（生物化学与分子生物学专业论文）氯氰菊酯免疫毒性机制的初步研究.pdf

华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的 法律结果由本人承担。 论文作者签名：专g 毒彳 日期：厶哆年，月，；日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解华中师范大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师 范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：；o 毒千 日期：加7 年j ，月7 l 日 导师签名：侈乃导师签名：纱厂 日期：枷f 7 年厂月如日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论文 提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。 回意途塞埕变压进厦：旦：i 三生；旦= 生i 色二玺蕉查。 论文作者签名：；o 毒辛 i 胁印年r 月岫 导师签名：钐矽 日期：加7 年厂月加日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 拟除虫菊酯是有机磷、有机氯等化学合成杀虫剂的替代产品，目前被广泛使用。 而且大量被用于室内卫生杀虫，人类面临着拟除虫菊酯的暴露风险日益增大，因而 对其进行全面的安全性评价非常必要。以往的研究多集中在其神经毒性上，对其免 疫毒性关注较少。氯氰菊酯是拟除虫菊酯的代表，除了作杀虫用途以外还有其特点。 即在研究中，氯氰菊酯与免疫抑制药物环孢菌素a ( c s a ) 和他可莫司( f k 5 0 6 ) - - , 样， 可被用作钙调磷酸酶的特异性抑制剂。而钙调磷酸酶在免疫相关的多条信号通路激 活中发挥重要作用，因此选择氯氰菊酯作为研究对象，有可能较深入地揭示拟除虫 菊酯的免疫毒性机制。 因为鱼类是较低等的脊椎动物，在先天性免疫研究中有独特作用；而且鱼类较 其它动物对拟除虫菊酯更为敏感。而斑马鱼又是o e c d 标准化的评价外源化合物毒 性的实验动物，因此本研究中使用斑马鱼作为实验动物。 用氯氰菊酯对斑马鱼染毒，观察其急性毒性，确定氯氰菊酯半数致死浓度位于 1 0 “玑1 8b t g l 之间。使用相对定量r t p c r 方法研究氯氰菊酯9 6 h 染毒后，n f a t 信 号途径和w n t 信号途径上相关分子的转录相对水平。并使用g s k 3 8 的激酶活性阻断剂 u + 单独或与氯氰菊酯合并染毒，用同样方法研究其转录变化。 结果显示l i 2 c 0 3 溶于饲养水单独作用能抑制斑马鱼g s i 3 p 的转录，与l i + 作为 g s k 3 b 激酶活性高效抑制剂的结果一致。氯氰菊酯单独染毒后，r c a n l 和讲邛转录都 有上调。而l i 2 c 0 3 与氯氰菊酯合并染毒上调i z 邛转录的程度较二者单独作用高，在 一定程度显示加合效应。与预期不符的是，氯氰菊酯对协邛的转录上调。 因此氯氰菊酯的免疫调节效应可能不是通过其对c a n 的抑制发生的，而更可能 与氯氰菊酯造成的细胞c a 2 + 浓度升高相关。而且l i 2 c 0 3 直接对斑马鱼染毒，也能 产生与对培养细胞作用一致的g s k 3 b n 断作用。氯氰菊酯染毒也能显著诱导w n t l o b 的转录。以上结果提示，氯氰菊酯对斑马鱼的免疫毒性机制中，可能通过c a 2 + 和g s k 3 b 等关键成员，整合n f a t 幂n w n t 两种信号途径。 然而因为鱼类免疫相关蛋白的研究较少，大部分斑马鱼免疫相关蛋白和抗体还 未商品化；而且与高等脊椎动物的交叉反应性小，来源于常见实验动物的抗体和细 胞因子等不能在斑马鱼中使用，因而研究主要集中在转录水平。但是本研究仍然对 氯氰菊酯的免疫调节机制进行了初步研究：待条件成熟后有望对其进行深入研究。 关键词：氯氰菊酯；免疫调节；钙调磷酸酶 a b s t r a c t p y r e t h r o i dp e s t i c i d e s a r e w i d e l y u s e da ss u b s t i t u t e sf o r o r g n a o p h o s p h o r u s a n d o r g a n o c h l o r i n e ，e s p e c i a l l yf o rh o u s e h o l ds a n i t a t i o np u r p o s e s t h e r e f o r e ，h u m a nb e i n g s a r ec o n f r o n t e dw i t hi n c r e a s i n gp y r e t h r o i d se x p o s u r er i s ka n d ，t h e i rt o x i c i t ya s s e s s m e n ti s e s s e n t i a l h o w e v e r ，s t u d i e so np y r e t h r o i dp e s t i c i d e st o x i c i t yg e n e r a l l yf o c u s e do nt h e i r n e u r o l o g i c a le f f e c t sw h i c hu n d e r l i e dt h e i rm a j o rs y m p t o m s ；w h i l et h e i ri m m u n o l o g i c a l c o u n t e r p a r t sa r eu s u a l l yi g n o r e dt h u si n - d e p t hs t u d i e sa r em o r e n e e d e d c y p e r m e t h r i ni s ar e p r e s e n t a t i v eo ft h es y n t h e t i cp y r e t h r o i d s b e s i d e si t sp e s t i c i d a l a c t i v i t y ，c y p e r m e t h r i nh a sb e e ns o l da n du s e da ss p e c i f i ci n h i b i t o ro fc a l c i n e u r i n f o r d e c a d e sw i t hh u n d r e d so fp a p e r sa p p r o v i n gt h i se f f e c t c a l c i n e u r i nh a sb e e ni m p l i c a t e d i ns e v e r a l s i g n a l i n gp a t h w a y sc o r r e l a t i n g w i t hi m m u n es y s t e m ，t h u ss t u d i e so n i m m u n o l o g i c a le f f e c t so fc y p e r m e t h r i nm i g h ts h e dl i g h t o nt h em e c h a n i s m sf o ra l l p y r e t h r o i dp e s t i c i d e si m m u n o t o x i c i t y f i s hs p e c i e sa r el o w e rv e r t e b r a t e sa n da r es u g g e s t e dt op l a y i n gs p e c i a lr o l e si ni n n a t e i m m u n i t y ；m o r e o v e r , t h e ya r em o r es e n s i t i v et op y r e t h r o i dp e s t i c i d e st h a no t h e rm o d e l o r g a n i s m s z e b r a f i s h h a sb e e nr e c o m m e n d e db yo e c da sl a b o r a t o r ya n i m a lf o r e x o g e n o u sc o m p o u n d st o x i c i t ya s s e s s m e n t ，t h u su t i l i z e di nt h i ss t u d ya sw e l l c y p e r m e t h r i nh a db e e na p p l i e dt oz e b r a f i s ha n dt h el c 5 0 v a l u ew a sd e t e r m i n e db e t w e e n 1 0 l x g la n d1 8 1 x g l a f t e ra9 6 一h o u ri n t o x i c a t i o n ，r e l a t i v e - q u a n t i t i v er t - p c rm e t h o d w a se m p l o y e dt od e t e c tt h er e l a t i v et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l so ft h em o l e c u l e si n v o l v e di n n f a ts i g n a l i n ga n dw n ts i g n a l i n gp a t h w a y s t h es p e c i f i cg s k 3 bb l o c k i n ga g e n t l i 2 c 0 3w a sa l s ou s e da l o n eo ri nc o m b i n a t i o nw i t hc y p e r m e t h r i na n dt h es a m em e t h o d w a sp r a c t i c e d i tw a ss h o w nt h a tl i 2 c 0 3a l o n ei n h i b i t e dg s k 3 f lt r a n s c r i p t i o n ；c y p e r m e t h r i nu p r e g u l a t e d b o t hr c a n la n di l 1 p ；w h i l et h ei l 一1 多u p r e g u l a t i o ne x t e n tb yb o t hd r u g sw a sh i g h e rt h a n a n yo n ew o r k e ds e p a r a t e l y c o n t r a r yt oa n t i c i p a t i o n ，t h es u p p o s e dc a l c i n e u r i ns p e c i f i c i n h i b i t o r c y p e r m e t h r i ns h o u l dh a v eu p r e g u l a t e di l 一邛；t h u s i tw a si n f e r r e dt h a tt h i s p r o c e s sm i g h tb ec o r r e l a t e dw i t hc y t o p l a s m i ci n f l u x o fc a 2 + r a t h e rt h a n c a i c i n e u r i n i n h i b i t i o nb yc y p e r m e t h r i n i tw a sa l s op r e s e n t e di nt h i ss t u d yt h a tl i 2 c 0 3a c t so nw h o l e a c t i o n d u et ol i m i t e dr e s e a r c h ， m o s tc o m m o ni m m u n o l o g i c a lp r o t e i n sa n dt h e i ra n t i b o d i e s a r c c o m m e r c i a l l yu n a v a i l a b l ef 研z c b r 蚯s h r c s e a r c h e r s f u r t h e r m o r e ，a n t i b o d i e sf r o mo t h e r o r g a n i s m s c r o s sr e a c tp o o r l yw i t hc 0 r r e s p o n d i n ga n t i g e n s f r o mz e b r a f i s h n o n et h el e s s ， s o m ep r e l i m i n a r yr e s u l t so n t h em e c h 孤i s m s0 fc y p e r m e t h r i ni m m u n o t o x i c i t yh a v e b e e n a c h i e v e d ；a n df u r t h e rs t u d i e sa r e r e ；i g e n t sd e v e l o p e d i n d i c a t e di nt h e f u t u r ew i t hm o r ez e b r a f i s hs p e c i f i c k e yw 。r d s ：c y p e r m e t h r i n , i m m u n er e g u l a t i o n ；c a l c i n e u r i n c n a c n b c p m c r a c c s a 钙调磷酸酶催化亚基 钙调磷酸酶调节亚基 氯氰菊酯 c a 2 + 释放激活的钙通道 环孢菌素a c s p r c a n钙调磷酸酶抑制蛋白 c t l g s k 3 k l h k 娶鼹 n f a t l l l n h r n l s p n p p r e l n f k b r h r r o s s p s s 脯 s u m o t a d 细胞毒性t 淋巴细胞 糖元合成激酶3 钥孔戚血蓝素 活化t 细胞的核因子 与n f a t c 搭伴结合的核蛋白 n f a t 同源区 核定位信号 磷酸对硝基苯酚 r e l 转录因子家族 r e l 同源区 活性氧自由基 s p 重复基序 富含丝氨酸的区域 小泛素样修饰因子 转录激活区 c a l c i n e u f i nas u b u n i t c a l c i n e u r i nbs u b u n i t c y p e r m e t h r i n c a l c i u mr e l e a s ea c t i v a t e dc a l c i u m c h a n n e l c y c l o s p o r i na c a l c i p r e s s i n r e g u l a t o ro f c a l c i n e u r i n c y t o t o x i ctl y m p h o c y t e g l y c o g e ns y n t h e s i sk i n a s e3 k e y h o l el i m p e th e m o c y n i n n u c l e a rf a c t o r so fa c t i v a t e dtc e l l s n f a th o m o l o g o u sr e g i o n n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i t e s p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e r e l h o m o l o g o u sr e g i o n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s e r i n ep r o l i n er e p e a t s s e r i n er i c hr e g i o n s s m a l lu b i q u i t i n 1 i k em o d i f i e r t r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 目录 中文摘要。l 缩略词表 目录。 引言 i v 1 1 氯氰菊酯免疫毒性及检测1 1 1 1 氯氰菊酯毒性概述1 1 1 2 氯氰菊酯的免疫毒性研究概况2 1 1 3 免疫毒性的检测方法3 1 2 氯氰菊酯与钙调磷酸酶( c a n ) 介导的信号通路。6 1 2 1 钙调磷酸酶及其介导的信号通路6 1 2 2 钙调磷酸酶介导信号通路的调节9 1 2 3 氯氰菊酯对钙调磷酸酶的专一性抑制1 3 1 2 4c a n n f a t 信号通路与免疫：1 4 1 3c a n n f a t 信号途径与其它信号通路的交互作用( c r o s s t a l k ) 1 6 1 3 1n f a t 信号与其它信号途径交互作用的机制1 7 1 3 2n o t c h 信号通过下调r c a n l 以增强c a n n f a t 信号1 7 1 3 3w n t 信号与n f a t 信号的整合。1 8 1 4 氯氰菊酯免疫调节机制的假设及本研究的意义2 1 材料和方法2 2 2 1 实验材料2 2 2 1 1 实验动物2 2 2 1 2 化学试剂及配制2 2 2 1 3 实验仪器设备2 2 2 2 实验方法2 3 2 2 1 氯氰菊酯对斑马鱼染毒2 3 2 2 2 实验器材的处理2 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 2 3r n a 提取操作步骤2 3 2 2 4 总r n a 的定量和完整性检验2 4 2 2 5 引物设计合成与稀释分装2 4 2 2 6 二步法r t p c r 实验2 5 2 2 7p c r 产物的半定量检测2 5 2 2 8 使用l i 2 c 0 3 作用于斑马鱼2 6 2 2 9 氯氰菊酯和l i 2 c 0 3 共同作用于斑马鱼2 6 结果 3 1 氯氰菊酯实验浓度的确定2 7 3 2 总r n a 的提取2 7 3 3 氯氰菊酯对斑马鱼免疫组织中n f a t 信号通路相关分子转录的影响2 7 3 4 氯氰菊酯对斑马鱼免疫组织中w n t 信号通路相关分子转录的影响2 8 3 5l 1 2 c 0 3 对斑马鱼免疫组织g s r d b 转录水平的影响3 0 3 6 氯氰菊酯和l 1 2 c 0 3 共同作用对斑马鱼的影响3 1 结论与讨论：。 4 1 实验结果的解释及结论3 2 4 2 氯氰菊酯与f k 5 0 6 ，c s a 结构比较及可能的免疫抑制机制3 2 4 3 斑马鱼作为免疫学研究实验动物的特色及缺陷3 5 4 4 存在的问题及未来工作展望3 6 参考文献 3 7 在校期间发表的论文4 8 致谢 9 5 ) 为湖北沙隆达农药研究所生产。 丙酮、l i 2 c 0 3 、乙醇、异丙醇、氯仿等试剂为国产分析纯。 异丙醇、氯仿分别置于清洁棕色瓶： 7 5 乙醇：以灭菌d e p c 水稀释无水乙醇，置2 0 保存( 其中d e p c 水需先高 压) 酚氯仿异戊醇：按体积比2 5 ：2 4 ：1 混合平衡酚、氯仿和异戊醇，存放于棕 色瓶中4 保存； e d t a n a 2 、t r i s 为a m r e s c o 产品，制成l m o l lt r i s c l ( p h 8 ：0 5 m o l l e d t a ( p h 8 0 ) 贮液。 e b 为a m r e s c a ) 产品，制成1 0 m g m l 贮液，置棕色瓶中避光常温保存。 琼脂糖为m m l e s c o 产品，武汉凌飞科技有限公司分装。 5 x t b e 电泳缓冲液( 贮存液) ：t r i s5 4 9 ，硼酸2 7 5 9 ，0 5 me d t a2 0 m l ( p h 8 0 ) 溶解于1 0 0 0 m l 蒸溜水中；电泳时稀释1 0 倍，即为0 5 x t b e 工作液。 6 上样缓冲液：灭菌双蒸水中含o 2 5 溴酚蓝，0 2 5 - - 甲苯青f f ，3 0 甘油， 于4 保存。 d e p c 水：吸出l m l 放在1 0 0 0 m l 双蒸水中配成l q b o d e p c 水，放在1 0 0 0 m l 容 量瓶中静置4 小时备用。 t r n z o l 试剂、平衡酚、d e p c 、t a q 酶、d n t p 、d 2 0 0 0 核酸分子量标准为北京 天为时代公司产品。 m m l v 反转录酶及o l i g oe ( x ) 2 0 为t o y o b o 公司产品。 2 1 3 实验仪器设备 速离心机、台式冷冻离心机均为e p p e n d o r f 公司产；荧光可见分光光度计( u 1 8 0 0 型， 日本日立) ；p c r 仪，e p p e n d o f f 公司产；凝胶成像系统，产自美国；多功能电泳仪、 m i n i 电泳槽，北京市六一仪器厂；制冰机，日本三洋电器有限公司；电热恒温水浴 为国产。 2 2 实验方法 2 2 1 氯氰菊酯对斑马鱼染毒 野生型斑马鱼饲养在3 l 大烧杯中，随机分为等对数的5 个处理组和1 个对照 组( n = 8 ) ，工业级氯氰菊酯用丙酮溶解，依次稀释成1 g m l ，1 8 比g m l ，3 2 , u g m l ， 5 6 , u g m l ，l o 比g m l 的贮液。每组取2 m l 贮液均匀分散于2 l 去离子水中，即终浓 度分别为1 班，：8 , u g l ，3 2 # g l ，5 6 a g l ，1 0 比g l ；对照组以2 m e 丙酮代替。 2 2 2 实验器材的处理 塑料制品( 如枪头、e p 管等) 逐个浸泡于0 1 ( v v ) d e p c 水中过夜，尽量使塑料 制品的内表面与溶液接触，高压后烤干备用；或者将塑料器皿在0 5m n a o h 中浸 泡1 0 分钟，然后用水彻底清洗，再高压灭菌烤干备用。 玻璃器皿洗净后在1 5 0 c 烘烤4 小时以上。 电泳槽等可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3 h 2 0 2 室 温1 0 m i n ，然后用0 1 d e p c 水冲洗晾于。 2 2 3r n a 提取操作步骤 f 根据t i a n g e nd p 4 0 5 产品况明书改动) ( 1 ) 匀浆处理：取各组斑- s 鱼的头肾、肠等新鲜组织，每3 0 - 5 0m g 组织加1m l t r n z o l ，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过t r n z o l 体积的1 0 。 ( 2 1 将匀浆样品在1 5 3 0 。c 放置5 分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。 f 3 ) 4 1 0 ，0 0 0r p m 离心1 0 分钟，取上清溶液进行下一步操作a ( 4 ) 每使用1m lt r n z o l 加0 2m l 氯仿，盖好管盖，振荡1 5 秒或手动颠倒混 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 匀2 分钟，室温放置3 分钟。 ( 5 ) 4 1 0 ，0 0 0r p m 离心1 0 1 5 分钟，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层 和上层无色的水相，r n a 主要在水相中，把水相( 约6 0 0 _ f l l ) 转移到新管中。在 得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置2 0 3 0 分钟。 ( 6 ) 4 1 0 ，0 0 0r p m 离心1 0 分钟，去上清，保留在管侧和管底形成胶状沉淀。 ( 7 ) 加入1m l7 5 乙醇( d e p c 处理过后灭菌的水配制) 洗涤沉淀。每使用1m l t r n z o l 至少用1m l7 5 乙醇对沉淀进行洗涤。 ( 8 ) 4 c5 , 0 0 0r p m 离心3 分钟。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液 体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。 ( 9 ) 室温放置晾干( 不要晾的过干，r n a 完全干燥后会很难溶解，大约晾干2 3 分钟左右即可) ，根据实验需要，加入3 0 1 0 0 肛l 无r n a s e 水充分溶解后分成小分 保存于2 0 。 2 2 4 总r n a 的定量和完整性检验 取4 l 总r n a 溶液，用t e 稀释至2 m l ，空白管以t e 对照，置u 1 8 0 0 中分 别检测2 6 0 n m 和2 8 0 n m 处吸光度。计算o d 2 6 0 7 0 d 2 8 0 比值，计算总r n a 的浓度； 计算公式为： r n a 的浓度( u g m l ) = o d 2 6 0 值x 4 0 卫g m l 再取2 靴l 总r n a 样品与0 和l6 上样缓冲液混合，在1 5 琼脂糖凝胶上进 行非变性电泳。 2 2 5 引物设计合成与稀释分装 根据g e n b a n k 数据库中的参考序列，使用d n a m a n 6 软件，设计引物尽量跨 内含子，退火温度一致。引物序列送武汉博尔公司由上海生工合成。 各基因的引物如下表，b a c t i n l 作为内标记分子。 表2 1 实验中使用的引物序列、扩增长度及查询号 p r i m e r s s e q u e n c e sl e n g t h a c c 带 n f a t c lf o r w a r d 1 c c c a c l g c c l g c l c l l 7 1 5b pi n f a t c lr e v e r s e g t r g a c r l l a g c c t c c a l l t c c d q 5 3 0 4 3 5 r c a n lf o r w a r dc g c c t g t r 1 1 g c t c a g t 6 1 4b p ， 2 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 皇鼍皇皇曼葛i 。 i i 一一 ； ul l i l i 鼍皇曼曼鼍皇皇曼曼舅舅鼍量 r c a n lr e v e r s e g c a g t i t c c a c r l l b c g t i a b c 0 7 6 4 3 9 订邛f o r w a r d t c a l a u 岖a g c g t g a a g l g 4 5 5b p f 厶j 口r e v e r s et g c g g t g c t g ( i a aa c c a a y 3 4 0 9 5 9 w n t l o bf o r w a r dc g g 触昭a g g 亿c a 触g c t3 6 8b p w n h o br e v e r s ea r ( 】g a g c c a g t g c r r c c aa y l 8 2 1 7 1 c t n n b lf o r w a r da g 朋r i c r ( g c a i a c g g c a a 7 0 7b p c t n n b lr e v e r s e c a a t g t g a a g g a g g g t g g ab c 0 4 7 8 1 5 g s k 3 , af o r w a r d g t c a g c a g a g 氏a a g 岖g g c a4 4 6 | g s k 3 pr e v e r s e c c a a a g g a a r g g a t g l a g g c a j 2 2 3 5 0 2 b a c t i n lf o r w a r dc a a 弼a g c g i t r c c g t i i g 5 3 7b p b a c t i n ir e v e r s ea c c t c c c t r r g c c a g t r i n m l 3 1 0 3 1 2 2 6 二步法r t - p c r 实验 以o l i g od ( t ) 2 0 作为c d n a 的合成引物，在经d e p c 处理过的0 5 m l 小离心管 中加入轨l 总r n a 、2 0 p m o l 的o l i g od ( d 2 0 并用r n a 专用水补足至1 0 z l 。r n a 和引物混合液在7 0 保温1 0 m i n 后骤冷，以破坏r n a 内部二级结构。再在其中加 入5 x r t 缓冲液舡l 、d n t p 舡l 、m m l v1 l l ( i o o u ) 及r n a 专用水l g l ，总体积 2 0 弘t l 。按照m m l v 反转录酶说明书推荐的条件，在4 2 。c 孵育2 0m i n 后即得到c d n a 产物。 以第一步合成c d n a 为模版行p c r ，在5 0 9 l 反应体系里行两重p c r ，每个p c r 管里包括c d n a 犁l ，l o x t a qb u f f e r 靴l ，目标基因上下游引物各l o pm o l ，b a c t i n l 上下游引物各5 pt o o l ，d n t p 钆l ，t a q 酶2 5u 。每个样2 个重复。反应参数如下： 9 4 预变性2m i n 后；9 4 x 3 0 s 、5 5 x 3 0 s 、7 2 4 5 s ，3 0 个循环；最后7 2 延伸 5 m i n 。如果目的基因扩增较内参弱许多时，则可以将2 者引物分别置p c r 管中， 其余成分不变再行p c r 。 2 2 7p c r 产物的半定量检测 取1 5 9 琼脂糖和1 0 0 m l0 5 x t b e 电泳缓冲液，加热煮沸使琼脂糖充分熔化制胶， 冷却至不烫手时加入1 0 m g m l 溴化乙锭2 5 f 1 1 , 充分混匀，将温热的凝睃倒入已置 好梳子的胶膜中，在室温下放置3 0 4 5 m i n 待胶凝同。 变性电泳。调节电源恒压i o o v ，电泳3 0 分钟。 电泳完毕置凝胶成像分析系统下扫描灰度，并将内参照灰度值设定为1 ，保存 图像、记录目标基因的相对灰度值并进行数据分析。， 2 2 8 使用l i 2 c 0 3 作用于斑马鱼 称取7 4 9l i 2 c 0 3 充分溶解于1 l 去离子水中，配制成l o o m m 的1 - , i 2 c 0 3 贮液。 分别在2 l 饲养水中加入不同比例的l i 2 c 0 3 贮液，使其终浓度从l m m - l o m m 。斑 马鱼暴露9 6 小时后，同样以相对定量r t - p c r 检测g s k 3 f l 的转录变化。 2 2 9 氯氰菊酯和l i 2 c 0 3 共同作用于斑马鱼 在各浓度组氯氰菊酯的饲养水中均添加l i 2 c 0 3 贮液，使l i 2 c 0 3 的终浓度为1 8 m m ，染毒9 6 小时后，同样以相对定量r 卫p c r 再检测在氯氰菊酯单独作用时变化敏 感的r c 口n j 和f z 邛的转录水平变化。 2 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 3 1 氯氰菊酯实验浓度的确定 挂里 0 口木 预实验中应用l o p g l - - l o o 比g l 等对数浓度梯度对斑马鱼急性染毒，发现其半数 致死浓度位于l 毗g 】卜1 s g l 之间。因此正式实验中使用等对数不同浓度( 珈g 几 1 耻g 化3 弘g 儿5 酗g l 和1 诹l ) 的氯氰菊酯对斑马鱼染毒，观察其大体毒性，斑 马鱼活动减弱，沉入鱼缸底部。 3 2 总r n a 的提取 非变性胶短时间电泳也显示了较清晰的图谱，显示2 8 s 和1 8 s 带明亮，总r n a 提取质量较好。 图3 1 总r n a 琼脂糖凝胶电泳 3 3 氨氰菊酯对斑马鱼免疫组织中n f a t 信号通路相关分子转录的影响 各浓度组氯氰菊酯9 6 h 染毒后，使用相对定量r t p c r 方法研究n f a t 信号途径 上相关分子的转录相对水平。检测了n f a t 信号途径中的n f a t c l 、r c a n l ( d s c r l ) f f ti l - l f l 在斑马鱼免疫组织中的转录。因为r c a n l ( d s c r i ) 是n f a t 信号途径中重要的负反馈调 节因子，而f ，一邛则是n f a t 调控的下游基因。 2 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 图3 2 氯氰菊酯对斑马鱼n f a t 信号相关分子转录的影响 半定量r t - p c r 结果显示，随着染毒剂量的增加n f a t c l 变化趋势不明显；r c a n l 及弘邛则随着染毒剂量的增加表达量显著增加，其中r c a n l 的增加较快。经相关性 分析，n f a t c z 、r c a n l 及讲j 口相对灰度值与氯氰菊酯浓度对数的相关性系数分为 0 6 0 4 、0 9 7 5 和0 9 9 2 。查r 值表r o 0 5 ( 4 ) = 0 8 11 r o o l ( 4 ) = 0 9 1 7 ，因此r c a n l 及f f - j p 相对灰度值与氯氰菊酯浓度对数呈极显著直线正相关关系。即氯氰菊酯能剂量依赖 性地，显著诱导斑马鱼免疫组织n f a t 信号通路相关基因r c a n l 和f z j 口的转录，而对 n f a t c l 的转录影响不显著。 3 4 氯氰菊酯对斑马鱼免疫组织中w n t 信号通路相关分子转录的影响 氯氰菊酯9 6 h 染毒后，使用相对定量r t p c r 方法研究w n t 信号途径上相关分 子的转录相对水平。检测了w n t 信号途径上的w n t l o b 。舻五筇及夕c a t e n i n 在斑马鱼 免疫组织中的转录。w n t 分子有多种亚型，分别控制不同的功能：有报告称w n t l o b 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 在细胞对拟除虫菊酯杀虫剂应答时起重要作f f j ( k a s a te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。g s k 3 p 和f l - c a t e n i n 则是w n t 信号途径中的关键基因。因为在同一管中行p c r 时，有部分条带扩增效果 差，因此将目的基因和内参照分别在不同管中进行反应。 图3 3 氯氰菊酯对斑马鱼w r i t 信号相关分子转录的影响 结果显示，在9 6 小时氯氰菊酯急性染毒后，w n t l o b 和口c a t e n i n 在斑马鱼免疫 组织中的转录呈上调趋势，g s k 3 f l 转录水平变化趋势不明显。 经相关性分析，w n t l o b 、g s 9 3 筘和卢一c a t e n i n 相对灰度值与氯氰菊醮浓度对数的 相关性系数分为0 9 7 6 、0 5 2 0 和0 9 1 7 。查r 值表r o 0 5 ( 4 ) = 0 8 1 1 ，r o 0 1 ( 4 ) = 0 9 1 7 ，因 此w n t l o b 和f l - c a t e n i n 相对灰度值与氯氰菊酯浓度对数呈极显著直线- f 相关关系。 即氯氰菊酯能剂量依赖性地，显著诱导斑马鱼免疫组织w n t 信号通路相关基因 w n t l o b 和口c a t e n i n 的转录，而对g s k 3 p 的转录影响不显著。 2 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 3 5l i 2 c 0 3 对斑马鱼免疫组织g s k 3 侈转录水平的影响 k l e i n 等研究证实锂离子能在体外直接抑制g s k 3 8 的激酶活性，1 0 m m 的“a 能抑制8 0 左右的g s k 3 b 活性( k l e i na n dm e l t o n ，1 9 9 6 ) 。s t a m b o l i c 等则证实不论是 在体外还是对完整的细胞，锂离子对哺乳动物的g s k 3 a 和g s k 3 1 3 都有抑制，而且 这种抑制是可逆性的和特异性的( 对m e k , r a f , t r k 无影响) ( s t a m b o l i ce ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 因而l j 离子能产生与w n t 信号活化相同的效应，调控果蝇、非洲蟾蜍等的表型。 以等对数终浓度分别为l m m 、1 8 m m 、3 2 m m 、5 6 r a m 和1 0 r a m 的“2 c 0 3 处 理斑马鱼9 6 小时后，提取头肾、脾和肠等组织的总r n a ，使用相对定量p c r 考察 g s k 3 f l 转录水平的变化，每组3 个重复。 i 、 藿 l i 2 c 0 3c o n o e n t r a t i o n s ( m m ) 图3 4l i 2 c 0 3 对斑马鱼免疫组织g s k 3 转录的影响 o s ，不显著；料，p o 0 1 ) 本项研究证实1 8 m m 的l i 2 c 0 3 在9 6 h 暴露实验中就能显著抑制成体斑马鱼的 g s k 3 p 转录水平。经相关性分析，g s k 3 f l b a c t i n l 相对次度值与l i ! c 0 3 浓度对数的相 关性系数分为- 0 9 1 3 ，绝对值大于r 0 0 5 ( 4 ) = 0 8 1 1 ，因此g s k 3 f l 相对狄度值与l i 2 c 0 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 曼寡葛詈皇皇暑! 量詈皇詈鼍曼篡葛i 一i , 一i i i ii,i , 葛皇寡皇篁皇暑曼詈墨 浓度对数呈显著直线负相关关系。即l i 2 c 0 3 能在1 8 r a m 一1 0 m m 以剂量依赖性方式 显著抑制成体斑马鱼伊七邵的转录。 3 6 氯氰菊酯和l i 2 c 0 3 共同作用对斑马鱼的影响 在各浓度组氯氰菊酯的饲养水中均添h l l i 2 c 0 3 贮液，使l i 2 c 0 3 的终浓度为1 8 m m ，染毒9 6 d , 时后，再检测在氯氰菊酯单独作用时变化敏感的r c a n l 和以邛的转录 水平变化。 j 2 5 2? 1 5 ，卢 - - o - - i l - l b f l i + ) 卜i t