（分析化学专业论文）纳米粒子与生物大分子相互作用的研究及其分析应用.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 核酸与蛋白质是构成机体的两种重要的生物大分子。核酸是生物的基本遗传 物质，与生物的生长，发育以及癌变，突变等活动相关。蛋白质则肩负着各种生 理上的功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直接表达 者。因此研究核酸和蛋白质与小分子相互作用，建立高灵敏度、低检测限的核酸 和蛋白质的定量测定方法，在新型的药物设计、抗癌药物的药理和毒性的研究， 以及临床检测等方面具有重要意义，是当前生物分析化学研究的前沿和热点之 一 本论文从寻找新的核酸和蛋白质探针，以建立灵敏的定量检测的方法出发， 以荧光和共振光散射技术为主要研究手段，同时应用吸收光谱技术，圆二色光谱 技术，荧光寿命、透射电子显微技术等手段进行了机理研究和探讨。本文共四部 分。 论文的第一部分综述了纳米粒子作为光谱探针在核酸和蛋白质等生物大分 子分析中的研究进展及分析应用。 在论文的第二部分，研究了桑色素、l - c y s - n z n s 和核酸的相互作用。研究 表明：l - c y s - n z n s 与桑色素作用，使桑色素的荧光强度有所降低，而核酸( f s d n a 和y r n a ) 的加入，可使得体系的荧光强度显著增强，且增强程度大大超过桑色 素核酸体系的荧光增强作用，体系的荧光的增强程度与核酸的浓度在一定范围 内具有良好的线性关系，据此建立了测定核酸的新方法。蠡d n a 和y r n a 的线 性范围分别为：7 0 x 1 0 8 - 1 0 x 1 0 。5gm l 1 ，和9 0 x 1 0 g - 5 0 x 1 0 击g1 1 1 l 一，检出限分别 为2 0 x 1 0 8gm l 1 和4 0 x 1 0 8gm l 1 ，并成功应用于合成样品中f s d n a 的定量测 定。m o r i n - l - c y s - n z n s 与f s d n a 的相互作用机理研究表明：m o r i n - l c y s - n z n s 与蠡d n a 之间主要为沟槽与静电作用，并形成三元复合物，体系微粘度的增大， 荧光寿命增长，荧光强度大大增强。 在论文的第三部分研究了稀土离子( 铕) 、l c y s n z n s 和蛋白质的共振 光散射增强现象。研究发现，蛋白质的加入可以使l - c y s - n z n s e u 3 + 体系的共振 光散射强度大大增强由此建立了一种测定蛋白质的简单、灵敏的共振光散射法。 在最佳实验条件下建立了蛋白质浓度与增强的共振光散射强度之间的线性关 山东大学硕士学位论文 系。b s a 和e a 线性范围分别为：8 0 x l f i g - 1 4 x 1 0 。5gm l 1 和8 0 x 1 0 - s 1 2 x 1 0 。5g m l 一，检出限分别为3 1 x 1 0 。8gm l 。1 和1 7 x 1 0 8gm l 。机理研究表明，e u 3 + 与 l c y s - n z n s 的加入使b s a 骨架结构周围环境的极性发生了变化，导致b s a 构 象发生改变，并形成了较大的聚集体，使体系的共振光散射强度增强。 在论文的第四部分，研究了纳米银与懈皮素协同增效作用，建立了核酸测定 新方法，并讨论了相互作用机理。在最佳实验条件下，槔皮素纳米银核酸体系 荧光强度的增强程度与核酸的浓度在一定范围内呈良好的线性关系，f s d n a ， s m d n a 和y r n a 的线性范围分别是：8 。0 1 0 一2 ，0 x 1 0 击gm l ，5 0 x 1 0 s - 5 0 x 1 0 6 g m l 1 和2 0 x 1 0 g 8 0 1 0 6 9 m l 一，检出限分别达到4 2 x 1 0 9 9 m l 一，1 2 x 1 0 8 9 m l 1 和6 6 x 1 0 9gm l 。该方法具有稳定性好，操作简单和灵敏度高等特点。机理研 究表明：纳米银榴皮素与核酸之间以沟槽式和静电作用相结合，导致纳米银的 自组装，形成柳叶片状的纳米晶。 本论文的主要特点： l 、研究发现，l - - c y s - n z n s 的加入可进一步增强桑色素一核酸的荧光强度， 从而建立了测定核酸的荧光新方法，该方法具有灵敏度高，稳定性好，抗光漂白 性增强等优点。 2 、研究发现，蛋白质的加入可以使l - c y s - n z n s e u 3 + 体系的共振光散射强 度大大增强，由此建立了一种测定蛋白质的简单、灵敏的共振光散射法。 3 、研究发现，纳米银的加入可进一步增强懈皮素核酸的荧光强度，从而建 立了测定核酸的荧光新方法，该方法具有稳定性好，灵敏度高等特点。 关键词：纳米硫化锌粒子：银纳米粒子：核酸蛋白质；桑色素；懈皮素：稀 土铕离子；荧光；共振光散射 i l i 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t n u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n sa r ei m p o r t a n tb i o l o g ym a c r o m o l e c u l e s n u c l e i ca c i d s a r et h eb a s i cg e n e t i cm a t e r i a lo fl i f e ，t h e yp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h ea c t i o no f g r o w t h , u p g r o w t h , a n dr e p r o d u c t i o no fo r g a n i s m t h e r ea r ec o n n e c t i o nb e t w e e n n u c l e i ca c i d sc o n f i g u r a t i o na n di t sf u n c t i o n ，w h i c hi sr e l a t i o nt o c a r c i n o g e n i ca n d a n t i c a n c e ra c t i v i t y p r o t e i n sa r ea b u n d a n ti no r g a n i s ma n da r ei n d e e df u n d a m e n t a lt o l i f e ，a n dt h e ya l m o s ta t t a c ht h e m s e l v e st oa l ll i f ea c t i o n ，t h em o r ec o m p l e xo f o r g a n i s ms t r u c t u r e ，t h em o r ev a r i o u sk i n d sa n df u n c t i o n so fp r o t e i n s s oi ti so f s p e c i a lv a l u et os t u d yt h ei n t e r a c t i o no fs m a l lm o l e c u l e sa n db i o m o l e c u l e s ，t h e q u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fn u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n sw i t hh i 出s e n s i t i v i t ya n dl o w d e t e c t i o nl i m i ta l ei m p o r t a n ti nl i f es c i e n c e ，b i o c h e m i c a lm e d i c a m e n t , f o o da n a l y s i s a n dc l i n i c a la n a l y s i s ，w h i c hi sh e l p f u lt od e s i g nt h en e w t y p eo fd r u ga n ds t u d yt h e t o x i c i t yo fd r u g t h i sp r o j e c ti st h ef o r w a r dp o s i t i o na n dh o tp o i n ti nb i o c h e m i c a la n d b i o p h y s i c a lr e s e a r c h e s t h i st h e s i sf o c u so nt h ed e v e l o p m e n to fn e wp r o b e sf o rn u c l e i ca c i d sa n d p r o t e i n sa n dt oe s t a b l i s hs e n s i t i v em e t h o d sf o rt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no ft h e m ， u s i n gt h ef l u o r e s c e n c ea n dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) 觞t h ep r i m a r yt e c h n i q u e t h eu v - v i s i b l e s p e c t r o m e t r y , c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c o ) ，f l u o r e s c e n c el i f e t i m e ， t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) t e c h n i q u e sa l ea l s ou s e dt os t u d yt h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s m 1 1 1 em a i nc o n c l u s i o n sa l el i s t e da sf o l l o w s ： mt h ef i r s ts e c t i o n , w es u m m a r i z et h ep r o g r e s so fn a n o p a r t i c l e sa sl u m i n e s c e n t p r o b e sf o rn u c l e i ca c i da n dp r o t e i na n dt h ea n a l y t i c a la p p l i c a t i o n si nb i o a n a l y s i s i f lt h es e c o n ds e c t i o n ，l - c y s - n z n sa r ep r e p a r e da n dt h e ya l eu t i l i z e di nt h e s t u d yo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm o r i n ，l - c y s n z n sa n dn u c l e i ca c i d s f r o mt h e r e s e a r c h ，w ef i n dt h a tw h e nl c y s - n z n si sa d d e dt om o r i n ，t h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c e o fm o r i ni sq u e n c h e d ，h o w e v e r , t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fm o r i n l c y s - n z n si s g r e a t l ye n h a n c e dw h e nf s d n ao ry r n a a r ea d d e dt ot h es y s t e m b a s e do nt h i s ，an e w f l u o r i m e t r i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d si s p r o p o s e d u n d e r 山东大学硕士学位论文 o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e e n h a n c e df l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yi sp r o p o r t i o nt ot h e c o n c e n t r a t i o no fn u c l e i ca c i d si nt h er a n g eo f7 0 10 - 8 1 0 10 5gm l 。1f o rf i s hs p e r m d n a ( f s d n a ) a n d9 0 x10 s - 5 0 xl0 石gm l f o r y e a s tr n a ( y r n a ) ，t h e i rd e t e c t i o n l i m i t s ( s i n = = 3 ) a r e2 0 x 1 0 8gm l 1 ，4 0 x1 0 。8gm l 。1 ，r e s p e c t i v e l y t h ei n t e r a c t i o n m e c h a n i s m sa r es t u d i e dt h r o u g hm a n yt e c h n i q u e s ，i ti sc o n s i d e r e dt h a tt h e r ee x i s t s s y n e r g i s t i c e f f e c t so fg r o o v e b i n d i n g a n de l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e n m o r i n - l - c y s - n z n s a n d n u c l e i c a c i d ， a n dt h e c o m p l e x o f m o r i n - l - c y s - n z n s - n u c l e i ca c i di sf o r m e d l c y s - n z n sa n dn u c l e i ca c i dc o u l d p r o v i d eal a r g ev i s c o s i t ye n v i r o n m e n tf o rm o r i na n di t sf l u o r e s c e n c el i f e t i m ei s p r o l o n g e d ，l e a d i n g t oal a r g ee n h a n c e m e n to ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o ft h e m o r i n - l - c y s - n z n s - n u c l e i ca c i ds y s t e m i nt h et l l i r ds e c t i o n , t h er e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) e n h a n c e m e n te f f e c to f e u 3 + l c y s - n z n s p r o t e i n si ss t u d i e d i ti sf o u n dt h a tp r o t e i n sc a ne n h a n c et h er l s i n t e n s i t y o fe u 3 + l c y s - n z n s ，u n d e r o p t i m u mc o n d i t i o m ，t h e r e a r el i n e a r r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h ee n h a n c i n ge x t e n to fr l sa n dt h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n s i nt h er a n g eo f8 0 x 1 0 s - 1 4 1 0 5gm l 。1f o rb s a , 8 0 x 1 0 - 8 1 2 x 1 0 5gm l if o re a t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) o f b s aa n de aa r e3 1x l o 8gm l 1a n d1 7 x l o 。8gm l ， r e s p e c t i v e l y t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mi n v e s t i g a t i o ni n d i c a t e st h a ta f t e ra d d i n ge u 3 + a n dl c y s - n z n st ot h ep r o t e i n s ，s u r r o u n d i n ge n v i r o n m e n ti np o l a r i t yi sc h a n g e d ， r e s u l t i n gp r o t e i n sc o n f o r m a t i o nh a sc h a n g e d ，a n df o r m e dal a r g e ra g g r e g a t e s ，s ot h a t t h es y s t e mr l si n t e n s i t yi se n h a n c e d i i lt h ef o u r t hs e c t i o n ，i ti sf o u n dt h a ta gn a n o p a r t i c l e s ( n a n o a g ) c a r f u r t h e r e n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fq u e r c e t i n ( q u ) 一n u c l e i ca c i d ss y s t e m u n d e r o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e e n h a n c e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi s p r o p o r t i o n t ot h e c o n c e n t r a t i o no fn u c l c i ca c i d si nt h er a n g eo f8 0 x 1 0 9 - 2 0 x1 0 6gm l if o rf s d n a , 2 0 x 1 0 s - 8 0 x 1 0 巧gm l f o rs a l m o ns e r u md n a ( s m d n a ) a n d5 0 x 1 0 s - 5 0 x 1 0 g m l 。f o ry e a s tr n a ( y r n a ) 。t h ed e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) o ff s d n a ，s m d n aa n d y r n aa r e4 2 x 1 0 9gm l l ，1 2 x 1 0 。8gm l la n d6 6 x 1 0 。9gm l 。i ，r e s p e c t i v e l y s a m p l e sa r es a t i s f a c t o r i l yd e t e r m i n e d t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo ft h es y s t e mi s s t u d i e d u s i n gf l u o r e s c e n c e ，u v - v i s i b l ea b s o r p t i o n ( u v - v i s ) ，r e s o n a n c el i g h t v 山东大学硕士学位论文 s c a t t e r i n g ( r l s ) a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m ) t e c h n o l o g y , i n d i c a t i n g t h a tt h e r ee x i s t sc o o p e r a t i o no fg r o o v eb i n d i n ga n de l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb e t w e e n q u n a n o a ga n dn u c l e i ca c i d sa n dt h ec o m p l e x o fq u n a n o a g n u c l e i ca c i d si sf o r m e d t h ec h i e fc h a r a c t e r i s t i c so ft h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： 1 i ti sf o u n dt h a tl c y s - n z n sc a l lf u r t h e re n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f m o r i n n u c l e i ca c i d ss y s t e ma n dp r o v i d eas t a b l e ，s e n s i t i v ea n dh i g h l ys t a b l ea g a i n s t f l u o r e s c e n tp h o t o b l e a c h i n gf l u o r i m e t r i cm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d s t h e c o m p l e xo fm o r i n - l - c y s - n z n s - n u c l e i ca c i di sf o r m e d 2 i ti sf o u n dt h a tp r o t e i n sc a no b v i o u s l ye n h a n c et h er l si n t e n s i t yo fe u 3 + l - c y s - n z n s ，t h i sm e t h o di ss i m p l e ，s t a b l ea n dq u i c k 3 i ti sf o u n dt h a tn a n o a gc a nf u r t h e re n h a n c et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f q u n u c l e i ca c i d ss y s t e ma n dp r o v i d eas i m p l ea n ds e n s i t i v ef l u o r i m e t r i cm e t h o df o r t h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d s t h ec o m p l e xo fq u - n a n o a g - n u c l e i ca c i d sw a s f o r m e d k e y w o r d s ：l - c y s t e i n e n a n o z n s ；a gn a n o p a r t i c l e ；n u c l e i ca c i d s ；p r o t e i n ；m o r i n ； q u e r c e t i n ；e u 3 + ；f l u o r e s c e n c e ；r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g v i 山东大学硕士学位论文 符号说明 l c y s - n z n s ：l 半胱氨酸包覆硫化锌纳米粒子 m o r i n ：桑色素 n a n o a g ：银纳米粒子 q u e r c e t i n ：懈皮素 f s d n a ：鱼精子脱氧核糖核酸 s m d n a ：鲑鱼精子脱氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 b s a ：牛血清蛋白 e a ：鸡蛋清白蛋白 t e m ：透射电子显微镜 ( ：电动电势 c d ：圆二色光谱 a i r 加入样品后体系荧光强度的增强值 ( a i r = i f - i o ，i o 和i r 分别代表体系中核酸加入前后的荧光强度值) i 川r o ；加入样品后体系共振光散射光强度的比值 ( i r o 和i s 分别样品加入前后体系的共振光散射强度) 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：叁盘盘e t 期：盈辽姜! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：毽幺插师签名：萎藿日期：幽盘：， 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 核酸与蛋白质是构成机体的两种重要的生物大分子。核酸是生物的基本遗传 物质，与生物的生长，发育以及癌变，突变等异常活动相关。蛋白质则肩负着各 种生理上的功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直接 表达者。它们是生命科学与生物化学中最重要的两类生物大分子。因此研究机体 的分子结构与功能必须先深入了解这两类生物大分子，而探针技术是研究核酸和 蛋白质结构、功能以及定性和定量的重要手段。特别是核酸和蛋白质光谱探针的 研究已成为生命科学领域的前沿课题之一，其中荧光分析法和共振光散射技术由 于其方法简单、灵敏度高等优点已成为目前研究生物大分子的重要手段。 寻找新的核酸、蛋白质探针分子，以及研究它们与其它小分子或生物分子的 相互作用，对于研制新型药物以及临床诊断等都具有非常重要的意义。 第一节核酸荧光探针的研究进展 核酸分子携带有遗传信息，是生物物种延续、物种进化的决定因素。核酸主 要包括脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 和核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d , r n a ) 两大类，它的基本单位是核苷酸( n u c l c o t i d c ) 。d n a 主要集中在细胞核内， r n a 主要分布在细胞质中，所有生物细胞都含有这两类核酸，因此对它们的研 究已成为生物科学的重要内容之一。尤其是从生物分析化学的角度对核酸定性， 定量检测及其与探针小分子作用机理的研究引起了分析工作者的极大兴趣i 1 7 】。 核酸的定量测定方法的研究，将会对疾病诊断、新型抗癌药物的筛选等有重要的 意义 8 ，9 。而核酸与探针小分子的作用方式主要有三种类型【5 】：插入式，沟槽 式和静电式核酸与探针小分子相互作用后，会引起探针小分子的性质变化，根据 这些变化可以判断它们之间的作用方式。核酸定量分析的方法有很多，如色谱法、 显微光度法、免疫分析法、化学发光法、光度分析法、荧光分析法、共振光散射 分析法以及电化学分析法等。由于荧光分析法方法简单、灵敏度较高，将其应用 于核酸的定量、结构及作用机理等方面的研究，是目前研究的前沿和热点之一 1 0 - 1 7 。本部分将主要介绍核酸的荧光探针的研究现状及发展趋势。由于核酸 的内源荧光很弱，直接用其天然荧光来研究核酸受到限制 1 8 ，1 9 ，因此人们一 山东大学硕士学位论文 直在探索利用一些荧光探针来研究核酸。根据发光机理及发光类型的不同，核酸 的荧光探针可分为：有机染料探针、金属离子及其配合物探针和光化学探针等。， 有机染料作为核酸荧光探针研究最早，发展最快。有机染料核酸荧光探针主 要有：菲啶染料 2 0 ，2 1 、吩噻嗪类染料【2 2 、花菁染料 2 3 、二苯并咪唑染料 2 4 、4 ，6 - - - 脒基- 2 - 苯基吲哚 2 5 等：这些物质大多有剧毒，易产生诱变，与 d n a 发生不可逆结合。因此，寻找低毒、灵敏的核酸荧光染料探针越来越受到 重视。药物也是常用的有机染料探针。如可用于防治口角炎等炎症的维生素类药 品核黄素 2 6 ，可治疗皮肤病和癌症的光疗药物竹红菌素h a 2 7 ，优先识别含 a t 碱基d n a 片段的博来霉素 2 8 以及外用杀菌剂、防腐剂利凡诺( r v n ) 2 9 、 还有小檗碱 3 0 和葸环类抗癌新药吡柔比星( t h p ) 3 1 等等。 金属离子配合物作为核酸荧光探针的研究大概分为三类：稀土离子配合物 3 2 - 3 8 、过渡金属及贵金属离子配合物 3 9 - 5 0 和其它金属配合物【5 1 5 4 】。光化 学荧光分析是一种建立在光化学反应基础上的荧光分析技术，是基于物质吸收了 紫外一可见辐射而引起诸如光加成、光分解、光氧化还原及光异构等光化学反应， 导致物质的结构或性质发生了某些变化，形成荧光发射功能团，发射强的荧光， 而核酸能使其荧光强度发生变化。借此可用于核酸的测定。维生素k 3 5 5 和 9 。1 0 - 葸醌一2 一磺酸钠( a q s ) 5 6 都可用于核酸的定量分析，检出限可达r i gm l 。 第二节蛋白质光谱探针的研究进展 蛋白质是生命活动的物质基础，是生物体的基本组成成份之一，在人体代谢 中扮演极为重要的角色，人类的绝大多数疾病都是由蛋白质异常引起的【5 7 - 5 9 。 蛋白质分析是生命科学中的重要课题。蛋白质的定量分析在生命科学、生化药物、 食品分析及临床检验中都有着重要作用。 2 1 蛋白质的荧光探针 由于蛋白质中存在着色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的残基因此它能够吸收 2 7 0 3 0 0n m 的紫外光并发射紫外荧光。但其内源荧光的灵敏度很难满足痕量分 析的要求，需要通过外源荧光探针的光谱性质的研究获得更多关于蛋白质分子的 各种信息。常用的蛋白质发光探针有：有机染料，荧光衍生化试剂，稀土离子及 2 山东大学硕士学位论文 其配合物荧光探针，近红外荧光探针，化学发光探针等。 蛋白质与一些染料分子通过非共价键相结合，能引起染料分子的荧光增强或 猝灭，且在一定范围内与蛋白质的浓度成正比，可定量测定蛋白质 6 0 - 8 7 。 稀土离子和稀土离子配合物探针也可用作蛋白质的荧光探针。某些稀土离子 本身具有发光的特性，且荧光强度高，谱带窄，寿命长，特征性强等，因而可以 作为荧光探针研究生物大分子的性质。其中，铕( i i i ) 和铽( i i i ) 是研究蛋白质的 有效探针。稀土离子配合物探针中配体的选择尤为重要。这些配体通常含有高能 量的芳香环，如邻二氮杂菲衍生物、黄酮类、水杨酸衍生物以及b 一双酮类等。 引入衍生化荧光试剂标记蛋白，可以使不产生内源荧光的蛋白质问接发光。 蛋白质分子一般具有两个可供衍生化的功能基团：氨基和羧基。其中由于羧基位 于c 端活性较低，因此很少用作为衍生化基团。相反，位于n 端的氨基活性高 而易于衍生化。但蛋白质的三级结构使一些试剂与n 一端的反应变得困难，所以， 只有蛋白质中的伯胺和仲胺部位可以较容易地进行衍生化反应。o 邻苯二甲醛 ( o p a ) 是最常见的只与伯胺基团发生反应的衍生化试剂 8 8 9 1 1 ，4 似，n 二甲 基胺基一磺酰基) 一7 - 氟2 ，l ，3 一苯并二唑( 4 ( n n d i m e t h y l a m i n o - s u l f o n y l ) 7 一f l u o r o - 2 ， l ，3 - b e n z o x a d i a z o l e ，d b d f ) 只与蛋白质中的仲胺基，特别是位于n 端的脯氨酸 残基发生反应【9 2 】，芴甲氧羰酰氯( f m o c c 1 ) 很容易与蛋白质的伯胺和仲胺，以 及n 乳酰苯胺反应生成具有强荧光的氨基酸酯类化合物 9 3 9 s ，与其相似的衍 生化试剂还有p e o c 9 9 和a e o c 1 0 0 】等等。 近红外荧光探针的发射波长在7 0 0 1 2 0 0a m ，在该范围内生物分子自身荧光 较弱，可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度。因此，近红外荧光特别适合于 生物样品的测定。这类染料主要包括花菁类 1 0 1 ，1 0 2 ，方酸菁类 1 0 3 l o s ，酞 菁 1 0 6 1 0 8 】，噻嗪类和嗯嗪类等 1 0 9 1 1l 】。 2 2 蛋白质的共振光散射探针 在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发和发射通带宽度，以k ，【- 沁m 同 步扫描，即得共振光散射光谱【11 2 。与分光光度法、荧光光度法在蛋白质等生 物大分子领域的应用相比，光散射技术是近几年发展起来的研究小分子物质与蛋 白质等发生作用，从而进行生物大分子的定量测定的灵敏探测技术。蛋白质的共 振光散射探针主要集中于：染料分子【1 1 3 1 1 5 】，表面活性剂【1 1 6 1 2 0 1 ，卟啉类 山东大学硕士学位论文 【1 2 1 1 ，纳米粒- 子1 1 2 2 ，染料分子与金属离子的复合物 1 2 3 1 2 5 ，高分子聚合物 【1 2 6 1 2 9 1 等等。 第三节纳米粒子在生物分析中的应用 纳米粒子通常是指粒径大小在1 1 0 0m i l l 范围内的微粒子，又叫超微粒子， 其尺度介于原子、分子与宏观物体之间，称为介观态，由于当物质的尺寸减小到 纳米范围时，具有表面效应，小尺寸效应，量子效应，宏观量子隧道效应等几种 特性，由此导致了纳米粒子的光、磁、电、热、力以及化学活性等性质与本体物 质有显著差# 1 3 0 1 3 2 ，因此在分析化学尤其是在生物分析上必将有重要的理论 研究价值和广阔的应用前景。 目前，用于生物分析的纳米颗粒主要有：贵金属纳米粒子，量子点，有机高 分子纳米粒子，壳聚糖纳米粒子和纳米生物复合探针等。要实现生物分析科学与 纳米技术的交叉结合存在着许多从原理到技术的上的重大问题，如生物分子与 纳米粒子的耦联作用就是要解决的重要问题之一。已报道的生物分子与纳米粒子 的耦联方式主要有两种方式：一种是利用生物分子本身的官能团或者衍生的官能 团在纳米粒子表面进行连接；另一种是把纳米粒子表面改性，衍生出能够方便连 接生物分子的官能团。下面将对几种主要应用于生物分析中的纳米粒子如何解决 与生物分子的耦联作用以及在生物分析中的应用做一个简单的综述。 1 贵金属纳米粒子 金属纳米粒子是指组分相在形态上被缩小至纳米程度( 5 1 0 0r i m ) 的金属颗 粒，这种新型纳米材料，其原子和电子结构不同于化学成分相同的金属粒子，并 具有优良的电学、磁学、光学、热学、催化等性能。随着科学技术的不断发展，金 属纳米粒子，尤其是贵金属纳米粒子( 如金和银) 的研究得到了广泛的关注。下面 重点介绍一下贵金属纳米粒子金和银在生物分析中的应用。 1 1 金纳米粒子 金纳米粒子是指金的微小颗粒，其直径为i - 1 0 0r l m 。一般为分散在水中的水 溶胶，故又称胶体金。金纳米粒子一般用氯金酸( h a u c l j i ) 通过化学还原法制 备。在还原剂的作用下，氯金酸水溶液中的金离子还原成金原子，并聚集成微小 4 山东大学硕士学位论文 的金核，在其表面吸附负离子( a u c l 2 ) 和部分正离子( h + ) 形成的吸附层，依 靠静电作用形成稳定的胶体溶液 1 3 3 。 h u 等 1 3 4 通过用生物良性的淀粉作为包裹剂，并用葡萄糖作为还原剂，最 后制得具有很好的生物相容性的六方和骨形的金纳米粒子，并发现其能诱发较高 的表面增强拉曼散射和化学发光信号，从而实现对痕量生物分子的检测。c h o i 等 1 3 5 利用巯基保护制得金纳米粒子，水溶性好，有较好的生物亲和性，不易 发生聚集，能稳定存在于干燥状态。 h e 等 1 3 6 采用水相硅烷化方法，将r 氨基丙基三乙氧基硅烷 h 2 n ( c h 2 ) 3 s i ( o c 2 h 5 ) 3 】( a p e s ) 组装在石英表面，在基底表面修饰上氨基为末端的单层膜， 并进一步在这种功能化的单层膜基底上组装金纳米粒子得到金纳米粒子a p e s 石英的纳米复合结构。以制备的金纳米粒子自组装膜修饰石英为基底及d l 半胱 胺酸为中介，利用桑色素( m o r i n ) 和d l 半胱胺酸的化学吸附作用，将桑色素间接 组装在金纳米粒子自组装膜修饰石英基底表面，所构建的桑色素修饰金纳米粒 子自组装膜对三苯基锡有灵敏的荧光识别作用。 金纳米粒子对蛋白质等生物大分子有很强的吸附作用，而这种吸附作用是物 理吸附，标记比较方便，几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后活性基本 不发生改变。在组织学上，用表面吸附有抗体分子的金纳米粒子( 1 0 4 0r i m ) 特异 性标记生物样品，可以对生物样品的不同区域进行标记、分析。c r u m b l i s 发现金 胶表面吸附的氧化还原酶的活性并没有丧失 1 3 7 。纳米金可以诱导b s a 的构象 发生变化 1 3 8 1 ，利用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色以及傅立叶变换红 外光谱等手段对此进行了研究，发现由于纳米金的诱导作用，b s a 的二级和三 级结构均发生了变化，并实验了在不同p h 值条件下纳米金对b s a 构象的影响， 结果表明，p h 值较高时纳米金对b s a 的荧光和圆二色光谱的影响会更大。 d n a 则可以诱导金纳米粒子自组装为金纳米线，a n d r e a 等 1 3 9 研究发现， 用4 ( 二甲氨基) 嘧啶( d m a p ) 修饰的纳米金表面带正电荷，它可以选择性识 别带负电的c t d n a ，并通过静电相互作用以c t d n a 为模板自组装为纳米线。还利 用透射电子显微镜、扫描电子显微镜，原子力显微镜等对金纳米线进行了表征， 结果表明，该纳米线大约有2 0n m 高，4 0r i m 宽，1 2 5 岬长：n a k a o 等 1 4 0 也对 基片上纳米金的自组装行为进行了研究，实验了两种不同的自组装方法，得到了 山东大学硕士学位论文 以伸展的d n a 为模板的项链状的金纳米粒子。 金纳米粒子还可以增强表面等离子体共振( s p r ) 强度，从而以此提高了实 时检测生物特异性反应的灵敏度 1 4 1 。胶体金对s p r 的增强作用首先在一个三明 治央心结构得到应用，金标记二级抗体与结合在传感器表面一级抗体上的抗原结 合，达到检测抗原的目的。据此，把用纳米金粒子标记的分子连接到固相支持物表 面后，在合适条件下把纳米金粒子溶解成金离子，通过检测离子金达到对微量蛋白 质检测信号进行放大的目的 1 4 2 】。 2 2 银纳米粒子 银纳米粒子因为具有独特的催化、抗菌、非线性光学及超高电导率等特性， 从而倍受人们的关注 1 4 3 ，并在生物分析检测、疾病诊断与治疗中发挥着重要 的作用，例如，组装的银纳米粒子作为表面增强拉曼散射的基体，可提高被检测 的生物分子的灵敏度 1 4 4 ；此外，银纳米粒子染色，也是一种灵敏度高、抗干 扰性强的蛋白质测量方法 1 4 5 。 目前有大量的研究集中于对银纳米材料制备方法的探索，如化学还原法、真 空沉积法、超临界法、电化学法、反微乳液法等，一般制备的银纳米粒子具有较 高的表面能，高表面能的银纳米粒子具有极高的反应活性，当它们表面没有被保 护或钝化时将会发生聚集，常用的表面钝化方法包括：利用功能化的硫醇有机物 进行保护 1 4 6 ：利用表面活性剂形成的微乳液进行封装处理 1 4 7 ；将纳米粒子 分散到聚合物基体中 1 4 8 ；或者可以选择地加入含有不同官能团的表面修饰剂， 表面修饰剂不仅通过链状聚合物大分子的空间位阻效应和静电效应影响纳米银 粒子的尺寸和分散性，而且在适当的条件下可