（生物化学与分子生物学专业论文）重组毕赤酵母产hsacp融合蛋白的发酵与提取.pdf

摘要 摘要 前胰岛素c 肽( c p ) 可抑制糖尿病并发症，但因在体内半衰期短，故将其与人血清 白蛋白基因( h s a ) 融合，以延长c p 药物在体内的半衰期。该融合基因在巴斯德毕赤 酵母( p i c h i a p 船幻，缸) 中表达，获得人血清白蛋白前胰岛素c 肽融合蛋白，简称h s a c p 融合蛋白。针对含有h s a c p 融合基因的巴斯德毕赤酵母( p i c h m 即幻，括h s a c p ) 在 b s m 培养基培养过程中，产h s a c p 融合蛋白量低、易被蛋白酶降解从而导致发酵液 中目的蛋白不易被分离纯化等问题，本论文开展了如下研究： 对p i c h m 嬲幻，括h s a c p 在摇瓶和发酵罐中的发酵条件进行了优化，提高了 h s a c p 融合蛋白产量。摇瓶培养条件下，2 浓度的甘油可使菌体细胞干重达1 0 6 4 9 l ， 1 0 9 l 浓度的甲醇诱导7 2 h 得到5 2 9 7m g l 的h s a - c p 融合蛋白；7 l 发酵罐中对p i c h m p a s t o r 括h s a c p 进行低密度培养，细胞干重最终为5 6 4 3g l ，目的蛋白产量达 3 6 8 4 5 m g l ；高密度培养时h s a c p 融合蛋白在发酵液中含量达到7 0 7 3 m g l ，细胞干 重最终为1 4 3 0 9g l 。 探索了减缓蛋白酶降解h s a c p 融合蛋白的方法。发现发酵液中存在内切型蛋白酶 对h s a c p 融合蛋白的降解作用，将目的蛋白降解成更小的蛋白片段。加入硫酸铵基本 不会减弱蛋白酶对目的蛋白的降解；酪蛋白水解物能减缓蛋白酶对h s a c p 融合蛋白的 降解；控制诱导温度在2 6 ，摇瓶发酵液中蛋白酶活由3 0 时的3 3 0 9u m l 降至2 3 1 4 u 枷，诱导时在添加1 5 浓度的酪蛋白水解物维持2 6 诱导温度的条件下，低密度发 酵时蛋白酶活由5 1 1 4u m l 降至4 4 2 2u m l ，而上述方法对高密度发酵影响较小。 确定了发酵液中的h s a c p 融合蛋白分离纯化的主要步骤。超滤浓缩2 0 倍，浓缩 液中的h s a c p 融合蛋白含量可达7 0 4 9 l ，回收率为8 2 8 。d e a es e p h a r o s ef f 阴离 子交换层析优于s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤纯化h s a c p 融合蛋白的效果，分离得到的目 的蛋白经过s d s p a g e 凝胶电泳，获得单一条带，分子量与理论值相符，产品达到电泳 纯。w e s t e r n b l o t 分析鉴定显示为h s a 和c p 的融合体。 关键词：人血清白蛋白前胰岛素c 肽融合蛋白，巴斯德毕赤酵母，发酵，降解，纯化 a b s t r a c t a b s t r a c t c - p e p t i d e ( c p ) c a ni n h i b i td i a b e t i cc o m p l i c a t i o n ，b u tt h eh a l f - l i f eo fc pi ss h o r ti nv i t r o t h e g e n eo fc pw a sf u s e d 晰t l lg e n eo fh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) t oe x t e n dh a l f - l i f eo fc p ；t h e f u s i o np r o t e i nn a m e dh u m a ns e r u ma l b u m i n - c p e p t i d ef u s i o np r o t e i n ( h s a c p ) w a s e x p r e s s e di nr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s m l e np i c h i ap a s t o r 细，h s a c pw a sc u l t i v a t e di n m i n e r a ls a l m e d i u m i tp r o d u c e ds m a l la m o u n to fh s a c p t h ed e s i r e dp r o t e i nw a sf o u n d p a r t i a l l yd e g r a d e db yt h ep r o t e o l y t i ca c t i v i t yi nt h eb r o t h ；c a u s et h el o s so ft h ef i n a lr e c o v e r y o fh a s c p 1 f l l em a j o rr e s u l t so ft h i ss t u d yw e r ep r e s e n t e da sf o l l o w ： t h ek e yf a c t o r so nh i g h 1 e v e lh s a c pp r o d u c t i o ni np i c h i ap a s t o r 西h s a c pw e r e i n v e s t i g a t e di nm i n e r a ls a l m e d i u mi ns h a k ef l a s k t h eo p t i m a li n i t i a lg l y c e r 0 1c o n c e n t r a t i o n w a s2 0 9 l a n dd r yc e l lw e i g h tr e a c h e d10 6 4 9 l ；t h ey i e l do fh s a - c pr e a c h e d4 2 9 7m g l w i t h10 9 lm e t h a n o li n d u c t i o nf o r7 2 h t h ey i e l do fh s a c pr e a c h e d3 6 8 4 5 m g li nt h el o w c e l ld e n s i t yc u l t u r ew i t hm i n e r a ls a l - m e d i u mi n7 lf e r m e n t e r , d r yc e l lw e i g h tw a s5 6 4 3g l ； w h e nh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e d ，t h ey i e l do fh s a - c pr e a c h e d7 0 7 3 m g l ，d r yc e l lw e i g h t w a s l 4 3 0 9g l n l em e t h o d st os l o wd o w nt h ep r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o no fh s a c pw e r er e s e a r c h e d p r o t e a s ec o u l dd e c r e a s eh s a - c pi n t op e p t i d ef r a g m e n t a sar e s u l t i tw a sf o u n dt h a ta d d i n g ( n h 4 ) 2 s 0 4h a dl i t t l ee f f e c to nh s a - c pd e g r a d a t i o n ，a d d i n gc a s a m i n oa c i dc o u l ds l o wd o w n t h ed e g r a d a t i o no fh s a c p i nt h ei n d u c t i o np h a s e a d d i n g1 5 c a s a m i n oa c i da n dk e e p t e m p e r a t u r ea t2 6 ，p r o t e a s ea c t i v i t yr e d u c e df r o m3 3 0 9u m lt o2 31 4u m li ns h a k ef l a s k a n df r o m51 1 4u m lt o4 4 2 2u m li nl o wc e l ld e n s i t yc u l t i v a t i o n b u ti th a sl i t t l ee f f e c to n l l i g l le e l ld e n s i t yc u l t i v a t i o n t 1 1 cm a j o rs t e p so fh s a - c ps e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nw e r ed e t e r m i n e d d i f f e r e n t c o n c e n t r a t em e t h o d sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l tw a s 7 0 4 9 lh s a c pw a so b t a i n e db y u l t r a - f i l t r a t i o n ，t og e t2 0f o l d sc o n c e n t r a t i o n ，t h er e c o v e r yr a t ew a s8 2 8 a f t e rd e a e s e p h a r o s ef f r u n n i n g t h eh s a - c pw a ss h o w na sas i n g l eb a n dt h r o u g hs d s p a g e e l e c t r o p h o r e s i s h s a c pe x t r a c t e dw a ss p e c i f i c a l l yi m m u n e r e a c t e dw i t ha na n t i h u m a nh s a p o l y c l o n a la n t i b o d ya n dc pp o l y c l o n a la n t i b o d yi nw e s t e r nb l o ta s s a y k e yw o r d s ：h s a - c p ，p i c h i ap a s t o r i s ，f e r m e n t a t i o n ，d e g r a d a t i o n ，p u r i f i c a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：轧馥盈 日 期：型罩垒翻翻 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，- j - 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：墨垒益爱 导师签名： * 一目 第一章引言 i 1 人血清白蛋白前胰岛素c 肽融合蛋白 1 1 1 前胰岛素c 肽概况 胰岛素等分子从胰岛b 细胞分泌。在胰岛素的翻译过程中，先翻译成由1 0 5 个氨基 酸残基构成的前胰岛素原( p 陀p m i n s u l m ) 。前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生 成8 6 个氨基酸组成的长肽链胰岛素原( p r o i n s u l i n ) 。胰岛索原随细胞浆中的微泡进 入高尔基体经蛋白水解酶的作用，切去3 1 、3 2 、6 0 三个精氨酸连接的链，断链生成 胰岛素，同时生成3 1 个氨基酸组成的分子量为3 0 2 0 d a 的前胰岛素c 肽( c 肽) ，两者 等摩尔量分泌到胰岛b 细胞外，进入血液循环中。正常人基础血浆c 肽水平约为 0 4 n m o l l ，由于前胰岛素c 肽不经过肝脏代谢而通过肾脏清除，其清除速率比胰岛素 慢，半衰期为3 0 m i n ，且与胰岛素无交叉免疫性，l 临床上被用于判定内源性胰岛素分泌 水平的指标”, 2 1 。 卜 9 淤；1 田卜ic 肽晶体站构图 f i gl 1t h e c r s t a i l o g r a p h i c o f h u c - p d i m m e r 曾经认为c 肽只是协同胰岛素a ，b 双链的连接和胰岛素原二级结构的形成，并不 具有生物括性。临床上仅应用c 肽在血中清除较慢的特点将其作为衡量内源性胰岛素水 平的指标。但是一直困扰研究者们的一个问题是，胰岛素绝对缺乏( c 肽也缺乏) 的l 型 糖尿病患者，接受胰岛素强化治疗后糖屎病控制与并发症试验( d c c d 研究即使血 糖控制达标，仍然不能完全阻止微血管并发症的发生和发展【3 】。近些年来许多研究肯定 了c 肚具有多种生物活性，用c 肽对胰岛紊依赖性病人进行替代治疗已有临床报道州。 随着对糖屎病基础和临床研究的深入，发现c 肚对于延缓糖屎病慢性并发症的发生有重 要的作用。在1 型糖尿病的治疗中，c 肽可以改善血管微循环，缓解神经、心血管、肾 脏病变及视网膜的损伤，提示c 肽有可能成为预防糖尿病慢性并发症的新药f ”。目前国 际上对c 肚研究比较有权威的机构是2 0 0 0 年l o 月在美国w a y n e 州立大学胜利的c 肽 研究组。 从最初发现c 肚能够促进糖和氨基酸转运，到发现c 肽能够改变红细胞的变形能力， 增加n a + - l r - 册酶的活性和细胞内c a 2 + 离子的浓度，增加一氧化氮合酶活性从而使n o 的合成增加，再到c 肽增强e n o s m r n a 的合成的研究，c 肽的作用机制已经被大家熟悉。 江南大学硕士学位论文 c 肽的受体途径作用机制( 如图1 2 ) 已被广泛接受：在细胞膜上存在c 肽的受体，c 肽 通过与细胞膜上g 蛋白耦联的受体结合，从而使c a z + 通道开放，使细胞内的c a 2 + 离子浓 度增加，激活c a 2 + 依赖的磷酸二脂酶，进而使n a + 1 0 a t p 酶活性增强，使n 矿k _ 一a t p 酶排出细胞内钠离子，从细胞外液中将钾离子移入细胞内，从而维持细胞内外的离子梯 度，同时n a + k + a t p 酶使红细胞的变形能力增加，改善血流动力，维持正常的细胞体积。 另一方面激活一氧化氮合酶的活性，使n o 的合成增加，使血管扩张，血流量增加，维 持正常的功能。 图1 - 2c 肽作用机制图 t h em e c h a n i s mo fc - p e p t i d e r i g l e r 等f 6 】利用荧光相光谱技术证实人肾小管上皮细胞、人皮肤纤维细胞、人隐静脉 内皮细胞上存在c 肽特异性结合位点。推n c 肽的肾保护功能机制可能是与细胞膜上g 蛋 白耦联的受体结合引起胞内c a 2 + 浓度升高，激活内皮型n o s 和c a 2 + 钙调蛋白依赖性蛋白 磷酸酶( p p 2 b 酶) ，而后者是调节肾小管细n a + k + a t p 酶活性的重要物质，可激活n a + k + a t p 酶活性，从而使n o 合成增多和n a + k + a t p 酶活性增强，n o 可增加毛细血管的血流量，抑n 血t d , 板的聚集，抑制系膜细胞增生，抑制 内皮细胞对白蛋白的通透性，对糖尿病肾病具有保护作用【7 j 。孟东等瞵j 研究表明，生理浓度 的c 肽能够增强e n o s m r n a 低于生理浓度的c 肽e n o s m r n a 的表达减弱。 e n o s m r n a 表达的减弱使n o 产生减少，这意味着生理浓度的c 肽能够增加n o 的血管 保护作用，而低浓度的c 肽削弱了n o 的血管保护作用。研究发现【9 】不仅全长c 肽，c 肽c 端的5 个氨基酸e 2 7 g s l q 3 l 也具有全长c 肽的大部分功能，而另一项研究发现【1 0 】 第2 7 的g l u 在c 端5 肽行使c 肽生物功能的作用中是不能缺少的，游离的g l u 能行使 c 肽5 0 作用的功能，g l u 在c 肽与细胞膜受体的结合中起关键作用。 总结近年来在。c 肽作用研究方面的进展，c 肽应当被看作是一种具有多种生物学活 性的激素，通过激活一些酶类，减轻和延缓1 型糖尿病患者肾脏、神经、微血管病变等 慢性并发症的发生和发展，这些发现为将来的1 型和2 型糖尿病慢性并发症的治疗提供 了新的思路，c 肽在糖尿病慢性并发症重的潜在作用价值也日益受到人们的广泛注视， c 肽的药物化研究逐渐引起人们的关注。但是由于c 肽的分子量小和稳定性差，使得 c 肽的表达非常困难，同时c 肽作为潜在的多肽类药物，与其他多肽类药物一样存在产 2 第一章引言 品稳定性差，体内半衰期短，药物生物利用度低等问题，这也是c 肽药物化亟待解决 的关键问题。 1 1 2 人血清白蛋白简介 人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是现有的常用天然载体蛋白之一。h s a 是有5 8 5 个氨基酸残基的单链无糖基化的球型蛋白质，它是血液中含量最高的单一蛋白 ( 达4 0 9 l ) ，是人体血浆的主要成分。h s a 本身就是许多内源因子和外源药物的载体，在 体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用，具有无免疫原性，人体相 容性好，分子量大( 约为6 6 k d a ) ，半衰期长约2 0 d 等性质。并且h s a 的基因在毕赤酵母 中可以高效分泌表达，上清液杂质含量较少，纯化方便，因此可以将蛋白质药物基因与 h s a 基因融合，在毕赤酵母中表达，获得含h s a 的融合蛋白，延长蛋白质药物的半衰 期。 目前，与人血清白蛋白融合的重组药物还处于临床阶段，效果如何还有待进一步临 床试验的验证。但是与p e g 修饰等技术相比，融合蛋白技术不需额外的化学修饰，生 产工艺简单，底物均一，质量控制相对容易，在延长药物半衰期的效果及安全性上可能 比p e g 更为有效，因此成为人们关注和研究的热点，具有相当广阔的发展前景。 1 1 3 人血清白蛋白肽融合蛋白的由来 通过构建融合蛋白技术延长蛋白药物半衰期是目前较受关注的一种方法。一般选取 与人体相容性好，无毒副作用，不易引起免疫清除，分子量大且半衰期长的蛋白作为载 体蛋白，将目的蛋白与其融合，利用载体蛋白分子量大的性状将目的蛋白的非活性区域 折叠包裹，仅暴露出活性部位，从而保留目的蛋白的生物作用并在体内缓慢释放药物， 达到延长药物半衰期的目的。 白蛋白融合技术是利用白蛋白分子质量大的特性将药物蛋白易致机体产生过敏反 应的部分折叠包入其内，暴露药物蛋白活性区域，使其位于融合蛋白的表面。这种处理 手段的优点不但可以显著降低产品的过敏反应，还可防止机体酶系统对药物蛋白的降 解，提高产品的稳定性和延长其疗效。白蛋白融合技术与化学修饰相比，不需要额外的 化学修饰，生产工艺简单，产物均一，质量控制相对容易，延长药物半衰期的效果可能 比化学修饰更有效。因此该技术成为人们关注和研究的热点，具有相当广阔的发展前景。 结果使得更多的学者和国外的一些医药公司把研究目标转移到这一技术上来，主要的研 究内容如下： 在国外，1 9 9 0 年英国d e l t a 公司首先将白蛋白用于基因融合提高多肽、蛋白药物的 半衰期。1 9 9 2 年，y e h 等i l l 】利用基因工程手段，构建了h a s c d 4 ，使蛋白位于c d 4 的 n 端，避免了化学法的非特异交联而产生的产物不均一性。融合蛋白在克鲁维酵母中进 行分泌表达，纯化得到的融合蛋白在大鼠体内半衰期相对c d 4 提高了1 4 0 倍，同时保 留了很好的抑制h i v 感染的活性。 2 0 0 1 年，美国马里兰州人类基因组科学公司( h u m a ng e n o m es c i e n c e s ，h g s ) 将人 白蛋白( h s a ) 基因和a 干扰素( f n a2 b ) 基因融合，表达的i f nq2 b h s a 在体内 江南大学硕士学位论文 平均半衰期达1 4 8 h ，比p e g 化i f n q2 b 平均半衰期( 4 0 8 0 h ) 更长，且有很好的抗病 毒活性、安全性和耐受性。 2 0 0 5 年，美国h g s 公司的a l b u f e r o n 2q 使s a 基因和f n 2q 融合蛋白在加拿大进 行i i 期临床试验，共有5 6 名病人，随机分成5 个给药组 ( 2 0 0 m c g ，4 5 0 m c g ，6 7 0 m c g ，9 0 0 m e g ，1 2 0 0 m c g ) 。临床试验结果表明，a l b u f e r o n 2q 平均半 衰期1 4 8 h ，比p e g a s y s 平均半衰期8 0 h ( 5 0 1 4 0 h ) 和p e gi n t r o n 平均半衰期4 0 h ( 2 2 6 0 h ) 更长。它有很好的抗病毒活性、安全性和耐受性，病人用药后产生对h s a 抗体为1 7 ， 但未给药者存在h s a 抗体达3 4 ，并且在抗体产生副反应，抗病毒反应和药代动力学 之间没有明显的相关性【1 2 , 1 3 】 在国内，上世纪这一领域的研究还是空白。但在2 0 0 0 年后，很多学者将研究目光 转移到这一领域，干扰素q 2 b 、干扰素1 3 、粒细胞激落刺激c 型利尿钠肽先后被作为 目标分子与白蛋白融合共表达【1 4 d 7 】其中干扰素q 2 b 与白蛋白的融合蛋白已进入临床阶 段。 人血清白蛋白c 肽融合蛋白是由江南大学周利苹将人血清白蛋白基因与前胰岛素 c 肽基因融合后，转入巴斯德毕赤酵母g s l l 5 中表达，从而获得可分泌h s a c p 融合基 因的巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s h s a c p ) ，h s a c p 融合蛋白分子量约为7 0 k d a 。 1 2 利用重组毕赤酵母产生融合蛋白的概况 1 2 1 重组毕赤酵母表达系统表达外源蛋白优势 自遗传工程技术问世以来，克隆外源基因尤其是真核生物基因，大多使用大肠杆菌 表达系统。然而由于大肠杆菌表达系统的不足，人们转而利用枯草芽孢杆菌及酵母作为 宿主系统。芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶，所以分泌外源基因蛋白产物的尝试不易成 功。因此，研究者逐渐注意开发和利用具有适合真核生物基因产物正确折叠的细胞内环 境的酵母菌作为表达异源基因的宿主系统。 1 9 6 9 年，o g a t a 1 8 】首次报道了能以甲醇为唯一碳源的酵母。由于当时甲醇非常便宜， 七十年代美国p h i l l i p sp e t r o l e u mc o m p a n y 成功开发了用毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 高密 度培养生产饲料用单细胞蛋白( s c p ) 的培养基及方法。但不久石油危机爆发，甲醇价 格大幅度上涨，s c p 项目被迫停下。八十年代初，p h i l l i p sp e t r o l e u mc o m p a n y 与一家生 物公司s a l ki n s t i t u t eb i o t e c h n o l o g y i n d u s t r i a la s s o c i a t e si n c ( s i b i a ) 开始联合开发毕赤酵 母表达系统。s i b i a 公司的研究人员e l l i s 等【1 9 】1 9 8 5 年首次成功分离了甲醇氧化酶 ( a o x l ) 基因及其启动子。同年，c r e g g 等首次报道用巴斯德毕赤酵母作为宿主表达 外源蛋白成功【2 0 1 。1 9 9 3 年，p h i l l i p sp e t r o l e u mc o m p a n y 将有关毕赤酵母表达系统的专利 出售给r e s e r c hc o r p o r a t i o nt e c h n o l o g i e s ( r c t ) ，同时与r c t 达成协议授权i n v i t r o g e n 公 司向全世界的研究人员出售毕赤酵母表达系统，该举措极大地推动了毕赤酵母表达系统 的应用和发展。1 9 9 5 年报道有4 0 多种蛋白已在毕赤酵母中表达成功，而1 9 9 9 年到了 1 2 0 多种【2 l 】，2 0 0 0 年报道已有2 2 0 多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达【2 2 1 。 巴斯德毕赤酵母( pp a s t o r i s ) 表达系统目前应用最广泛的的具有高效分泌表达的真 4 第一苹引言 核表达系统【2 3 2 5 1 ，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的 蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫 细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表 达系统无法比拟的优越之处，它具有以下优点：( 1 ) 具有完善的真核细胞翻译后修饰加工 系统，有利于表达出有活性的蛋白；( 2 ) 具有适当程度糖基化，不存在酿酒酵母糖蛋白中 核心多糖末端a 1 ，3 甘露糖苷连，有效地减小了重组蛋白的抗原性；( 3 ) 具有强有力的乙 醇氧化酶( a o x l ) 启动子，可严格调控外源基因的表达；( 4 ) 夕1 - 源基因通过整合到毕赤酵 母染色体可以得到遗传稳定的表达菌株；( 5 ) 相对其他真核表达系统，该系统具有较高的 表达量，在该系统中外源基因既可以胞内表达也可以胞外表达，由于巴斯德毕赤酵母自 身分泌的蛋白( 背景蛋白) 非常少，分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分，十 分有利于外源蛋白的分离和纯化；( 6 ) 营养要求低、生长快、所用培养基价格低廉，有利 于进行高密度发酵和工业放大l z 2 。目前已有数以百计的蛋白在该系统中得到成功的表 达，产量最高达2 2g l 之多i j 引。 1 2 2 发酵培养分泌融合蛋白的毕赤酵母 毕赤酵母属于甲醇营养型酵母，能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长。其 细胞过氧化酶体内含有甲醇代谢途径的必需酶，如乙醇氧化酶( a o x ) 、二羟丙酮合成 酶和过氧化氢酶等，其中过氧化氢酶是甲醇利用的第一个酶。它催化甲醇被氧化为甲醛 和过氧化氢【3 4 。当细胞以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时，不能检测到a o x 活性， 而在甲醇培养的细胞中，该酶可占细胞总蛋白的3 0 以上。甲醇能诱导a o x 的合成， 而甘油和葡萄糖则抑制a o x 的产生。只有在去除其它能源后，利用甲醇诱导才能启动 a o x l 基因的信号转录和翻译。 重组毕赤酵母表达外源目的蛋白一般分两个阶段，即细胞生长阶段和外源蛋白表达 阶段。细胞生长阶段的目的是为了达到一定菌体量，一般用能使酵母快速生长的碳源， 通常为甘油或葡萄糖，表达阶段以甲醇作为碳源和能源来诱导外源基因的表达。在具体 发酵方式上，一般分为三个阶段：甘油分批阶段( g l y c e r o lb a t c hp h a s e ) 、甘油流加阶段 ( g l y c e r o lf e d b a t c hp h a s e ) 、和甲醇流加阶段( m e t h a n o lf e d - b a t c hp h a s e ) 。 甘油分批发酵阶段：一般最初甘油浓度为l 4 ( w v ) ，自接种至甘油耗尽持续 的时间决定于接种量和甘油浓度，般不超过2 4 h ，这一阶段为甘油非限制，所以菌体 的生长率最高。 甘油补料分批发酵阶段：分批阶段结束时，甘油耗尽，溶氧有急剧上升，此时流加 5 0 ( w v ) 甘油，使菌体维持一定的比生长速率继续生长。由于这个阶段甘油是限制 性碳源，菌体的生长速率较甘油分批发酵阶段要低。菌体生长至一定浓度，且发酵液中 甘油耗尽时，可以开始诱导表达。 诱导表达阶段：不同的甲醇利用表型的重组毕赤酵母采用的碳源系统不同。对于 m u t + 表型的菌株，一般采用单纯流加甲醇的方式。而对于甲醇利用能力弱的m u t 5 表型 的菌株及几乎无甲醇利用能力的m u t 表型的菌株来说，多采用流加混合碳源( 如甘油 甲醇) 的方式以使细胞维持一定的生长，同时表达外源基因。但是如果诱导表达阶段发 江雨大学硕士学位论文 酵液出现阻遏性碳源( 如葡萄糖，甘油等) 积累，a o x l 启动子被阻遏从而影响外源基 因的表达。 在国内，人血清融合蛋白的产量不是很高。窦文芳等人p 5 】使人高血糖素样多肽1 突变体的串联体与入血清白蛋白融合蛋白( g g h h s a ) 产量达2 4 5 m g l 。 周利苹等人【3 6 】将人血清白蛋白与c 肽蛋白的基因融合并成功地在重组pp a s t o r i s 中 使用有机培养基分泌表达h s a c p 融合蛋白，经验证，其分子量约7 0 k d ，融合蛋白产 量为1 4 0 m g l 。 1 2 3 重组毕赤酵母表达外源蛋白的降解现象 毕赤酵母作为一个越来越重要的表达系统，已经成功应用于数百种外源蛋白的高效 表达。然而，对于目的蛋白特别是不稳定的蛋白而言，降解是培养过程中面临的一个主 要问题【37 1 。重组pp a s t o r i s 表达系统中外源蛋白质降解主要是由酵母产生的蛋白酶引起 的，细胞死亡或裂解，释放胞内蛋白酶从而导致分泌后的重组蛋白被降解，这种机理已 经被广泛接受p 引。 分泌型蛋白因毕赤酵母中蛋白酶水解而不稳定，这主要是酵母液泡中含有丰富的蛋 白酶，当细胞破裂时就会释放出来1 3 9 1 。主要的液泡蛋白酶是由p e p 4 基因编码的蛋白酶 a ，一种a s p 蛋白酶，需要其他液泡蛋白酶( 如梭肽酶y 和蛋白酶b ) 参与才能起作用。 蛋白酶b 优先被蛋白酶a 结合和激活，具有已经结合酶活性的1 2 。不同的蛋白酶有不 同的最适温度作用范围，通过选择适当的诱导温度可以有效降低蛋白酶的活性，减少目 的蛋白的降解i 删。 温度是影响细胞生长和目的蛋白产率及稳定性的一个重要因素。温度对毕赤酵母生 长的影响主要是对细胞生长速率的影响。在菌体生长阶段，生长阶段温度一般为2 8 3 0 ，但是对于外源蛋白表达来讲，温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现 的结果【4 1 1 。 总的来讲，提高目的蛋白的稳定性，使其免受蛋白酶降解常用的五种策略如下：一、 在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，增加蛋白酶的底物以减 少目的蛋白的降解【4 2 j 。二、因pp a s t o r i s 可在较宽的p h 范围内生存，调节培养基p h 值 以抑制蛋白酶的活性 4 3 , 4 4 1 。三、降低甲醇诱导时的培养温度4 5 1 。四、发酵时控制一定的 比生长速率或利用连续培养的发酵方式。五、使用蛋白酶缺陷株，如s m d l l 6 3 、 s m d l l 6 5 、s m d l l 6 8 。但是因为这些菌株活性差，生长缓慢且难转化，所以只有在其他 办法不能奏效时才推荐使用。此外，可通过共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性，以 减少目的蛋白的降解。可将目的蛋白与一种在pp a s t o r i s 中稳定的蛋白伴侣融合表达， 通过改变目的蛋白的性质来提高稳定性。也可尝试将目的蛋白连接上一个过氧化物酶体 靶蛋白信号( p e r o x i s o m a lt a r g e t i n gs i g n a l ，p t s ) ，使其被分拣转运入过氧化物酶体贮存起 来，免受蛋白酶降解，还可以减少对宿主细胞的毒害作用。 1 3 发酵液中目的蛋白的分离纯化 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，发酵液的成分十分复 6 第一苹引言 杂，从发酵液中分离和纯化蛋白质的工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没 有一个单独或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从成分复杂的发酵液中提取出来，但 对任何一种蛋白质的分离纯化都有可能选择一套适当的程序来获取高纯度的制品。蛋白 质分离纯化的总体目标是设法增加目标蛋白的纯度或比活性，纯化要求合理的效率、速 度、收率和纯度，从而将目标蛋白质从发酵液的其他成分特别是杂蛋白中分离出来，同 时保留有这种蛋白质的生物学活性和化学完整性。 为降低实验成本、实现毕赤酵母表达的外源蛋白大规模生产，除优化发酵条件，提 高目的蛋白的分泌表达水平外，建立简便、高效且易于放大易于自动控制的分离纯化方 法也是有效的关键手段。 目前毕赤酵母表达的外源蛋白纯化方面较常见是重组h s a 纯化的研究。重组h s a 是由微生物分泌产生，其纯化过程中需出去的杂质除某些剩余培养基成分( 无机盐) 外， 其余均源于宿主细胞，如宿主细胞分泌的杂蛋白、多肽、脂质、多聚糖、热源、色素等 代谢产物以及细胞破碎释放出的核酸及胞内物等。 目前r h s a 或者h s a 的融合蛋白分离纯化方面的研究比较少只有几篇专利有所报 道【4 6 , 4 7 】这些方法的主要区别在于前期的初步纯化过程。r h s a 的初步纯化方法主要有两 大类，以使采用离心或过滤实现固液分离作为分离纯化的第一步( f i l t e rp r e s s 法) ，另一 是利用层析分离原理直接将发酵液上柱处理( s r e a m l i n e 法) ，一般采用扩张床吸附技术， 瑞典的p h a r m a c i ac o 及日本的y o s h i t o m op h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s ，l t d 在r h s a 的提取 过程中均采用了该技术。 国内方面，陈家琪等人【4 8 】对含6 3 6 m g l 胰高血糖素样肽1 与人血清白蛋白融合蛋 白( g l p 1 l i s a ) 的发酵液经过中空纤维柱浓缩、疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过 滤分离纯化，获得纯度达9 5 8 的目的蛋白。 1 4 立题背景及研究内容 从1 9 6 7 年发现c 肽到现在4 0 年的时间中，从最初的没有生物活性的物质放弃研 究，到后来众多实验显示在预防了治疗和糖尿病慢性并发症方面有重要作用，c 肽的活 性作用已被许多科学家所承认。作为一种潜在的糖尿病并发症治疗药物，与其他多肽类 药物一样存在产品稳定性差，体内半衰期短，药物生物利用度低等问题。h s a c p 在发 酵过程中表达量与研究报道的重组毕赤酵母工程菌高表达量仍有很大差距，本菌株发酵 条件未被系统地确定。且表达的融合蛋白存在一定程度的降解。随着发酵时间的延长， 降解情况也增加。发酵罐上需要进一步的研究发酵过程的控制方法，提高目的蛋白的表 达量，为扩大化生产提供依据。作为药用蛋白，分离纯化方面其纯度不够，需要进一步 研究发酵液的预处理方法，建立合理的分离纯化工艺。 本论文主要研究内容如下： ( 1 ) 重组毕赤酵母发酵产h s a c p 融合蛋白条件的优化 ( 2 ) 抑制蛋白酶降解h s a c p 融合蛋白的方法 ( 3 ) h s a c p 融合蛋白的分离纯化 7 江南大学硕士学位论文7 第二章实验材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 p p a s t o r i s h s a c p 菌株，由生工学院金坚老师惠赠。 2 1 2 培养基 y p d 活化培养基：2 蛋白胨，1 酵母提取物，2 葡萄糖，2 琼脂粉( 平板) 。 摇瓶生长培养基： 1 8 2 9 lk 2 s 0 4 ，7 2 8 9 lm g s 0 4 ，4 1 3 9 lk o h ，0 9 3 9 l c a s 0 4 2 h 2 0 ，2 6 7 m l l8 5 磷酸，4 3 5m l lp t m i ( 微量元素) ，甘油浓度试验中确定。 摇瓶诱导培养基： 1 8 2 9 lk 2 s 0 4 ，7 2 8 9 lm g s 0 4 ，4 1 3 9 lk o h ，0 9 3 9 l c a s 0 4 2 h 2 0 ， 2 6 7 m l l8 5 磷酸，4 3 5m l lp t m l ，甲醇浓度试验中确定。 b s m 培养基：2 0 9 l 甘油，1 8 2 9 lk 2 s 0 4 ，7 2 8 9 lm g s 0 4 ，4 1 3 9 lk o h ，0 9 3 9 l c a s 0 4 2 h 2 0 ， 2 6 7 m l l8 5 磷酸，4 3 5m l lp t m l 。 发酵诱导培养基：5 0 甲醇( 含1 2 m l lp t m l ) 诱导液。 补料生长培养基：5 0 ( w v ) 甘油( 含1 2 m l lp t m l ) 2 1 3 试剂 蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物购自b i ob a s i c1 n c ；尿微量白蛋白测定试 剂盒购自上海名典生物工程有限公司。h s a 多克隆抗体购自成都生物制品所，c p 抗体 购自晶美生物公司。层析介质d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w ，s e p h a d e x g 7 5 购自p h a r m a c i a 公司，低分子量标准蛋白等购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他试剂均为国 产分析纯。 2 1 4 主要仪器 c f 7 0 2 高速冷冻离心机 u v 7 5 4 紫外分光光度计 b i o f l 0 1 1 0 发酵罐 m u l t i s k a nm k 3 酶标仪 c y c z 2 4 d 型蛋白电泳仪 7 5 4 u v 紫外可见分光光度计 超滤器 层析柱 2 2 方：法 日本日立公司 上海精密仪器厂 美国n b s 公司 上海雷勃分析仪器有限公司 北京市六一仪器厂 上海分析仪器总厂 m i l l i p o r e 公司 上海华美生物工程有限公司 2 2 1 培养方法 2 2 1 1 细胞光密度值( o d 6 0 0 ) 与细胞干重( d c w ) 关系图的绘制 8 第二章实验材料与方法 。 取不同培养时间的发酵液，测定光密度值。同时取发酵液1 0 m l ，8 0 0 0 r m i n 离心 l o m i n ，弃上清，去离子水洗涤湿菌体，充分震荡，8 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，弃上清，重 复此操作3 次，得到湿菌体，1 0 5 。c 烘干至衡重。绘制菌体干重( g ) 菌体浓度( o d 6 0 0 ) 的关系曲线。 2 2 1 2 甘油初始浓度对尸p a s t o r i s h s a c p 生长的影响 摇瓶水平：从新鲜y p d 活化平板上挑单一菌落到y p d 液体活化培养基中，3 0 ， 2 0 0 r m i n 培养2 0 2 5 h 后，按10 接种量，分别接入到含不同浓度甘油的摇瓶生长培养 基( 1 0 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶) 中。其中，甘油浓度分别为：l o g l ，2 0g l ，3 0g l ，4 0g l 。 3 0 ，2 0 0 r m i n 条件下培养，每5 小时取样分别测定6 0 0 n m 下的吸光值，并测定甘油残 留量。 发酵罐水平：从新鲜平板上挑单一菌落到y p d 活化培养基中，3 0 ，2 0 0 r m i n 培 养2 0 2 5 h 后，按1 0 的接种量接种到装有4 l 发酵培养基的7 l 发酵罐中进行分批培养。 初始甘油浓度分别控制在1 0 9 l ，2 0g l ，3 0g l ，4 0g l 。每5 小时取样分别测定6 0 0 n m 下的吸光值，并测定甘油残留量。 相关参数控制如下：( 1 ) 溶氧及转速：空气流速3 l m i n ，溶解氧控制在3 0 。最 低搅拌转速为3 0 0 r m i n ，上限设定为8 0 0 r m i n ，发酵罐提高或降低转速自动控制。( 2 ) p h 值：自动流加3 0 的氨水和5 0 磷酸，培养过程中流加氨水和5 0 磷酸溶液控制p h 在 5 0 左右。( 3 ) 温度：3 0 ，自动控制。 2 2 1 - 3 生长曲线的绘制 从新鲜y p d 活化平板上挑单一菌落到y p d 液体活化培养基中，3 0 ，2 0 0 r m i n 培养2 0 2 5 h 后，按1 0 接种量接入摇瓶生长培养基，3 0 ，2 0 0 r m i n 培养。间隔一定 时间取两瓶测定菌体浓度，取平均值绘制曲线。 2 2 1 4 确定甲醇诱导户p a s t o r i s h s a c p 产h s a c p 融合蛋白的时间 摇瓶水平：从新鲜y p d 活化平板上挑单一菌落到y p d 液体活化培养基中，3 0 ， 2 0 0 r r a i n 培养2 0 2 5 h