w w w f r u i t f l y o r g s e q _ t o o l s p r o m o t e r h t m l h t t p ：w v 州f r u i t f l y , o r g s e q _ t o o l s s p l i c e h t m l 对上述3 0 个s n o r n a 基因簇的启动子和剪接位点进行分析，发现它们的的结构 和基因组织不尽相同，具体情况如下： 2 1 多顺反子s n o r n a 基因簇 酿酒酵母所有的五个s n o r n a 基因簇都是由上游启动子引发的多顺反子的 s n o r n a 基因簇。通过分析，在所有新搜索到的3 0 个s n o r n a 基因簇i i 中，有 1 0 个也同样是由上游启动子引发的多顺反子s n o r n a 基因簇，它们在簇i i 中的 排列顺序与酿酒酵母中该簇的排列相同，s n r 5 5 位于中间，其5 侧翼是s n r 5 7 ， 3 ，侧翼是s n r 6 1 ，两两s n o k n a 基因的间隔不超过2 0 0 b p ，在s n r 5 7 的上游至 多7 0 0 b p 处存在着引发该基因簇转录的启动子。 3 7 龚熹真菌新s n o r n a 基因簇i i 的鉴定与表达分析 南昌大学硕士学位论文 2 0 0 6 2 1 1 肌u y v e r o m y c e sl a c t i ss n o r n a 基因簇 在国际基因组数据库中，i ( 1 a c t i s 的基因组数据是来自对菌株i c l a c t i sn r r l y - 1 1 4 0 的测定，对它的各染色体装配工作已经完成。i ( 1 a c t i ss n o r n a 基因簇i i 由s n r 5 7 、s n r 5 5 、s n r 6 1 三个s n o r n a 紧密串联在一起，其中s n r 5 7 与s n r 5 5 之间间隔为1 8 2 n t 而s n r 5 5 与s n r 6 1 之间的间隔仅为1 6 9 n t 。位于染色体b ( n c0 0 6 0 3 8 ) 上的两个转录方向相反的基因的间隔区，其中在其上游是一个 2 5 s 核糖体蛋白。使用启动子和剪接位点的在线分析软件，只在s n r 5 7 上游2 9 4 n t 处找到一t a t a 盒，起始转录点为位于上游2 6 6 n t 的g 。在各个s n o r n a 的间隔 区未发现明显有效的启动子和成对的剪接位点，因此该s n o r n a 基因簇是一个由 s n r 5 7 上游的启动子引发的多顺反子s n o r n a 基因