（园林植物与观赏园艺专业论文）麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究.pdf

麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 摘要 本研究以麻叶绣线菊( s p i r a e ac a n t o n i e n s i sl o u r ) 当年生茎段、幼嫩叶片为外植体 材料进行组织培养植株再生技术研究，通过正交试验设计及统计分析方法，探讨了影 响麻叶绣线菊离体培养的关键因素，存在的主要问题及解决方法；寻找到了最佳培养 基配方及培养程序，从而建立了麻叶绣线菊的快繁体系。研究主要结果如下： 1 麻叶绣线菊茎段的最佳取材季节为5 月，启动率高，达到8 2 5 0 ，污染率相 对其他时期较低，为3 2 5 0 。 2 茎段以o 1 的升汞消毒5m i n 的效果最好，启动率和污染率分别为7 3 3 3 和 1 3 3 3 。叶片以o 1 的升汞消毒3m i n 的效果最好，启动率和污染率分别为4 3 3 3 和4 0 0 0 。 3 带芽茎段腋芽的诱导：以当年生枝条上的带芽茎段为外植体，最适合带芽茎 段腋芽诱导的培养基配方为m s + 2 0m g l6 - b a + 0 1m g l n a a ，诱导率可达8 4 7 1 ， 平均新芽高为2 1 0e m 。 4 愈伤组织的诱导：以3 月份新发出的新梢嫩叶为外植体，最适合叶片愈伤组 织诱导的培养基配方为m s + i 0m g l6 一b a + o 5 0m g ln a a + 0 0 5m g l2 , 4 一d ，诱导启 动率达5 8 1 8 ，能得到黄绿色愈伤组织。 5 愈伤组织的增殖与分化：叶片愈伤组织增殖的培养基为m s + 2 0m g l 6 - b a + 0 1m g l2 , 4 - d + 0 0 5m g ln a a ，增殖率为8 6 2 1 ；愈伤组织分化芽的最适 培养基为m s + i 0m g l6 - b a + i 0m g ln a a ，出愈率达6 5 0 0 ，但分化出的芽苗较 纤细，不易于作生根培养。 6 腋芽的增殖培养：茎段腋芽增殖的最佳培养基为m s + i 0m g l6 - b a + 0 1m g l n a a + 0 5m g li b a ，3 0d 后增殖倍数为5 8 3 ，有效苗长势良好。 7 生根培养：最适宜于生根培养的培养基为1 2 m s + i b a0 1m g l + 活性炭l o g l ，生根率达7 1 3 6 ，平均生根数为5 1 3 条，平均根长达3 5 7c m 。 8 炼苗移栽：麻叶绣线菊的组培苗移栽以珍珠岩、蛭石、河沙( 1 ：1 ：1 ) 的比例 混合为最佳，移栽成活率最高，达8 0 0 0 ，苗木生长健壮。 关键词：麻叶绣线菊茎段叶片组织培养植株再生 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 a b s t r a c t t h i s p a p e rm a i n l yd e a l tw i t ht h es t u d yo ns t e m sa n dl e a v e sa se x p l a n t sf o r r e g e n e r a t e dp l a n t l e t so fs p i r a e ac a n t o n i e n s i s b ym e a n so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a l d e s i g na n ds t a t i s t i c a la n a l y s i sm e t h o d ，t h ea f f e c t e df a c t o r s ，e x i s t i n gp r o b l e m so f p r o p a g a t i o na n dt h er e l e v a n ts o l u t i o n sw e r ed i s c u s s e d ；t h et e c h n i q u es y s t e mo ft i s s u e c u l t u r ew a se s t a b l i s h e dw i t hb e s tc u l t u r em e d i u ma n dp r o c e d u r e t h em a i nr e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ： 1 m a yw a st h eb e s ts e a s o nf o re x p l a n t st a k i n go ns p i r a e ac a n t o n i e n s i s t h ei n i t i a t i o n r a t ec o u l db eu pt o8 2 5 0 t h ec o n t a m i n a t e dr a t ew a s3 2 5 0 2 f o rd i s i n f e c t i o no 1 s o l u t i o no fh g c l 2f o r5m i n u t ew a st h eb e s tt os t e m s t h e g e r m i n a t i o nr a t ea n dc o n t a m i n a t e dr a t es e p a r a t e l yw e r e7 3 3 3 a n d1 3 3 3 0 1 s o l u t i o n o fh g c l 2f o r3m i n u t ew a st h eb e s tt ol e a v e s t h eg e r m i n a t i o nr a t ea n dc o n t a m i n a t e dr a t e s e p a r a t e l yw e r e4 3 3 3 a n d4 0 0 0 3 b u d si n d u e t i o no fs t e m s t h ee x p l a n t sw e r es t e m si nt h i sy e a r t h eb e s ti n i t i a t i o nm e d i u mf o rs t e m sw a sm s m e d i u m 埘廿16 - b a2 0m g la n dn a ao 1m g l ，t h ei n i t i a t i o nr a t ew a s8 4 71 ，a n dt h e a v e r a g eh e i g h to f s h o o t sr e a c h e d2 10 c m 4 c a l l u si n d u c t i o no fl e a v e s t h ee x p l a n t sw e r en e wl e a v e si nm a r c h m sm e d i u ma d d i n g6 - b a1 0 m g l ，n aa 0 5 0m g la n d2 ，4 一d0 0 5m g lw a sc a l l u si n d u c e df r o ml e a v e s ，t h ei n d u c t i o nr a t ew a s 5 8 18 ，a n dt h ec a l l u sw a sy e l l o w g r e e na n dc l o s e 5 p r o l i f e r a t i n ga n dd i f f e r e n t i a t i n gc u l t i v a t i o no fc a l l u s h i g h l yp r o l i f e r a t i n gc a l l u sw a so b t a i n e df r o mt h el e a v e sf o l l o w i n gc u l t i v a t i o no nm s m e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t h6 - b a2 0m g l ，2 , 4 - do 1m g la n dn a ao 0 5m g l t h e p r o l i f e r a t i n gr a t e sc o u l db eu pt o8 6 21 t h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rc a l l u sb u d s d i f f e r e n t i a t i n gw a sm sw i t h6 - b a1 0m g la n dn a a1 0m g l t h er e g e n e r a t i n gr a t e w a s6 5 0 0 b u tt h es h o o t sw e r et e n u o u sa n dw e r e n ts u i t a b l ef o rr o o t i n g 6 s p r o u tp r o l i f e r a t i n gc u l t i v a t i o n t h eo p t i o n a lp r o l i f e r a t i n gb u d sc u l t u r em e d i u mf r o ms t e m sa n ds h o o t sw a sm s 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 s u p p l e m e n t e d 谢t l l6 - b a 1 0m g l ，n a ao 1 m g la n di b a0 5m g l ，o nw h i c h p r o l i f e r a t i o nr a t ew a s5 8 3t i m e sa f t e r3 0 d 7 r o o t i n gc u l t u r e r e g e n e r a t e ds h o o t sc o u l dp r o d u c er o o t si n1 2m sm e d i u mc o n t a i n i n gi b ao 1m g l a n da co 1 ，i nw h i c ht h er o o t i n gr a t ew a s7 1 3 6 ，t h ea v e r a g en u m b e ro f r o o t sw a s5 13 ， t h ea v e r a g el e n g t ho fr o o tw a s3 5 7c m 8 t r a n s p l a n t i n g p l a n t l e t sw e r et r a n s f e r r e dt ot h em e d i u mw i t l lr a t i oo fl ：1 ：1o fv e r m i c u l i t ea n dr u b y m i c aa n ds a n d s ，t h es u r v i v a lr a t ec o u l dr e a c h8 0 0 0 ，a n dt h es e e d l i n g sg r e wv e r yw e l l k e yw o r d s ：s p i r a e ac a n t o n i e n s i s ；s t e m s ；l e a v e s ；t i s s u ec u l t u r e ；p l a n tr e g e n e r a t i o n 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 砝兰 腑乡月c ) 7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： 谚三 沁皆毛目习b 挑为每6 乒刁日 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 1 前言 麻叶绣线菊( s p i r a e ac a n t o n i e n s i sl o u t ) 为蔷薇科( r o s a e e a e ) 绣线菊亚科 ( s p i r a e o i d e a e ) 绣线菊属( s p i r a e a ) 植物。绣线菊属植物多为伞形、伞形总状或圆 锥花序，生性强健，具有耐寒、耐旱、繁殖简便等优点，适宜多种用途栽培观赏( 谢 华辉等，2 0 0 6 ) 。该属植物花色艳丽，花朵繁茂，盛开时枝条被细巧的花朵所覆盖， 形成一条条拱形花带，观赏价值高。适于在城镇园林绿化中应用，可布置广场，作居 民区绿化，布置小品。在现代城市林业和生态园林建设迅速发展的今天，开发利用绣 线菊这一珍贵的园林植物资源具有较大的意义。 2 文献综述 2 1 麻叶绣线菊的形态学特征 灌木，高达1 5m ；小枝细瘦，圆柱形，呈拱形弯曲，幼时暗红褐色，无毛；冬 芽小，卵形，先端尖，无毛，有数枚外露鳞片。叶片菱状披针形至菱状长圆形，长3 5c m ，宽1 5 2c m ，先端急尖，基部楔形，边缘自近中部以上有缺刻状锯齿，上面 深绿色，下面灰蓝色，两面无毛，有羽状叶脉；叶柄长4 - 7 咖，无毛。伞形花序具 多数花朵；花梗长8 - - - - 1 4m m ，无毛；苞片线性，无毛：花直径5 7i i l m ；萼筒钟状， 外面无毛，内面被短柔毛；萼片三角形或卵状三角形，先端微凹或圆钝，长与宽各约 2 5 4 衄，白色；雄蕊2 0 - - - 2 8 ，稍短于花瓣或与花瓣等长；花盘由大小不等的近圆 形裂片组成，裂片先端有时微凹，排列成圆环形；子房近无毛，花柱短于雄蕊。瞢荚 果直立开张，无毛，花柱顶生，常倾斜开展，具直立开张萼片。花期4 - - 5 月，果期 7 9 月( 中国科学院中国植物志编辑委员会，1 9 8 5 ) 。 2 2 绣线菊属植物的地理分布 绣线菊属植物全世界约有1 4 5 种，主产欧亚和北美。亚洲约有1 2 0 种，东亚8 8 种， 北亚3 0 种，南亚2 4 种，西亚7 种，东南亚1 种，北美2 6 种，欧洲1 8 种( 陆玲娣，1 9 9 6 ) 。 绣线菊生态适应性强，能适应湿润和干寒气候条件，故而分布广泛，分布最北界可达 北极圈，达西伯利亚楚科奇地区，最南界可达我国海南北部，如光叶绣线菊( 王铁娟 等，2 0 0 1 ) 。 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 我国是绣线菊属植物的现代分布和分化中心，拥有丰富的该属植物资源( 金雅琴， 2 0 0 4 ) 。分布于陕西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、湖北、四川、贵州、云南、 内蒙古等省区，约7 0 余种( l ul i n g d i ，2 0 0 3 ) 。按照吴征镒( 1 9 7 9 ) 对中国植物区系的 区划，中国绣线菊属在各亚区的分布依次是：欧亚森林植物亚区8 种，亚洲荒漠植物 亚区1 种( 特有种1 ) ，欧亚草原植物亚区2 种( 特有种1 ) ，青藏高原植物亚区1 种，中国 一喜玛拉雅森林植物亚区2 9 种( 特有种2 6 ) 和中国一日本森林植物亚区2 9 种( 特有种 1 8 ) 。通过对这些种类在我国各植物亚区的分布情况进行统计和分析，表明东亚区中 的中国一喜玛拉雅森林植物亚区和中国一日本森林植物亚区的种类和特征种均最多， 且类型齐全。在这两亚区中种类分布不均衡，以川西最多，其它地区依次是滇西北、 甘东南、陕南、豫西南、晋南、藏东等地。 2 3 绣线菊属植物的园林应用研究 2 3 1 营造专类园 绣线菊属植物种质资源丰富，分布区广泛，从热带到温带都有自然分布。其株型 高低变异较大，花色各异，有白色( 石蚕叶绣线菊、毛花绣线菊、华北绣线菊、麻叶 绣线菊等) 、红色( 金焰绣线菊) 、粉红色( 柳叶绣线菊) 等。花期从早春到春秋不一， 如单瓣李叶绣线菊花期2 4 月，麻叶绣线菊花期4 5 月，中华绣线菊花期5 7 月， 粉花绣线菊花期6 7 月等。利用这些种间的差异，可以布置植物园、森林公园、高 等学校或科研机关，形成专类园区，使其成为一个很好的游赏性专类园，同时又是一 个很好的科普性教育基地。 南京中山植物园5 0 年代就开始引进收集绣线菊属植物，保存有2 7 种3 变种( 中国 科学院植物所，1 9 5 9 ) 。北京植物园也开展了绣线菊属植物的引进工作，收集有3 3 种6 变种( 中国科学院植物所，1 9 5 9 ) ，成为国内开展绣线菊属植物工作较好的地区。 其它地区如上海、昆明、杭州、常熟、宁波等地开始了绣线菊属植物的收集保存工作。 2 3 2 营造花篱、花境 绣线菊属植物为落叶灌木，高一般为l 1 5m 。枝条细长且萌孽性强，可代替 女贞、黄杨用作绿篱，起到阻隔作用，又可观花。由于其花期长，又可以用作花境， 形成美丽的花带。珍珠绣线菊生长快，萌蘖性强，耐修剪，秋天叶色多变化，是作为 2 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 彩叶篱的最佳材料( 田立明等，2 0 0 7 ) 。华北绣线菊亦可作花篱栽植( 徐倩，2 0 0 7 ) 。 2 3 3 构建园林主景 在城市园林植物造景中，绣线菊属植物可以丛植于山坡、水岸、湖旁、石边、草 坪角隅或建筑物前后，起到点缀或映衬作用，构建园林主景。初夏观花，秋季观叶， 构筑迷人的四季景观。如鄂西绣线菊，柳叶绣线菊，欧亚绣线菊。 2 3 4 盆栽或切花生产 绣线菊属植物因花色娇艳夺目还可以用作切花生产。应用绣线菊类植物作成花 束、花篮或花瓶。我国绣线菊属植物资源相当丰富，但是绣线菊属植物作为一种难得 的切花材料用于商业性切花生产尚不多见。春夏之交，绣线菊属植物可用来点缀五一 节、儿童节等大型节日，颇有利用价值。此外，绣线菊属植物抗逆性强，耐旱耐寒， 亦无病虫害，栽培管理方便。 2 3 5 色叶植物或地被材料 现代城市园林绿化建设中，彩色植物的应用越来越受到人们的重视，但是目前的 彩色园林植物种类仍然较少，色调也较单一。绣线菊属植物的部分种类已经培育出一 些彩色叶品种，如金焰绣线菊、金山绣线菊、魔毡绣线菊，另外还有珍珠 绣线菊是秋季观叶灌木，秋色叶为橘红色( 田立明等，2 0 0 7 ) 。这些植物在园林中可 丛植、孤植、列植，或作为地被材料等，丰富园林中的色彩。 2 4 绣线菊属植物的繁殖技术研究 2 4 1 播种繁殖 本属植物的种子一般2 , - - , 3a 开始开花结实，4a 以后可以正常结实。果实为瞢荚 果，当果实黄褐色并有少量开裂时即可采种。种子不可过分干燥，以免丧失生命力。 脱粒后应装入布袋或纸袋，放在阴凉干燥处于藏，如长期存放应密封在干燥器中低温 贮藏( 0 - - , 5 * ( 2 ) 。隔年播种发芽率仍可达到7 0 8 0 ( 国家林业局国有林场和林木种苗 工作总站，2 0 0 0 ) 。孙喜庆等( 2 0 0 0 ) 对珍珠绣线菊采用湿沙催芽的方法进行育苗。1 2 0 的高温处理对柳叶绣线菊的种子发芽有一定促进作用( 宋红，1 9 9 6 ) 。王忠海等( 2 0 0 2 ) 3 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 对珍珠绣线菊通过定植母树下种育苗试验，结果表明，利用母树下种和庇荫条件，可 提高育苗出苗率和成苗率技术。郁永英等( 2 0 0 5 ) 对金焰绣线菊进行播种研究，种子 在腐殖土、草炭、细沙( 3 ：3 ：1 ) 的基质中，1 个月后，小苗即可长出3 - - - 4 片真叶。 播种繁殖的出苗不整齐，且受播种时间的影响很大。 2 4 2 扦插繁殖 扦插成活率嫩枝明显优于硬枝，嫩枝中又以带踵插穗为最佳。扦插成活率因生长 调节剂的种类及浓度、插穗部位、扦插基质的不同及环境条件不同有明显差异。 罗凤霞( 1 9 9 9 ) 等对日本绣线菊扦插繁殖作了研究，结果表明，n a a ，i b a 以及n a a 和i b a 混合液都具有良好效果，但以i b a 的效果最佳。郭晓凡( 2 0 0 0 ) 总结了粉花绣线菊 嫩枝扦插育苗技术，将剪好的插穗基部浸泡在5 0 - - - 1 0 0m g k g 的n a a 中1 2 2 4h ，插 后架设遮阳网( 透光度5 0 ) ，成活率在9 0 以上。雷海清等( 2 0 0 4 ) 对金焰绣线菊嫩 枝扦插繁殖技术的研究结果表明，金焰绣线菊的生根率因生长调节剂的种类及浓度、 插穗部位、扦插基质的不同有明显差异。金焰绣线菊嫩枝扦插是一项适于生产中推广 应用的繁殖技术。余杨春等( 2 0 0 6 ) 对南川绣线菊的硬枝扦插试验结果表明a b t 处理 的插穗各项指标均优于水处理的插穗，扦插2 个月时，与水处理相比，a b t 处理插穗 生根期早7 1 1d ，生根率高1 6 。徐倩等( 2 0 0 7 ) 对华北绣线菊的嫩枝扦插繁殖进行 了研究，结果表明，华北绣线菊的生根率因生长调节剂的种类及浓度、插条采集部位 与长度、扦插基质的不同有显著差异；适宜的环境条件和合理的管理措施可以提高扦 插生根率。雷海清等( 2 0 0 7 ) 在全自动微喷扦插装置下，应用a b t1 号、i b a 、n a a 等3 种药剂处理金山绣线菊扦插材料，其中以采用a b t1 号1 0 0m g l 药液浸泡插条lh 处理 效果最佳，采用枝条梢部并以河沙、黄心土( 1 ：1 ) 作为扦插基质效果最佳。扦插繁殖 易受母株数量的限制，繁殖系数低，不适合珍贵品种的快速推广和濒危品种的保护。 2 4 3 分株繁殖 绣线菊属植物可在较短的时间内形成球状丛生株，分株繁殖于每年1 0 - - - 1 2 月进 行为好。分株通常是在移栽时将孽条分离母株另行栽植( 艾金才，2 0 0 1 ) 。但分株繁 殖影响苗木的生长，且繁殖系数低，不适宜于大规模的商业生产。 2 4 4 组织培养 4 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 李云峰等( 1 9 8 7 ) 研究日本绣线菊( s p i r a e a j a p o n i c a ) 的组织培养时指出，在增 殖和诱导生根的过程中，在培养基中附加g a2m g l 可使植株生长健壮，根系发达， 成活率有很大的提高。y a n ga n dr e a d ( 1 9 9 0 ) 对绣线菊的茎段进行离体培养，发现在l s 培养基中附加b a0 5m g a _ 。，n a ao 1m e a l 和t d z0 5m g l 的离体培养再生能力强， 增殖培养中b a 的增殖效果强于g a s 。胡益明等( 2 0 0 1 ) 选取星花绣线菊( s j a p o n i c av a t s t e l l e r i s ) 的茎段、茎尖、叶片和叶柄进行愈伤组织的诱导，得到茎尖的诱导效果最 佳，茎段、叶柄次之，而叶片的诱导效果最差。同时发现丛生芽出现玻璃化现象，将 6 - b a 由2m e t , 降低到0 2 5m e e t , 并转入新鲜培养基中，玻璃苗消失呈正常生长。胡 益明等( 2 0 0 1 ) 通过用m s 、6 ，7 一v 、b 5 等3 种不同的培养基对粉花绣线菊( j a p o n i c a v a t f o r t u n e i ) 植株的茎尖、嫩叶、叶柄等进行愈伤组织诱导和成苗诱导，得到m s 培 养基诱导愈伤效果最好，在m s + 2 ，4 一d2 0m g l + k to 3m g l 培养基中，以茎尖外植 体诱导的效果最好。李瑜明等( 2 0 0 5 ) 以金焰绣线菊( sb u m a l d a g o l d e nf l a m e ) 和金 山绣线菊( & b u m a l d a g o l d e nm o u n d ) 的春季幼嫩茎尖与秋季半木质化枝条为外植 体，指出在含有b a 的培养基中，愈伤化较严重，继续培养，出现玻璃化现象，在含 用k t 的培养基中，愈伤化较轻，继续培养，发生玻璃化较轻。 另外，该属植物中的柳叶绣线菊( s a l i c i f o l i a ) ( 董雅茹等，1 9 9 4 ) 、椭圆叶绣线 菊( sj a p o n i c av a t o v a l i f o l i a ) ( 赵沛基等，2 0 0 4 ) 、金叶绣线菊( j a p o n i c a ) ( 张立 磊等，2 0 0 5 ) 、红花绣线菊( & j a p o n i c a ) ( 姚军等，2 0 0 7 ) 和绣球绣线菊( b l u m e i ) ( 季昆等，2 0 0 8 ) 都已成功建立了组织培养体系。 绣线菊属植物的组织培养主要致力于以下几个方面的研究：( 1 ) 外植体的选择。 外植体的选择是组培快繁成功与否的关键因素。该属植物主要选用的外植体有茎段、 茎尖、叶片和叶柄。( 2 ) 培养基的类型和激素浓度配比。适宜的培养基是培养绣线菊 成功的基础，用于绣线菊组织培养的培养基主要是m s 培养基，且取得了较好的效果， 十分适合其组织培养。细胞分裂素应用最多的是6 一b a ，其次是k t ，生长素则多采用 n a a 、2 ，4 - d 和i b a 。一般较高浓度的细胞分裂素与生长素搭配，既能提高芽苗的增长 速度又能保证芽苗的健壮生长。 3 研究的目的和意义 麻叶绣线菊为一种优良的花灌木，花序密集，花色洁白，且于早春开放。具有较 5 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 高的观赏价值，在园林造景方面应用十分广泛，具有广阔的发展前景。既可作为观花 植物，又可作为配景材料。绣线菊常规繁殖方式为种子繁殖和扦插繁殖，但受季节的 限制，繁殖系数低，采用组织培养技术可在短期内得到大量试管苗，对进一步开发利 用绣线菊这一珍贵的园林植物资源有一定的意义。完善的组织培养技术不仅可以快速 繁殖其优良种苗，用于大面积人工栽培生产，可满足市场需求，还为下一步筛选优良 无性系，建立采穗圃奠定良好的基础，也可成为其新品种培育及生理生化机制研究的 重要手段。 本试验对麻叶绣线菊组培快繁技术进行探索，通过筛选出组织培养过程中各个 阶段较优的基本培养基、激素配比等一系列技术参数组合，以提高其增殖倍数，实现 麻叶绣线菊的快速无性繁殖，为今后实现麻叶绣线菊工厂化和商业化生产奠定技术基 础。 4 试验材料和方法 4 1 试验材料 采自四川农业大学校园内的麻叶绣线菊为组织培养试验材料。 4 2 技术路线 植 ，多r 乃1 = r 一 一增殖一 4 3 试验设计 4 3 1 外植体的选择 不同季节的外植体材料对试验结果影响很大，本试验选择麻叶绣线菊的茎段及叶 片作外植体，在预备实验阶段进行外植体的选取。茎段的采集：在3 月、5 月、7 月、 1 0 月、1 2 月，取生长旺盛、无病虫害、健壮的麻叶绣线菊茎段为外植体材料，以确 6 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 定最佳的取材季节。新梢嫩叶的采集时间为3 月。 4 3 2 外植体的消毒与接种 消毒：将麻叶绣线菊的茎段、叶片加入洗洁剂浸泡，用毛笔刷净，清洗5 6 次 后，流水中再冲洗2h 左右，滤干，在超净工作台上用7 0 的酒精浸泡3 0s ，无菌 水冲洗干净，o 1 的升汞( 滴1 滴土温一8 0 ) 消毒，茎段消毒设时间梯度3 、5 、8 、 1 0m i n ，叶片消毒设时间梯度为1 、2 、3 、4 、5m i n ，最后用无菌水反复冲洗，滤去 无菌水后作接种用。 接种：在超净工作台上将茎段切成1c m 左右，叶片1c m 2 左右，接种于启动培 养基上，2 0d 后统计不同消毒时间的污染率、枯死率、存活率、诱导率，选择最优 接种方案。 4 3 3 初代培养 4 3 3 1 带芽茎段有效芽的诱导 接种外植体：带芽茎段 基本培养基：m s 、1 2 m s 、b 。 生长调节剂：6 - b a 、n a a 试验采用三因素三水平试验设计( 表1 ) ，每处理接种2 0 个外植体，各处理重复 3 次。 表1 带芽茎段有效芽诱导的正交试验设计及实施方案b ( 3 ) t a b l e1o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo fb u d si n d u c t i o no fs t e m sl 9 ( 3 4 ) 7 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 4 3 3 2 叶片愈伤组织的诱导 接种外植体：新梢嫩叶 基本培养基：m s 生长调节剂：6 一b a 、2 ，4 - d 、n 从 试验采用三因素三水平试验设计( 表2 ) ，每处理接种2 0 个外植体，各处理重复 3 次。 表2 叶片愈伤组织诱导的正交试验设计及实施方案1 9 ( 3 4 ) t a b l e2o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo fc a l l u si n d u c t i o no fl e a v e sl 9 ( 3 4 ) 4 3 4 继代增殖和分化培养 4 3 4 1 愈伤组织增殖培养 基本培养基：m s 生长调节剂：6 一b a 、2 ，4 一d 、n 从 将初代培养产生的愈伤组织转接到增殖培养基上，使愈伤组织进一步大量生长。 试验采用三因素三水平正交试验设计( 表3 ) ，每处理接种2 0 块1 0c m 2 大小的愈伤 组织，各处理重复3 次，3 0d 时统计其增殖倍数。 4 3 4 2 愈伤组织的分化培养 基本培养基：m s 8 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 生长调节剂：6 一b a 、n a a 将增殖后的愈伤组织转接到分化培养基上，使愈伤组织分化成苗。试验采用二因 素三水平试验设计( 表4 ) ，每处理接种2 0 块愈伤组织，各处理重复3 次，3 0d 后统 计其分化倍数。 表3 叶片愈伤组织增殖的正交试验设计及实施方案1 9 ( 3 4 ) t a b l e3o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m ef o r c a l l u sp r o l i f e r a t i o nl 9 ( 3 4 ) 表4 愈伤组织分化的正交试验设计及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e4o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m ef o rc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nl 9 ( 3 4 ) 9 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 4 3 4 3 带芽茎段芽增殖培养 接种外植体：带芽茎段 基本培养基：m s 生长调节剂：6 一b a 、n a a 、i b a 试验采用三因素三水平正交试验设计( 表5 ) ，每处理接种2 0 个外植体，各处理 重复3 次。 表5 带芽茎段芽增殖的正交试验设计及实施方案l 9 ( 3 4 ) t a b l e5o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m es h o o tp r o l i f e r a t i o nl 9 ( 3 4 ) 4 3 5 生根与壮苗培养 基本培养基：m s 、3 4 m s 、1 2 m s 、1 4 m s 生长调节剂：i b a 、n a a 将长至3 - 4c m 高的小芽，接种于生根壮苗培养基中，以使其根芽成比例的生长。 试验采用四因素四水平的正交试验设计( 表6 ) ，每处理接种外植体为2 0 个，重复2 次，观察其生根率、平均根数、平均根长及其生根情况。 4 3 6 练苗与移栽 材料：瓶苗得到的带根健壮苗 基质：珍珠岩、蛭石、河沙 将生根的瓶苗转移到室温条件下，揭去封口膜，放置3d ，用镊子轻轻将苗取出， 1 0 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 在水中清洗掉根部的培养基，晾干即可栽入以下不同的基质中( 表7 ) ，观察麻叶绣 线菊组培苗的生长情况。 表6 生根壮苗试验的正交试验设计及实施方案l 。( 4 5 ) t a b l e6o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f r o o t i n gl 1 6 ( 4 5 ) 表7 不同基质对炼苗移栽成活率的影响 t a b l e7t h ee f f e c to fl i v i n gr a t eo fd i f f e r e n tm e d i u mo nd o m e s t i c a t i o n 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 4 4 培养条件 外植体接种后均置于1 2h d 的光照条件下培养，光强度3 0 4 0p m 0 1 m - l s ，温度 2 5 ( 士2 ) ，p h 值5 8 - - - 6 0 。 5 试验结果资料统计与分析方法 5 1 外植体的处理 将外植体接入在预备实验时选定的培养基中，通过不同的处理方式，观察其生长 状况并统计污染率和成活率数，每2d 观测一次，观测期为2 0d 。 不同消毒时间的污染率= ( 污染的外植体数接种外植体总数) 1 0 0 成活率= ( 成活的外植体个数接种后未污染的外植体总数) x1 0 0 5 2 启动培养 在培养启动的试验中，每5d 观测一次，观测期为3 0d 。统计带芽茎段、叶片 的启动率和形成部位，愈伤组织的颜色、形状。 茎段启动率= ( 腋芽已萌发的带芽茎段数量接种的茎段数量) x1 0 0 叶片启动率= ( 体积膨大的叶数量接种叶数量) 1 0 0 5 3 不定芽的诱导及愈伤组织的增殖与分化 在不定芽的诱导过程中，每隔3d 进行观测一次，观测期为3 0d 。取带芽的茎 段接种在增殖培养基中，统计诱导出芽的带芽茎段数量( 芽按照长度大于1 0c m 统 计，即为有效芽) ，计算出每个处理有效芽的诱导率，统计有效芽总数，计算增殖倍 数。将增殖后的愈伤组织接种于诱导分化培养基上，3 0d 后统计其分化率。 有效芽诱导率= ( 诱导出芽的茎段数量接种带芽茎段数量) 1 0 0 增殖倍数= 有效芽总数( 大于1 0c m 的芽苗) 接种带芽茎段数量 愈伤组织增殖倍数= 增殖愈伤组织数( 直径2 0c m ) 接种愈伤组织数 再生率= ( 再生不定芽的愈伤组织数接种愈伤组织数) x 1 0 0 5 4 生根培养。 在生根培养过程中，以根长达到2 0c m 的根为有效根，观察根的生长状况并计 算每个处理的生根率、每株苗的平均生根数、平均根长和每个处理根诱导时间。观察 期为3 0d 。有关指标的计算公式如下： 生根率= ( 生根苗数成活苗数) 1 0 0 1 ， 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 平均根数= ( 生根总数生根苗数) 1 0 0 平均根长= ( 生根单苗根总长生根单苗根总数) 1 0 0 5 5 炼苗与移栽 观察内容：3 0d 后各处理的成活植株总数，移栽成活苗的生长情况。 成活率= ( 3 0d 时成活植株总数移栽植株总数) 1 0 0 5 6 数据统计分析方法 试验数据通过s p s s1 3 0 和e x c e l2 0 0 3 两种软件进行方差分析及多重比较。 6 结果和分析 6 1 不同消毒时间对茎段和叶片的影响 0 1 的升汞对麻叶绣线菊茎段的灭菌效果见表8 。 表8 不同消毒时间对茎段灭菌的影响 t l b l e8e 丘e c to fd i s i n f e c t i o ns t e m si nd i f f e r e n td i s i n f e c t i o nt i m e s 入 久 。 r ? j ， k 、一；。、 3581 0 乃谐卵搁缸n ) 图l 灭菌时间对茎段污染率和启动率的影响 f i g 1e f f e c to fd i f f e r e n td i s i n f e c t i o no ni n i t i a t i o na n dc o n t a m i n a t i o no fs t e m s 1 3 o 一()糌求陋 麻叶绣线菊组织培养植株再生体系的研究 从表8 和图l 可看出，麻叶绣线菊茎段在不同灭菌时间的处理中，启动率随 着处理时问的增加表现出先升高后下降的趋势，5r a i n 处理的启动率最高，为 7 33 3 ，1 0 m i n 的启动率最低，为2 33 3 。而对于污染率，3 m i n 处理的茎段污 染率最高达8 33 3 ，5 m i n 处理次之，1 0 r a i n 处理的茎段污染率最低。表明1 0 m l n 的灭菌时问虽然灭菌很彻底，但由于处理时间过长，对外植体产生了较大的毒害 作用。综合污染率和启动率两个指标，5m i n 处理的茎段效果最好。 01 的升汞对麻叶绣线菊叶片的灭菌效果见表9 。 表9 不同消毒时间对叶片灭菌的影响 t a b l e9e f i e c to f d i s i n f e c t i o nl e a v e sj nd i f f e r e n td i s l n f e e t i o nt i m e s 主萎 灭l 翔, j i l l ( i 】i n ) 圈2 灭菌时同对叶片污染率和启动率的影响 f i g2e f f e c to f d i f f e r e n td i s i n f e c t i o no ni n i t i a t i o na n dc o n t a m i n a t i o no f l e a v e s 从表9 和图2 可看出，麻叶绣线菊叶片在不同火菌时问的处理中，启动率在 2 m i n 处理时最高，为4 66 7 ，5 m i n 的肩动率最低，为l33 3 。而对于污染率， 1m i n 处理的茎段污染率最高达8 00 0 ，2m i n 处理次之，5m i n 处理的叶片污染 习 劬帅曲蚰砷m o ()h装 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 率最低。2m i n 时的启动率高，污染率也高，可能是由于材料幼嫩不易表面灭菌， 应注意灭菌时间的掌握。综合污染率和启动率两个指标，3m i n 处理的叶片效果 最好。 6 2 外植体取材季节的选择 8 差 3 月5 月7 月 1 0 月1 2 月 图3 不同取材季节对外植体的启动和污染的影响 f i g 3e f f e c to fd i f f e r e n ts e a s o n so ni n i t i a t i o na n dc o n t a m i n a t i o no fe x p l a n t s 从图3 可以看出，不同的取材时间对茎段萌芽率有较大的影响，对于启动率 来说，呈先升高后降低趋势，5 月启动率可达8 2 5 0 。对于污染率来说，7 月份 污染率较高，达4 2 5 0 。分析其原因可能为：5 月枝条进入旺盛生长期，生理活 性较强，体内营养物质积累较多，故启动率高。7 月启动率有所下降，可能是植 物体内出现生长抑制剂或植物本身的内源激素所致，而污染率高可能是由于外植 体长时间暴露在外尘埃积累所致。综合考虑污染率和启动率这两项指标，5 月份 为较适宜的取材时间。 6 3 初代培养 6 。3 。1 带芽茎段有效芽的诱导 茎段培养1 周左右，腋芽开始萌动( 图版2 ) ，再培养3 周后可形成1 2c m 的 芽，3 0d 后统计芽的诱导率，试验结果见表1 0 。 踟 加 o 麻叶绣线菊组织培养及植株再生体系的研究 表1 0 麻叶绣线菊初代芽诱导的试验结果及多重比较 t a b l e10e x p e r i m e n t a ld a t ao f b u d si n d u c t i o no fs t e m sa n dm u l t i p l ec o m p a r i s o n s 4 6 6 7d e 7 5 8 6b b 5 1 7 2d d 5 0 o od d e 8 4 7 la a 6 1 6 7c e 5 9 6 5c e 7 2 8 8b b 0 8 5 d f 1 8 6a b b 1 3 3c d 1 3 7c d 2 1 0a a 1 ：4 6b e e 1 1 5c d e 1 9 6a b 96 0 3 8 6 3 3 3c c1 3 7c d 注：显著性检验，字母相同者差异不显著。小写字母表示o 0 5 水平上显著，大写字母 表示0 0 1 水平上显著。( 下同) n o t e ：d u n c a n s 7 sm u l t i p l er a n g et e s t ，t h es a m el e t t e r si n d i c a t en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e t h e s m a l ll e t t e r si n d i c a t et h es i g n i f i c a n c ea to 0 5l e v e l ，t h ec a p i t a ll e t t e r si n d i