（生物化学与分子生物学专业论文）扩展青霉脂肪酶的定点突变及随机突变.pdf

扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 英文缩写蓖文全称 a m p a p s e b e d 删 d n t p d g t p d t t i p t g k b k d a r p n l s d s s d s 。p a g e t e m e d t r i s x g a y n b 英文缩略词表 a m p i c i l l i n a n l l n o n i t l mp e r s u l f a t e e t h i d i u mb r o m i d e e t h ) 7 l e n td i a m i n ct e t r a c e t i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d e o x y g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e d i t h i o t h r e i t o l i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o s i d e k i l ob a s e k i l od a l t o n s r e v o l u t i o np e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y a c r ) , l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e i l l y i e n e d l a n l i n e t r i ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o 4 。c h l o r o 3 i n d o l y l - 0 一d g a l a c t o s i d e ) e a s tn i t r o g e nb a s e 7 8 中文名称 氨苄青霉索 过硫酸铵 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 脱氧核苷三磷酸 脱氧鸟苷三磷酸 二硫苏糖醇 异丙基b d 硫代 半乳糖苷 千碱基 于道尔顿 每分钟转速 十二烷基硫酸钠 s d s 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 溴4 氯3 一吲哚，b d - 半乳糖苷 酵母氮碱 内容提要 本研究利用定点突变和随机突变的技术手段，对扩展青霉脂肪酶( p e n i c i l l i m 7 e x p ( 1 7 l y l t t l ll i p a s e ，p e l ) 进行了最适作用温度、高温稳定性及低温适应性的蛋自 质工程改造结果如下： 1 、p e l 基因的定点突变 采用重叠延伸p c r 的方法对p e l 基因进行了e 8 3 v 、t 8 8 p 、k 2 2 6 r 、e 5 4 p 的 定点突变利用大引物p c r 的方法进行了e 2 1 4 p 的突变。突变基因在毕赤酵母g s l l 5 中表达，对突变体的最适作用温度和热稳定性的研究结果表明：突变体 p e l e 8 3 v ，g s 的最适作用温度提高了5 0 ，其比活约为野生型的2 倍，热稳定性 略有下降。说明r 突变后疏水性较强的氨基酸v a l 可能增加了酶分子的表面疏水性， 从而提高酶分：f 的疏水性包装效率；突变体p e l - e 2 1 4 p g s 的最适作用温度比野生 型提高了75 ，热稳定性也提高了24 ，体现了p r o 对热稳定性的特殊贡献：突 变体p e l t 8 8 p g s 的最适作用温度比野生型提高了2 , 5 ，但热稳定性无明显变化， 而点e 5 4 p 突变后则完全失去酶活；突变体p e l k 2 2 6 r g s 的最适作用温度比野生 型提高r5 0 c ，但热稳定性和酶活有所下降。说明了a r g 替换l y s 后，脂肪酶与底 物可能形成了额外的氢键，但同时也可能形成了空间位阻。 2 、p e l 基因的随机突变 用易错p c r 的定向进化技术手段对p e l 基因进行了随机突变，p c r 产物与载 体p p | c 35 k 构建重组表达质粒，转化大肠杆菌构建突变文库。突变文库的混合质 粒电转化毕赤酵母，通过对7 0 0 0 个重组菌的筛选，第一轮筛选出6 0 个克隆子，然 后进行第二轮摇瓶发酵复筛，得到一株低温适应性的突变体e p 3 3 其最适作用温度 为oo c 下降了1 ( ) oo c ，其热稳定性也表现出低温酶的特性。核苷酸序列分析结 果表明：6 ( 】1 位的c 突变为g ，6 0 3 位的c 突变为g ，即p e l 基因1 6 3 位的艮o ( c c c ) 突变为a l a ( g c g ) 。 关键词：扩展青霉脂肪酶定点突变，随机突变，最适作用温度，热稳定性 扩展青霉脂肪酶的定点突变和髓机突变 a b s t r a c t i no r d e rt oi m p r o v et h ec h a r a c t e r i z eo ft h ep e n i c i l l u me x p a n s u ml i p a s e ( p e l ) ，t h e p e lg e n ew a sm u t a t e db ys i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sa n dr a n d o mm u t a g e n e s i su s i n g e r r o r - p r o n ep c rt e e l m i q u e ，a n dt h er e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w 1s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fp e l e 8 3 v 、t 8 8 p 、k 2 2 6 r 、e 5 4 pa n de 2 1 4 pw e r em u t a t e d b ys i t e - d i r e c t e dm n t a g e n e s i s u s i n go v e r l a pe x t e n s i o np c rt e c h n i q u ea n dm e g a p r i m e rp c rm e t h o dr e s p e c t i v e l y t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i dp e l p p i c 3 5 kc o n t a i n i n g m u t a n t g e n e s w e r ec l o n e di n t o e v c k e r i c h i ac o l it g ls t r a i na n de x p r e s s e di np i c h i ap a s t o n sg s l l 5s t r a i n t h e c o m p a r i s o nr e s u l t so ft h em u t a n t sw i t ht h ew i l d t y p ep e ls h o w e dt h a t ：( 1 ) t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo ft h em u t a n tp e l - e 8 3 v - g s ( 4 5 o 1w a sh i g h e rb y5 0 * ct h a nt h a to ft h e 埘i dt 3 。p ep e l g s w h i l et h et h e r m o s t a b i l i t yo ft h em u t a n tw a ss i m i l a rt ot h ew i l dt y p e t h ec a t a l y t i ca c t i 、r i t yo f t h en m t a n tw a s1 8 88u r a g ，w h i c h ”r a sa b o u t2f o l d st h a to f t h e w i l dt y p ea tt h es a i n ec o u d i t i o n s ( 2 ) t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e l - e 2 1 4 p - g sv v a s i n c r e a s e db y75o ca u dt h et h e r m o s t a b i l i t ) o fp e l e 21 4 p g sw a sa l s oa b o u t2 4 。c l f i g h e rt h a nt h a to ft h ev , i l dt y p e t h es u b s t i t u t i o no fp r of o rg i na tp o s i t i o n2 1 4m i g h t i n t r o d u c eap y r r o l i d i n er i n ga tb t u r n s a n da ni n c r e a s eo ft h ef r e q u e n e yo fp r o l i n e o c c u r r e l c ea tb t 1 1 r l l sc o u l dm a k et h ep r o t e i ns t r u c t u r em o r er i g i d t h u se n h a n c e dt h e t h e r m o s t a b i l i t yo fp e l ；t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fp e l - t 8 8 p - g sw a si n c r e a s e db y25 ”ca n dt h et h e r m o s t a b i l i t 3 , o ft h i sm u t a n tw a ss i m i l a rt ot h ew i l dt y p e ，w h i l et h em u t a n to f p e l e 5 4 p - g sa h n o s tl o s ta l lt h ee n z y m a t i ca c t i v i t y ( 3 ) t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h e m n t a u tp e l k 2 2 6 r g s ( 4 50 c ) w a sh i g h e rb y50 ct h a nt h a to f t h ew i l dt y p ep e l - g s ， b u tt h e t h e r m o s t a b i l i t ya n dt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h em u t a u tw e r ed e c r e a s e d d r a m a t i c a l l y t h en u m b e ro fs a l tb r i d g eo nt h es u r f a c eo fp e la n dt h ea d d i t i o n a lh b o n d f o r m e db 3 a r g i n i n ec o u l db ei n c r e a s e db yt h es u b s t i t u t i o no ft h es e l e c t e dl y s i n eb y a r g i n i n e 、b u tt h ep o s i t i o no fs u b s t i t u t i m lm i g h tl e a dt os t e r i ch i n d r a n c eb 3 7t h eb i g g e r g r o u po fa r g i n i n e 2 芏垦童堡! ! 堕墅塑塞皇茎奎塑堕塑茎垩 2r a n d o mm u t a g e n e s i so f p e l g e n eb ye r r o r p r o n ep c r t h ep e l g e n ew a sm u t a t e db yr a n d o mm u t a g e n e s i su s i n ge r r o r p r o n ep c rt e c h n i q u e t m a m p l i f i e dd n af r a g m e n tw a sg e l p u r i f i e da n d c l o n e di n t ov e c t o rp p i c 3 5 ku s i n gt h e s n a bia n de c o rir e s t r i c t i o ns i t e sec e l lt g lw a su s e df o rt r a n s f o r m a t i o nw i t ht h e s e r e c o m b i n a n tp l a s m i d st oc o n s t r u c tt h em u t a n tl i b r a r y t h em u t a n tl i b r a r yw a st h e n t r a n s f o r m e dt op i c h i ap a s t o r i sg s l1 5a c c o r d i n gt ot h ee l e c t r o p o r a t i o nm e t h o df i r s t ，6 0 p o s i t i v ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e df r o ma m o n ga b o u t7 0 0 0t r a n s f o r m a n t so n ep o s i t i v ec l o n e o fc o l d - a d a p t a b i l i t y ( e p 3 3 ) w a so b t a i n e df r o mt h ef i r s t6 0p o s k i v ec l o n e sb yas e c o n d s e l e c t i o nt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h i sr a n d o mm u t a n tp e l - e p 3 3 g s ( 3 0 0 c ) w a s l o w e rb y10 0 t h a nt h a to ft h ew i l dt y p ew h i l et h et h e r m o s t a b i l i t yo ft h i sm u t a i l t e x p r e s s e di nt h et e r mo fl v a l u ew a s2 0o cd e c r e a s e ，o w i n gt ot h ei n c r e a s eo ft h e f l e x i b i l i t yo f p r o t e i ns t r u c t u r eo n l yo n ea m i n oa c i ds u b s t i t u t i o no f e p 3 3 ( p r 0 1 6 3 a l a ) t h a t w o u l dc o n t r i b u t et oi m p r o v i n gt h e s ef u n c t i o nw a si d e n t i f i e db yd n as e q u e n c i n g k e y w o r d ：p e n i c i l i t o ne x p a n s u ml i p a s e ，s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，r a n d o mm u t a g e n e s i s o p t i m u mt e m p e r a t u r e ，t h e r m o s t a b i l i t y 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 序言 蛋白质的热稳定性是其所有共价和非共价结合力的一个综合效应，影响因素较 多，包括疏水作用，盐键及氢键、共价键的稳定，增加包装效率，降低构象变化， 降低去折叠熵值以及a 螺旋、环等二级结构的稳定( j a s o ne t ，a l2 0 0 3 ) 。目前蛋白酶、 淀粉酶、脂肪酶等的蛋白质工程改造在国外得到非常广泛的研究并取得了令人瞩目 的成就。其中脂肪酶是一类具有重要应用价值的工业用酶。其在洗涤添加剂、有机 合成、皮革脱脂、造纸、医药等方面得到广泛的应用。国外的研究热点除了嗜高温 脂肪酶的菌种筛选外，主要集中在脂肪酶的基因克隆与表达、结构与功能、空间构 象、蛋白质工程改造等方面，并取得了一系列重要的研究进展，有些经过蛋白质工 程改造的脂肪酶已经进入工业生产阶段。相对而言，国内对脂肪酶的研究主要还是 集中在传统的菌种选育、分离纯化、酶学特性上，从分子生物学水平进行的研究不 多，而对脂肪酶的蛋白质工程改造的报道更少。 扩展青霉p f 8 9 8 是由出发菌株经多代诱变育种而获得的碱性脂肪酶高产菌株，可在 碱性条件下分解三酰甘油产生脂肪酸及甘油。其在洗涤剂添加剂、皮革毛皮绢纺脱脂、 生物制药等工业上有着广泛的应用。目前扩展青霉脂肪酶( p e l ) 已实现了工业化生产， 近年来本课题组完成了p e l 基因c d n a ( g e n b a n ka c c e s s i o n n oa f 2 8 4 0 6 4 ) d 基因组 d n a ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o a f 3 3 0 6 3 5 ) 的克隆，该脂肪酶e d n a8 5 5 个碱基组成，编 码1 个由2 8 5 个氨基酸残基组成的酶蛋白，其信号肽及前肽部分由2 7 个氨基酸残基组 成，成熟肽部分由2 5 8 个氨基酸残基组成。并实现了在真核细胞毕赤酵母中的高效表 达以及在酿酒酵母中的有效表达。但该酶为中温酶，最适作用温度为3 5 , 4 0 。c ，在一 些需要高温或低温的工业应用上受到限制。为此，本文进行了以下几个方面的研究： 1 通过重叠延伸p c r 和大引物p c r 的方法对p e l 基因进行了e 8 3 v 、t 8 8 p 、 k 2 2 6 r 、e 5 4 p 和e 2 1 4 p 的定点突变，检测各个突变体与野生型之间最适作用温 度与热稳定性的不同。 2 用易错p c r 的定向进化技术手段对p e l 基因进行随机突变，通过高通量的筛选 方案筛选高温稳定性或低温适应性的突变体。 4 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 第一部分文献综述 蛋白质热稳定性的研究进展 1 简介 对于蛋白质热稳定性的研究已有几十年的历史了，早期研究的对象是一些如t 4 裂解酶和核糖核酸酶的小分子、可溶性的单体酶( 。v i n c c n te t ，a l2 0 0 4 ) 。因而实际上， 我们就是通过研究这些酶获得了关于蛋白质热稳定性发生机制的有关知识。而获得 热稳定性酶( 蛋白质) 的最直接来源就是从自然界中筛选出产高温酶的微生物。高 温酶一般分为嗜热生物( 生活在6 0 8 0 0 c 环境中) 产生的酶和超高温生物( 生活在 8 0 0 c 以上环境中) 产生的酶。嗜热生物来源于细菌和古细菌，但大多数的超高温生 物来源于古细菌。1 9 6 9 年，b r o c k 等在美国黄石公园的高温温泉中发现了高温菌 肪g m a p u a t i c w ( z e i k u sa n db r o c k1 9 7 1 ) ，其产生的酶就是现在广泛应用于p c r 技 水中的t a q 酶人们从中发现了高温酶实际上能够在其产生的微生物最高生长温度 下保持稳定和相当高的活性，后来，人们陆续又发现了许多嗜热生物和超高温菌。 相对于中温酶而言，除了生物体在种族进化中发生突变之外，高温酶跟中温酶 在很多方面还是很相似的：( 1 ) 它们的氨基酸序列跟它们相对应的中温酶有4 0 8 5 的同源性( b u r d e t t ee t ，a l1 9 9 6 ) 。( 2 ) 它们的三维结构也是可叠合i 拘( f u j i n a g ac t ，a l 1 9 9 3 ) 。( 3 ) 它们与中温酶有着相同的催化机制。( 4 ) 大多数高温酶的基因能够成功 克隆并在中温微生物中表达，同时，表达的重组体仍能保留高温酶本身的所有性质。 包括热稳定性和高温条件下的高活性( v i e i l l ee t ，a i1 9 9 5 ) 。因此，即使有些外在因素 ( 如盐、聚胺类或糖基化等) 能使高温酶提高稳定性，但是大多数高温酶的耐热性 是内在的，当相剥于中温酶而言，一种蛋白质稳定性提高了，其结果肯定是有某些 氨基酸发生了突变。 2 蛋白质的稳定性 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 酶( 蛋白质) 的热稳定性是酶的重要属性之一。任何导致酶的空间结构变化的因 素都影响酶的热稳定性，包括酶液的p h 、缓冲液、离子强度、底物浓度、溶剂等等。 热稳定性酶具有提高化学反应速率，简化工艺，降低成本，提高产品质量，活性稳定， 而贮藏等优点所以寻找热稳定性酶，提高酶的热稳定性一直是生产和科研关注的热 点。 对于酶工程基础研究或应用研究来说，酶稳定性研究都具有极其重要的意义( 罗 贵民，1 9 9 2 ) 。首先，酶稳定性研究有助于了解酶结构与功能的关系，还有助于阐明 蛋白质空间结构折叠的规律，即破译第二套生物学遗传密码，具有重大的学术意义： 其次，酶稳定性研究的深入将加快酶在医药、化工、食品工业等领域中的应用( 郭 勇，1 9 9 4 ) 。通常酶的稳定性较差，然而在酶的生产、贮存、使用等各个环节中又需 要酶有较好的稳定性。例如，淀粉酶必须耐高温：作为洗涤成分的蛋白酶和脂肪酶 不仅要耐较高温度，还要耐受漂白剂的氧化作用：用于有机合成的酶还要耐受有机 ， 溶剂的变性作用：在酶的分离纯化过程中，常因酶容易变性失活而限制了许多分离 手段的使用。 2 1 酶热稳定性的定义 热稳定性酶即耐热酶，它是一类在高温下保温一段时问后，仍能保持一定活性的 酶的总称。衡量酶热稳定性强弱的常用方法是用酶活性半衰期的长短来表示。由于各 种酶的特性和用途不同，不同的酶使用测定酶活性半衰期的温度不同，需要根据具体 情况来定。热稳定性酶通常在5 04 c 有较长的酶活性半衰期( t h o m a s1 9 8 6 ) ，由酶活性 半衰期衡量热稳定性酶的耐热性有许多实际意义。例如，科技人员可客观比较不同来 源或不同因素处理的同一种酶的热稳定性强弱差异有多大；有利于技术人员制定出酶 制剂生产上所必须执行的最高临界温度超过此温度生产出的酶制剂，其酶活力达不 到标准值；能为酶制剂生产商正确标明产品的有效使用期( 保质期) 提供科学依据，有 利于消费者等等。 2 2 热稳定性酶的优点( c i a r a n 、2 0 0 3 ；李淑彬等2 0 0 3 ) 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 ( 1 ) 酶制剂的成本降低，稳定性提高，可在室温下分离提纯和包装运输，并能长 久地保持活性。 ( 2 ) 稳定的嗜高温酶能经受有机溶剂、洗涤剂的进攻。例如，嗜高温蛋白酶能经 受表面活性剂及碱性环境的变性作用，可作为添加剂应用于家用洗涤剂中。 ( 3 ) 用嗜高温酶可减少菌种感染的危险7 0 。c 以上的温度足以杀死大多病源菌， 且大大减少易造成食品加工过程中易感染菌的数量。从而减少了细菌代谢产物对产品 的污染，可提高产物的纯度，简化其提纯过程。 ( 4 ) 可降解低处理液的粘度高温环境下液体粘度通常会下降，从而使剪切力及 抽运、过滤、离心费用减少。 ( 5 ) 热传导效率与质量传导效率均得到改善。高温下，扩散效率增加且质量传递 限制鼠子减少。加快了动力学反应。 ( 6 ) 在高温下，可以溶解更多的底物，从而使反应平衡向生成产物方向移动，有 利用提高产率。 ( 7 ) 对反应韵冷却系统要求降低，因而降低了能耗，既可降低成本，又可减少冷 却过程对环境造成的污染。 ( 8 ) 生化过程在高温下进行能增加难溶物质如淀粉类、纤维素类、多芳香类和脂 类等的溶解性和可利用性，降低有机化台物的黏度而有利于物质的扩散和混合。 2 3 热稳定性酶在工业上的应用 由于高温酶的最适作用温度在6 0 1 2 5 之间，其在工业上有着巨大的应用前景， 因而逐渐引起了人们的注意，它们现在已广泛应用于分予生物学( 如t a q 酶和p f u 酶) ， 洗涤添加剂( 如高温蛋白酶和脂肪酶等) 、淀粉加工业( 如a 一淀粉酶和葡萄糖异构 酶) 食品和造纸工业、制药、有毒废物处理以及其它需要高温稳定性的应用上( h a k ia n d r a k s h i t2 0 0 3 ) ，这些应用包括有机物的合成( 如脂肪酶、蛋白酶、氧化还原酶) 诊断 试剂、废水处理、造纸以及动物饲料。见表1 1 0 芏垦童要! ! 堕壁塑塞盛壅变塑堕垫窭壅 袭l工业上常用的热稳定性酶及其应用 _hh_k_m-_m一 酷名称作用温度( ) 主要应用 w h h 。一 糖酶 。一淀粉酶 葡萄糖淀粉酶 鼻一淀粉酶 支链淀粉酶 术糖异构酶 纤维紊酶 术聚糖酶 蛋白酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶 脂肪酶 9 0 1 1 0淀粉水解 5 0 6 0 5 0 6 0 5 0 6 0 4 5 5 5 4 5 - - 5 5 8 0 1 0 5 4 0 6 0 4 0 6 0 4 0 - - 7 0 酿造面包去污剂工业 葡萄糖工业 麦芽糖生产 高葡萄糖糖浆 高果糖糖浆 纤维幕水解 纸浆漂白 面包酿造食品加工 去污剌工业 击污剂工业食品加工 d n a 聚合酶 6 5 9 5d n a 扩增 3 ，酶的热失活 酶的稳定睦是指酶抵抗不利因素如热、变性剂等影响而保持其分子完整或生物 学功能的能力( f r a l l k se t ，a l1 9 9 3 ) 。各种因素如物理因素( 温度、压力、光、磁场) ，化 学因素( 氧化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、p h ) 和生物学因素( 酶降解) ，均 有可能使酶变性。变性即：酶从起始的天然结构发生重大构象变化，但却不改变氨 基酸的排列顺序，即变性为蛋白质的二、三、四级( 高级) 结构的变化而4 i 发生一 级结构的改变因此为研究方便，针对不同情况，还把酶稳定性分为耐热稳定性、 耐p h 值稳定性、体内稳定性、体外稳定性、保存稳定性、操作稳定性等等。研究 最多的是酶在溶液环境中的稳定性，特别是其热稳定性。 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 酶的变性遵循两步过程：n u i n ：天然状态酶( n a t i v et e r t i a r ys t r u c t u r e ) ；u ：解链状态酶( u n f o l d e ds t r u c t u r e ) ； i ：不可逆变性酶( i n a c t i v a t e ds t r u c t u r e ) 。天然状态下酶折叠成三维的、紧密的、球状 的或类似于棒状的构象，此为低自由能状态。酶的解链状态( 或称可逆变性) 为蛋 白质的部分构象变化如展开，自由卷曲是完全变性的产物。不可逆变性则包括聚集 或共价键的变化。从热力学上看，酶的天然状态得以稳定的动力来自于分子内相互 作用；氯键、疏水相互作用、范德华力、静电相互作用、二硫键等。而酶变性形成 展开状态的动力则来自于随机卷曲链的熵值。酶的天然状态只是亚热力学稳定状态， 酶很易转变成变性状态。环境条件的改变，如温度升高时，随机卷曲链熵增的效果 超过了天然状态酶分子内相互作用热焓变化的效果，于是变性状态成为热力学稳定 ：佚态酶发生变性。 4 影响蛋白质热稳定性的分子因素 热稳定性是指酶在不同温度下，保持其自身既定结构的稳定和功能正常运行的 一利啃力。蛋白质结构的稳定是其功能正常发挥的基础。大多数酶在5 0 6 0 。c 温度 范围内开始失活，个别酶在1 0 0 左右的高温下仍具活力，如5 h l b l o b u s w i d o c a l d a z z u s b 泉苷酸激酶在酸性p h 中能耐受1 0 0 c 的持续热处理。在生产实践中， 所采用的温度常常超过许多常温酶能耐受的温度，导致这些酶失活。虽然通过固定 化或化学修饰可提高有些酶的耐受温度，但往往它们的活性变低。自发现最适生长 温度在8 0 ll o o c 的超高温微生物以来，科学界对这些微生物产生的许多酶很感必 趣，这些酶的活性能在1 0 0 或1 0 0 。c 以上保持几个小时。其独特的热稳定性可能与 其构象上的刚性密切相关。刚性是指酶的空间结构中各基团、原子以及二级结构之 问干对的运动性小。柔性是指酶的活性部位基团与其它结构部位相比，相对运动性 较大。酶分子具有整体上的刚性；而酶的活性部位次级键力量较弱，柔性比整体分 子高。从f i s c h m 提出的锁钥学说到所有现代阐明酶高催化效率的学说，如诱导契 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 合学说、酶和底物过渡态中间物的紧密结合等可以看出，人们通常对活性部位的思 考均受到有紧密的空间结构较大的影响。一般认为活性部位的柔性既是局部的，也 是相对的。酶分子活性部位一定程度的柔性可能是酶充分表现其催化活性所必需的。 酶分子整体上的刚性是酶保持其结构稳定、功能正常发挥的基础，而活性部位一定 程度的柔性则是酶行使催化功能的关键。 相对于中温酶而言，高温酶在高温条件下具有更高的活性，因而它们需要更具 刚性这种刚性的增加对于保留高温酶的活性结构是十分必要的，而且，刚性能防 解链。这种刚性表现为较低的氢键交换速率，以及对蛋白降解，化学或热变性有较 低的敏感性。虽然蛋白质热稳定性的提高并不是由于系统性的氨基酸突变引起的， 但对显著提高蛋白质稳定性的突变研究表明这些突变更倾向于增加酶的包装效率 ( 如通过填充结构缝隙和增加核心疏水性) 以及增加酶的总体刚性( 如通过稳定。 一螺旋，静电优化和减少构象限制) ( b e r t u se t ，a l2 0 0 2 ) 。 4 1 氢键 氢键在维持蛋白质结构中起着极其重要的作用( 阎隆飞，1 9 9 9 ；a l b e r te t ，a l1 9 8 7 ； v o g te t ，a l1 9 9 7 ；) 。多肽主链上的羰基氧与酸氨基之间形成的氢键是维持蛋白质二 级结构的主要作用力。除此之外，氢键还可以在侧链与侧链，侧链与介质水，主链 肽基与侧链或主链肽基与水之闻形成。普遍认为，氢键是以焓的形式来影响蛋白质 的热稳定性的另外，通过大量高温酶与中温酶的结构比对，结果表明蛋白质分子的 氢键数日与其热稳定性有很强的关联性( g e r h a r de t ，a l1 9 9 7 ) 。同时，j q a n n e r 通过对g a p d h 四种不同类型的比较，即嗜冷、中温、高温和超高温的四种酶比较， 他们发现中性基团与极性基团形成的氢键的数目与热稳定性有很大的关系他们提 出了在高温酶中，极性与中性基团形成的氢键的贡献甚至超过了盐桥和中性一中性 基团之间形成的氢键。这是由于：( 1 ) 折叠包埋一个极性一中性基团形成的氢键所 需的熵比包埋盐桥所需的熵要低。( 2 ) 折叠包埋极性一中性基团形成的氢键所获得 焓比包埋中性中性基团形成的氢键要多( t a n n e x - e t ，a 11 9 9 6 ) 。 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 4 2 疏水作用 水介质中蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部，使得蛋白质分 子结构内部是疏水的，表面是亲水的，这样有利于蛋白质的稳定性( 王大成，2 0 0 2 ) 。 这现象称为疏水相互作用或疏水效应，它在本质上是一种能量效应，当非极性基 团被水围绕时，在能量上是不利的，而当非极性基团彼此集合在一起时，使水分子 从碳氢基团转移到溶剂中，这是一个使体系趋于能量极小的有利过程，因此，疏水 作用是个从高能态趋于低能态的自动发生的过程。它在维持蛋白质三级结构方面 占有突出地位( e i l l ee t ，a l1 9 9 6 ；d a n i e l1 9 9 6 ) 。疏水作用主要是以熵的形式来影响 蛋白质的稳定性的( r o b s o na n dg a m i e r1 9 8 6 ) 。它的作用被认为是在水溶液中为折叠 提供能量所必需的。p a c e 通过对四种酶的7 2 侧链脂肪族突变中计算出每一个包埋 的一c 1 1 2 对蛋白质的构象稳定性平均贡献了1 3 k c a t m o l l 的能量( p a c e1 9 9 2 ) 。 rt h e z o p h i u s 产生的3 一异丙基苹果酸脱氢酶在其二聚体表面会有2 个疏水性氨 基酸残基( l e u 2 4 6 和v a l 2 4 9 ) ，若它们分别被疏水性较弱的氨基酸( g l u 和m e t ) 取代后其在大肠杆菌表达的二聚体比野生型明显不稳定。而且更易被尿素降解，。 俯当它们各自回复突变后，表达的二聚体就恢复了其高温稳定性。这此突变结果更 进一步证实了疏水作用在热稳定性上的重要性( i m a d ae t ，a l1 9 9 1 ：k i ii n oe t a 1 1 9 9 4 ) 。严紧包装的芳香环之间的作用也是疏水作用的一种类型，它对稳定性的作用 大约贡献lk c a t m o l l 的稳定自由能( b u r l e ya n dp e t s k o1 9 8 5 ) 。 4 3 包装效率 一般来说，蛋白质的核心区都是疏水性的，提高包装效率就常与增加蛋白质的 疏水l 生相关基于晶体结构的定点突变的许多实例也证实了通过填充高级折叠结构 中的疏水性洞穴或增强疏水性包装均能提高蛋白质的热稳定性。然而被包埋的亲水 性氨基酸也并不总是蛋白质稳定的破坏者。在晶c ，f f p m d f 口印 j s 中性 蛋白酶的a l a l 6 6 s e r 突变中，s e r 羟基取代了一个被包埋的水分子，并改善了区域 氢键网络从而增强了包装效率和稳定性。 - 1 4 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 4 4 盐桥 大量的实验数据都己证实了盐桥对蛋白质稳定性的作用。同一种分子中各种离 子在溶液中是非常活跃的，表明了蛋白质分子内部了表面的盐桥是很稳定的，甚至 是在高度极性溶液环境中，蛋白质的盐桥也是很稳定的。盐桥同时能够稳定蛋白质 的二级结构，提高它们的刚性。盐桥网能够稳定蛋白质的b 一折叠和a 一螺旋。在 n 一螺旋中，酸性的残基往往位于接近螺旋的阳极端，即氨端，因而，其所形成的 盐桥可消除偶极的影响，从而使d 一螺旋更加稳定( i s h i k a w ae t ，a l1 9 9 3 ) 。 b s t e a r o t h e r m o p h g u s 产生的磷酸甘油酯激酶的突变体的稳定性远远高于其野生型， 研究表明突变体含有了1 5 个额外的盐桥，这些离子键大多数位于n 一端区域( 野生 型中n 一端区域比c 端更不稳定) 或位于蛋白质表面区域。 用统计学的方法研究表明高温酶比中温酶有更高的精氨酸：赖氨酸比。这是由 于精氨酸比赖氨酸有更高的p k 。值，所以精氨酸在高温条件下更能维持蛋白质的盐 桥。精氨酸的稳定效果还有一个原因是它含有一个胍基基团，且有更长的侧链；因 而它比赖氨酸更有机会与其它基团形成盐桥。对两种酶的研究表明，稳定性高的 ，a 口a t i c wg a p d h 在2 2 位和2 4 8 位的精氨酸，而稳定性较弱的 盥，t e n l o t h o r x o p h j l u s 其相应位置的氨基酸是赖氨酸。两个的赖氨酸由于其侧链较 短，无法形成与高温酶相似的稳定作用( m r a h e te t ，a l1 9 9 2 ) 。 4 5 降低构象张力 当没有分子内非共价作用时，当在左手螺旋构象中没有g l y 存在时，蛋白质往 往是稳定的，这是由于左手螺旋结构中紧密接触的b 一碳原子和羰基会增加蛋白质 结构的区域构象张力，而g l y 的结构最简单，侧链只有一个氢离子。因而它的存在 可明显降低蛋白质的构象张力，b a c i l l u ss u h t i l i sd n a 结合蛋白h u 中的( ；1 u 1 5 和ec o l ir 】l a s eh i 中的l y s 9 5 ( 它们都位于转折区域) 都是左手螺旋中的氨基酸。 对d n a 结台蛋白h i ；中的g l u l 5 结g l y 定点突变结果表明蛋白质热稳定性提高了7 0 。 在丑s t r o t h e z 口o p b i l u a 酶中，g l y l 5 位于转折处，位于螺旋i 和2 之间，当 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 它突变为g l u 时，打开了螺旋a 卜一转折一螺旋n2 的构象从而阻抑了其中一个螺 旋一转折一螺旋的稳定氢键( k a w a l l l l l r ae t a l1 9 9 6 ) 。 s k i m u r ae ta 1 对e c o l ir r l a s eh 进行了定点突变，获得了l y s 9 6 g i y 突变体， 消除了由l y s 造成的构象张力。由于消除了构象张力，两个相邻的核心元件就能更 好地相互作用从而提高了蛋白质的稳定性。而另外一个l y s 9 5 a s n 突变体也增加了 蛋白质的稳定性。这是由于替代后的a s n 形成一个残基内氢键，产生了类似于p r o 残基形成的结构束缚力从而稳定了左手螺旋的构象( k r i m u r ae t ，a 11 9 9 2 ) 。以上 的两个例子中，降低构象张力提高稳定性最终是由于增强了蛋白质的二级结构间的 作用。这些研究发现也表明了蛋白质的稳定性实际上是多种机制共同作用的结果。 还有一些能够降低构象张力的类型如a 一螺旋，那些不易形成螺旋的残基被那 些有高度倾向于形成螺旋的残基替代后，也能提高蛋白质的稳定性。但从研究的结 果来看，提高的效果并不明显。 4 6 降低去折叠熵值 4 6 1 二硫键 二硫键是两个半胱氨酸侧链巯基( - - s h ) 氧化形成的共价键( 一s s 一) ，出 现彳1 _ ! 许多蛋白质中，对蛋白质正确三维结构的形成和稳定具有重要的作用。蛋白质 去折叠构象越大，折叠成单一天然肽所消耗的焓就越高，因此减少去折叠构象的数 量可以增加天然态的稳定性。减少去折叠构象的最有效方法是引进新的二硫键。在 引进的半胱氨酸之间的环链越长，去折叠结构受到的制约就越强，折叠的结构也就 越稳定。但要注意的是，必须使引入的- - c h 2 一s s - - c h 2 一没有张力，否则会降低 其产生稳定性的效果。由于无张力的一s - - s 一键构象局限在一个很窄的范围内，要 设计这种无张力的一s s 一键并不是一件容易的事。所以在通过蛋白质二i 程途径 引进二硫键时不能简单随意地选取在空间上相近的两个残基位置，还必须分析它 们是否符合形成张力一s s 一键的条件。t 4 溶菌酶通过引入二硫键显著提高了它的 热稳定性( t m 2 3 。c ) ( 王大成，2 0 0 2 ) 1 6 扩展青霉脂肪酶的定点突变和随机突变 4 6 2 甘氪酸( g l y ) 和脯氨酸( p r o ) 美 o r e g o n 大学的m a t t h e w se ta l 提出了已知三维空间结构的蛋白质可通过降低去 折叠( m f f o l d i n g ) 的熵值来提高蛋白质的稳定性。在蛋白质的解链状态( 即去折叠) 下，g l y f l t 于没有b 一碳原子，它的侧链只有一个氢原子，缺乏长侧链的制约使多肽链 在( ；1 y 残基出现的地方具有显著的构象柔性，它是所有氨基酸中具有最高的构象熵值， 因而在折叠的过程中，g l y 比其它氨基酸就需要更多的能量( m a t t h e w se t ，a l1 9 8 7 ) 。而 p r o 包含一氨基一羧基及一个吡咯烷环侧链。由于其n 一原子位于毗咯烷环上，使得c 4 一n 单键不能旋转，因而不可能形成u 一螺旋所需的十角：加上p r o 没有n h 基，其侧 链又阻止自身c - o 基接近主链骨架的n h 基，即不能生成维持a 一螺旋构象所需的氢 键因此p r o 是a 一螺旋的最大破坏者。在多肽链中，p r o 不仅限制自身的( 中，v ) 值， 也限制前一个氨基酸的( 中，v ) 值。p r o 的n c4 旋转受到吡咯烷环的束缚，因而具有 更小的构象自由度，且限定随后的氪基酸在有限的空间中，说b 垌p r o 的引入可以减低 蛋白质去折叠时的骨架熵( k u n i h i ke t ，a l1 9 9 8 ：朱国萍等，2 0 0 0 ) 。因此现在一致认为， x a a p r o 或g b ，- 一x a a 的置换能够降低蛋白质去折叠时的骨架构型熵，且在结构的刚性 部分引进新的分子内作用力。从而提高热稳定性。对于x a a - - - * p r o 替代的位置也是至关 重要的，突变位置的选择一般要考虑三个条件：( 1