（高分子化学与物理专业论文）基于聚乙烯亚胺的聚阳离子基因载体的合成及应用.pdf

中文摘要 中文摘要 载体以及与载体相关的免疫反应、细胞毒性与安全性等问题一直是基因治 疗领域的关键问题。高分子基因传递系统在过去十几年取得明显进展，结果表 明结构简单的高分子很难帮助d n a 穿越体内及细胞内的所有屏障，针对具体的 应用目的，设计多组分、多功能载体将是未来几年高分子基因治疗研究的方向。 其中聚乙烯亚胺是一类转染效率高应用最广泛的高分子类基因转染试剂另 外经过很多研究证明，聚乙烯亚胺的转染效率随着分子量的增高而增大。一般 来说，高分子量的p e i ( 2 5 k d a ) 具有很高的毒性并且不能降解相反低分子量的 p e i ( l m w p e i ， - l 时可被完全阻滞，说u ) 3 p e i 接枝p e g 后，对d n a 有足够的保 护作用。不同比例反应的产物与d n a 有效复合的最低质量比值分别为质量比o5 ， 4 2 第三章 05 ，1 0 ，10 。它们之间没有明显的差别，说日b p e g 修饰载体后不会影响载体与 d n a 形成聚电解质。 33 22p e g 5 5 0 - p e i d n a 凝胶电泳阻滞实验结果 f i g3 3 a g a r o s e g e le i e c t r o p h o r e s i s o f p e g 5 5 0 - p e ic o p o l y m e r d n a c o m p l e x e s m v a r i o u s n p r a t l o s a ，p e g 5 5 0 一p e i ( 5 ：i ) tb ，p e g 5 5 0 - p e i ( 1 0 ：i ) ；c tp e g s 5 0 - p e i ( 1 5 ：i ) il a n el ：p l 勰m i d o n l y ：l a n e 2 9 w e i g h tr a t i or a t i o ：o5 ir2 ，3 5 ，7 ，1 0 。 p e i d n a 复合物在质量比03 时可被完全阻滞，而p e g 5 5 0 p e i 聚合物与d n a 在质量比 - 05 时可完全和d n a 结合阻止溴乙锭插k d n a 双螺旋结构中，故观 察不到荧光。说明p e i 接枝p e g 5 5 0 后，仍能与d n a 形成聚电解质，并且埘d n a 有足够的保护作用。p e g 5 5 0 、p e g 2 0 0 0 与p e i 在上述合成比例中形成的产物都能 够有效的与d n a 形成聚电解质，说明接枝p e g 后，x c p e i 结合d n a 的能力没有显 著影响。 3 33 细胞毒性测定( m i t 法) r g r ( r e l a t i v eg r o w t hr a t e ) 为相对增值百分率，通过细胞的存活率来推定聚 合物载体内在的细胞毒性。其值越大则毒性越小。从图4 4 显示结果可以看出， 聚合物p e i 的细胞毒性随着浓度的增高显著增加，而p e g p e i 聚合物在低浓度 6 p g m l 以下时未表现出明显毒性，1 5 1 l g m l 以上时p e g p e i 的毒性比p e i 明 显减少，且随着聚合物中聚z , - - - 醇含量的增加而降低。接枝p e g 的分子量不同， 对聚台物的毒性也有影响。p e g 2 0 0 0 p e i 系列产物比p e g 5 5 0 p e i 系列产物的 毒性要低，均低于p e l 2 5 k d a 的毒性。 第三章 1 0 0 8 邑0 6 d 耍0 4 0 2 0 0 c o n c e n t r a t i o n ( u g m 1 ) ) 1 ) 1 ) ：1 ) ：1 ) 0 ：1 ) 5 ：1 ) f i g3 4c y t o t o x i c i t yo fp o l y m e r sa tv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n s ( n 2 3 ，e r r o rb a r sr e p r e s e n ts t a n d a r dd e v i a t i o n ) 文献报道，分子量较大的p e i 毒性也较大 9 1 ，经无毒、抗免疫原性的水溶 性大分子p e g 修饰p e i 后，与d n a 自组装成核壳结构胶束，其芯核由p e i 与 d n a 通过静电作用缔合而成，p e g 构成保护性的水溶性外壳，从而使p e i 的毒 性降低。接枝p e g 的量越多，p e i 的毒性降低的越多。接枝分子量大比分子量 小的的p e g 毒性低是由于相对接枝p e g 的条数增多所致。由图上可以得知， 随着p e g 修饰量的增多，合成的聚合物的毒性也逐渐的降低，这跟p e i 被保护 的程度成正比。 3 3 4p e g p e i 介导基因体外转染细胞的性能研究 3 3 4 1p e g 2 0 0 0 修饰p ei 体外转染h e l a 细胞结果 第二三罩 p e i i d n a = p e g 2 0 0 0 - p e i ( 1 0 ：1 1 d n a = 5 0 ：ip e g 2 0 0 0 - p e i ( 1 5 ：1 ) d n a = 6 0 ： f i g3 5 t h ef l u o r e s c e n c ep h o t o s o f g f pp o s i t i v e c e l l s t r a n s f e c t e db yp e io r p e g 2 0 0 0 - p e i p e g 2 0 0 0 - p e i d n a t r a n s f e c t c dh e l ac e i l s 时m a s sr a t i oo f4 0 ：i ，5 0 ：】6 0 ：l ；p e i d n a t r a n s f e c t e d h e l ac e l l sb y m a s sr a t i o o f li ，1 0 0 x f 3 6f a c sr e s u l t s o f t r a m f e c t i o no n h e l a hp e g 2 0 0 0 - p e i d n a p o l y m e r s p e g 2 0 0 0 - p e i ( 5 ：i ) 复合物的转染试验用h e l a 细胞研究。g f p 转染进入细胞 4 0 4 8 h 观察费光表达f i g u r e 35 。从转染试验流式结果可以看出，p e i 接枝少量 第三章 的p e g 5 5 0 可使转染率提高，但是太少也会降低其转染效率，如p e g 2 0 0 0 - p e i ( 3 ：1 ) 。p e g 2 0 0 0 _ p e i 在合成比5 1 、1 0 ：1 、1 5 ：1 与d n a 在质量比为4 0 、5 0 、 6 0 时的转染率最高，在复合比例小于2 0 时没有明显的转染效率。由于p e i 的 毒件较大，当质量比在i 时转染效率和毒性最佳，增加至1 0