荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒的作用.doc

荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒的作用 作者：蒋蔚峰，陈建宗，张娟，张金平，贾新 【摘要】 目的： 观察荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用. 方法： 以HepG2.2.15细胞为靶细胞，分别用不同浓度的荔枝核总皂苷和拉米夫定培养液培养，采用ELISA法及荧光定量PCR法测定细胞培养上清HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA含量，评价荔枝核总皂苷对体外HBV的抑制作用. 结果： 荔枝核总皂苷对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的50抑制浓度(IC50)分别为0.096，0.085和0.128 g/L，治疗指数(TI)分别为6.98，7.88和5.23. 0.25 g/L拉米夫定组和0.4 g/L荔枝核总皂苷组在d 3，d 6对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg，HBeAg及细胞外HBV DNA的抑制作用差异无统计学意义（P0.05）. 结论： 荔枝核总皂苷具有一定的体外抗HBV作用. 【关键词】 荔枝核；皂苷类；HepG2.2.15细胞；肝炎病毒，乙型 0引言 我国属乙型病毒性肝炎高流行区，2004 年中国疾病预防控制中心调查显示我国HBsAg 感染率高达9.091. 目前，尚没有理想的治疗慢性乙型肝炎的药物. 我国有数千年应用中草药治疗疾病的传统和经验，从中已发现了不少抗乙型肝炎病毒(HBV)的药物. 荔枝核是无患子科植物荔枝（Litchi chinensis Sonn）的成熟种子，又名荔仁或荔核，味甘、微苦，归肝、肾经，具有行气散结、祛寒止痛的功效. 其化学成分包括皂苷、蒜质和脂肪酸等多种物质. 研究发现，荔枝核黄酮类提取物对乙肝病毒HBsAg，HBeAg以及HBV DNA有明显的抑制作用2-3. 但荔枝核皂苷是否具有抑制HBV的作用，目前尚未见文献报道. 我们采用HepG2.2.15细胞为靶细胞，观察不同浓度荔枝核总皂苷体外对HBV的抑制作用. 1材料和方法 1.1材料HepG2.2.15细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心王平忠博士惠赠；噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)和G418(Sigma公司)；HBsAg和HBeAg的ELESA检测试剂盒(华美生物公司)；Model 1680酶联免疫检测仪(德国BioRad公司)；HBV DNA提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)； DMEM高糖培养液、胰蛋白酶、EDTA、L谷氨酰胺、胎牛血清(Gibco公司)； PE7700型自动荧光PCR检测仪(美国Perkin Elmer公司). 荔枝核总皂苷由第四军医大学药剂科提取，实验时用 DMSO溶解后再以含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液稀释，分别配制成0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 g/L共5个浓度梯度，含药培养液中DMSO浓度不超过10 g/L. 拉米夫定由葛兰素史克制药有限公司提供，实验时用培养液稀释成0.25 g/L. 1.2方法HepG2.2.15细胞培养于DMEM高糖培养液(含100 mL/L 胎牛血清，400 mg/L G418及0.3 g/L谷氨酰胺，56 g/L碳酸氢钠调pH值至7.2)中，培养于37，饱和湿度，50 mL/L CO2，每72 h更换培养液1次. 细胞长满瓶底约80%，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA 11混合消化35 min，13分瓶传代. 取对数生长期状态良好的细胞，调整细胞浓度为1107个/L，接种于96孔板，每孔0.2 mL，培养箱培养24 h，待细胞贴壁后进行实验. 荔枝核总皂苷按配制不同浓度分组，同时设仅加细胞培养液的阴性对照组和含0.25 g/L拉米夫定的阳性对照组，每组设3个复孔. d 3更换同样浓度含药培养液及对照培养液1次. 各孔用药d 3，d 6将吸取的上清液置于-20 冰箱保存待检. 另分别收集贴壁后16 d的细胞培养上清，-20保存，统一检测. 使用ELISA法检测培养上清的HBsAg和HBeAg，显色反应后，酶标仪读取A450 nm值，绘制分泌曲线. 1.2.1药物对细胞毒性试验荔枝核总皂苷配制成0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625 g/L共8个浓度梯度，HepG 2.2.15细胞以1107个/L 接种于96孔培养板，细胞贴壁后各药物组换入相应含药培养液，阴性对照组换入正常培养液. 于加药d 6吸去上清液，每孔加5 g/L MTT 20 L，37孵育4 h，弃上清液后每孔加入DMSO 150 L，震荡10 min，测A490 nm值. 计算细胞存活率() =(实验组A490 nm值/阴性对照孔A490 nm值)100；半数中毒浓度(TC50)= Anti loglogB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率C，(A抑制50药物浓度，B抑制50药物浓度，C=log稀释倍数). 1.2.2上清液HBsAg和HBeAg测定根据双抗体夹心ELESA试剂盒说明测定培养上清液HBsAg和HBeAg. 计算抗原抑制率()=(阴性对照孔A值-实验孔A值)/阴性对照孔A值100；50药物抑制浓度(IC50)Anti loglogB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率C，(A抑制50药物浓度，B抑制50药物浓度，C=log稀释倍数). 1.2.3细胞培养上清HBV DNA检测按照Taqman HBV核酸扩增荧光检测试剂盒说明操作. 引物序列为 P1：5ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3； P2：5ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3；荧光探针序列为：5GGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3. 各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93 2 min预变性，然后93 45 s 到55 1 min 循环扩增10个循环，再按93 30 s 到55 45 s循环扩增，共30个循环. 反应结束后由计算机自动分析出HBV DNA定量结果，计算HBV DNA抑制率. HBV DNA抑制率()=(阴性对照孔HBV DNA拷贝数实验孔HBV DNA拷贝数)阴性对照孔HBV DNA拷贝数100. 1.2.4治疗指数的计算HBsAg，HBeAg和HBV DNA的治疗指数(TI)半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50). 其中TI2为有效低毒；1TI2为低效有毒；TI1为毒性作用. TI越大，则表明该药对HBsAg，HBeAg和HBV DNA抑制作用越强或细胞毒性越小. 统计学处理： 数据以xs表示，应用SPSS 11.5 统计软件进行分析，组间均数比较采用方差分析及 LSDt检验，P<0.05为有统计学意义. 2结果 HepG 2.2.15细胞经传代培养，在贴壁后16 d，其培养上清中的HBsAg和HBeAg分泌量随着细胞培养时间的延长而逐渐增加（图1）. 图1HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的时间曲线 (n=3, xs) 2.1药物对HepG2.2.15细胞的毒性荔枝核总皂苷对细胞的毒性作用较小，0.8，0.4 g/L组对细胞的抑制率分别为53.7和39.3，TC50为0.67 g/L. 而0.25 g/L拉米夫定组对细胞的抑制率为43.4. 2.2药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg和HBeAg的抑制作用荔枝核总皂苷的不同浓度对HBsAg和HBeAg分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长，抑制也随之增强. d 6 HBsAg的IC50为0.096 g/L，HBeAg 的IC50为0.085 g/L（表1）. 2.3药物对HepG2.2.15细胞培养上清HBV DNA的抑制作用荔枝核总皂苷的不同浓度对HBV DNA的分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长对HBV的抑制也随之增强. d 6 HBV DNA的IC50为0.128 g/L（表2）. 2.4治疗指数荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg，HBeAg及HBV DNA的治疗指数(TI)分别为6.98，7.88和5.23. 表1荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率表2荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞上清液中HBV DNA的影响 3讨论 近年来，一批中药和复方制剂经过实验研究及临床应用证实有一定的抗病毒作用. 国内党双锁等4报道，黄芪蛰虫合剂的各个实验浓度组均对HepG2.2.15细胞HBsAg，HBeAg及HBV DNA的分泌有不同程度的抑制作用. 张晓刚等5用HepG2.2.15细胞研究白背叶根体外抗HBV的活性，发现其对抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为13.26和43.08，对HBV DNA仅有微弱抑制作用. 欧阳雁玲等6研究了中药提取物人衔草对HepG2.2.15细胞作用9日的影响，发现其200 mg/L组对HBsAg和HBeAg抑制率分别为78.9和35.58. 国外有文献报道虎杖的30 g/mL 乙醇提取物及水提取物在d 6对HBV DNA的抑制率分别为28.12和48.127. Romero等8利用HepG2.2.15细胞作为细胞模型，通过药物作用细胞21天后测定HBsAg和HBV DNA 评估药物作用，认为青蒿素及其衍生物青蒿琥酯在不产生细胞毒性的条件下，能够非常有效地抑制病毒产物. 转基因HepG2.2.15细胞株载有HBV全基因组，能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及HBsAg和HBeAg9. HBsAg和HBeAg是HepG2.2.15细胞分泌到培养上清中的可溶性蛋白质，能够间接地反映病毒复制状况. 对HepG2.2.15细胞培养液中HBV DNA及其抗原的动态分析表明10，细胞外HBV DNA水平与病毒抗原具有显著相关性，而细胞内HBV DNA水平与病毒抗原的相关性无统计学意义. 为此，我们选用HepG2.2.15细胞培养上清中HBV DNA及其抗原的变化作为观察指标，以判定荔枝核总皂苷体外抗HBV作用. 我们利用MTT实验检测不同浓度荔枝核总皂苷对HepG2.2.15细胞的毒性作用，发现0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625 g/L 组在d 6 对细胞的抑制率分别为53.7，39.3，26.0，12.6，11.0，7.93，6.0，4.0，随着药物浓度的增加，细胞抑制率呈上升趋势；除0.8 g/L 组外，其他组对细胞的抑制作用均较弱. 我们研究发现，荔枝核总皂苷的各个实验浓度组均能降低细胞培养上清中HBsAg，HBeAg及HBV DNA的含量，且随时间的延长和药物浓度的增高，其作用也随之增强. 同时我们发现，0.025 g/L荔枝核总皂苷组在细胞毒性实验中对细胞的抑制与阴性对照组差异无统计学意义（P0.05），但在d 6 上清液中的HBsAg，HBeAg及HBV DNA 含量与阴性对照组差异有显著统计学意义(P0.01)，在d 3上清液中的HBV DNA 含量与阴性对照组差异有统计学意义(P0.05)；而其他浓度组在两个时间段细胞培养上清中HBsAg，HBeAg及HBV DNA的含量均和阴性对照组差异有显著统计学意义(P0.01)；0.4 g/L 荔