（分析化学专业论文）多壁碳纳米管在线提取蛋清溶菌酶的研究.pdf

lj o n l i n ei s o l a t i o no f l y s o z y m ef r o me g g w h i t e u s i n gm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s b yz h a n g n a s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw r a n g j i a n h u a n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i 够 j a n u a r y2 0 0 8 独创性l 声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 日期：加8 、 学位论文版权使用授权书 泼哪 i f 、f r 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： j 东北大学硕士学位论文 摘要 多壁碳纳米管在线提取蛋清溶菌酶的研究 摘要 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，广泛应用于食品工业、包装工业、 医学临床及生物工程中。随着各种新的生物分离技术的出现，用于溶菌酶分离纯化的方 阜 法也愈来愈多，从传统的结晶法、沉淀法、色谱法、离子交换法，到现在采用的新技术 ，如亲和膜色谱、反胶团萃取、双水相萃取等。其中固相萃取法具有回收率高、有机溶剂 k ：渭耗少、富集倍率高、操作简单、省时、省力、易于自动化等优点，是最常使用的提取 蛋清溶菌酶的方法。 溶菌酶是蛋清主要蛋白质中唯一一种碱性蛋白质，在水溶液中带正电荷；碳纳米管 经氧化处理后，在水溶液中其表面带负电荷；基于物质之间电荷的相互作用，本文建立 了多壁碳纳米管在线提取蛋清中溶菌酶的新方法。将经适当纯化处理后的碳纳米管装入 自制的固相萃取柱，对蛋清中溶菌酶进行选择性吸附后，用碳酸盐缓冲溶液进行定量洗 脱。本文在顺序注射系统中，对洗脱剂、洗脱剂的p h 以及富集流速、洗脱流速、洗脱 剂体积等实验参数进行了优化选择，并考察了洗脱剂的离子强度对洗脱结果的影响。实 验结果表明，多壁碳纳米管微柱可以有效的定量萃取溶菌酶，富集倍率为1 2 ，试样处理 量为l o 个h 1 。 对实际样品鸡蛋清进行提取，得到电泳纯度为1 0 0 的溶菌酶，1 0 0m l 鸡蛋清可提 取溶菌酶o 4 0g 。若蛋清中所含蛋白质按1 3 计算，该方法所提取的溶菌酶占蛋清中蛋 白质总量的3 6 ，与标准值相符。与其它提取蛋清溶菌酶的方法相比较，本法具有试 剂用量少、提取速度快等优点。此外，由于引用了顺序注射这种在非平衡状态下快速进 样的分析技术，使得该法还具有在线、微量、密闭、自动等优点。 关键词：碳纳米管；在线固相萃取；溶菌酶；鸡蛋清 j 东北大学硕士学位论文a b s t r a c t o n - l i n ei s o l a t i o no f l y s o z y m ef r o me g gw h i t e u s i n gm u l t i - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s a bs t r a c t l y s o z 舯ei sah y d r o l 州ce n z y m ew i d e l y 印p l i e di nf o o di n d u s t p a c k a g i n gi n d u s t 啦 m e d i c i n ea n db i o e n 百n e e n g q u i t eaf e wi s o l a t i o na n dp 嘶f i c a t i o na p p r o a c h e sa r ec u r r e n t l y a v a i l a b l ef o rl y s o z y m e ，i n c l u d i n g c r y s t a l l i z a t i o n ，p r e c i p i t a t i o n ，c h d m a t o 伊a p h y i o n e x c h a n g e ， r e v e r s em l c e l l a re x t r a c t i o n ，a q u e o u st w o - p h a s es y s t e m s s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) i sa h i 曲1 ye 壤c i e n ts i m p l es 锄p l ep r e 缸e a t m e l l tt e c h n i q u ew i ma d v a t l t a g e so f h i 曲e n d c h m e n t f a c t o r l o wr u n n i n gc o s t 锄de 嬲eo fa u t o m a t i o n i ti sa l s ow i d e l yu s e di nt l l ei s o l a t i o no f l y s o z y m ef b me g gw h i t e l y s o z y m ei st h eo n l ya l k a l ip r o t e i ni ne g gw 胁ea n di sp o s i t i v e l yc h a r g e di na q u e o u s s o l u t i o n c a r b o nn a l l o t u b e s si s o e l e c t r i cp o i n ti s 5 oa n da r e ro x i d a t i o ni ti s n e g a t i v e l y c h a r g e d an o v e lm e t h o df o r 廿l ee x t r a c t i o no fl y s o z y m e 自) me g gw h i t eu s i n gc a r b o n n a n o t l l b e sw a sd e v e l o p e db a s e do nt h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s c a r b o nn a n o t l b e sw e r c p a c k e di n t oas p em i c r o c 0 l u i 】 1 i la r e ra p p r o 州a t ep r e 仃e a t i l l e l l t ，a i l dm em i c r o c o l u n 加w a s i n c o 印o r a t e di n t oas e q u e n t i a li n j e c t i o ns y s t e n lw h i c hf a c i l i t a t e so n l i n es e l e c t i v es o r p t i o no f l y s o z y m ei ne g gw h i t e 1 1 1 er e t a i n 酣p r o t e i nw 嬲a r e 哪盯i i sq u a i l t i t a t i v e l ye l u t e db yu s i n g c a r b o n a t eb u f f 打v r a d o u sp a r a m e t e 飓a f r e c t i n gm ea d s o r p t i o n 锄de l u t i o n p r o c e s sw e r e i n v e s t i g a t e dt oa c l l i e v eo p t i m i z e dp 嘶f i c a t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w c dt h a tl y s o z y m e c o u l db ee 师c i e n t l ye x t r a c t e db ym em i c r o c o l 啪ep a c k e dw i t l lm u l t i w a l l e dc a r b o nn 锄o t i j b e s a ne 血c h i n e n tf a c t o ro fl2 锄das 锄p l i n gt l u o u 曲p u to floh 1w e r eo b t a i n e d t h ep u r i t yo ft h el y s o z y m ei s o l a t e d 舶me g gw h i t ew 勰lo o 锄dc a o 4gl y s o z y m e c o u l d b ee x t r a c t e d 舶mlo om l e g gw h i t e w h e nc o n s i d 撕n gt l l a tl3 o fm e e g g w h i t ei s p r o t e i ns p e c i e s ，t h ei s o l a t e dl y s o z y m ec o u n t st o3 6 o fm et o t a lp r o t e i nm a l s s ，w h i c h m a t c h e dw e l lt h es t a _ n d a r dv a l l l e 1 “y w o r d ：c a r b o nn a n o t u b e s ；o n l i n es o “dp h a s ee x t r a c t i o n ；l y s o z y m e ；e g gw h i t e i i i 东北大学硕士学位论文目录 目录 独创性声明i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第1 章概述1 1 1 溶菌酶的性质l 1 2 溶菌酶的应用2 1 2 1 在食品工业中的应用2 1 2 2 在包装工业中的应用3 1 2 3 在医学上的应用3 1 2 4 在生物工程上的应用4 1 2 5 在环境工程上的应用4 1 2 6 在发酵工业上的应用4 1 2 7 在饲料中的应用5 1 3 溶菌酶的提取方法。5 1 3 1 结晶法5 1 3 2 离子交换法6 1 3 3 色谱技术7 1 3 4 膜分离技术9 1 3 5 利用亲和作用进行纯化的方法。1 0 1 3 6 其他分离纯化技术。l l 1 4 固相萃取中常用的吸附剂1 4 1 4 1 树脂1 4 1 4 2 纤维类15 1 4 3 硅胶、可控孔玻璃1 5 1 4 4 活性氧化铝l5 1 4 5 活性碳类吸附剂16 1 4 6 生物富集剂1 7 1 4 7 纳米材料一碳纳米管1 7 i v 东北大学硕士学位论文 目录 第2 章多壁碳纳米管在线提取溶菌酶1 8 2 1 实验部分18 2 1 1 仪器18 2 1 2 试剂及配制1 9 2 1 2 1 试剂l9 2 1 2 2 溶液的配制1 9 2 1 3 微型离子交换柱的制备2 0 2 1 3 1 碳纳米管的预处理2 0 2 1 3 2 装柱21 2 1 4 实验原理2 1 2 1 5 实验流路及操作过程2 2 2 1 6 溶菌酶的定量一2 3 2 2 结果与讨论2 4 2 2 1 方法研究2 4 2 2 2 萃取条件的选择2 6 2 3 分析性能3 2 2 3 1 标准曲线3 2 2 3 2 检出限3 2 2 3 3 精密度3 3 2 4 本章小结。3 4 第3 章蛋清中溶菌酶的提取3 5 3 1 蛋清的预处理3 5 3 1 1 等电点沉淀法3 5 3 1 1 处理步骤3 5 3 2 蛋清中溶菌酶的在线提取3 5 3 3 溶菌酶纯度的检验3 6 3 3 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 相关试剂的配制3 6 3 3 2 夹心式垂直电泳系统3 7 3 3 3s d s p a g e 凝胶的配制及凝胶板的制备一3 8 3 - 3 4 样品的处理、加样及电泳3 9 一v 一 东北大学硕士学位论文 目录 3 3 5 凝胶的剥离、染色及脱色3 9 3 4 溶菌酶活性检测4 1 3 4 1 溶壁微球菌的培养4 1 3 4 2 溶菌酶活性测定。4 1 3 5 本章小结。4 2 第4 章结论4 3 参考文献4 4 致谢5 1 攻读学位期间发表的论文5 2 v i 一一 - 东北大学硕士学位论文第1 章概述 第1 章概述 1 1 溶菌酶的性质 溶菌酶( 1 y s o z y n l e ) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶。人们 对溶菌酶的研究始于1 9 0 7 年尼科尔发表枯草芽孢杆菌溶菌因子的报告。1 9 2 2 年英国细 菌学家弗莱明发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，将其命名为溶菌酶川。 溶菌酶按其所作用的微生物不同分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。细菌细胞 壁溶菌酶按其作用方式不同可分为两种，一种是作用于d 1 ，4 糖苷键的细胞壁溶解酶， 另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶；按其来源不同可分为鸡蛋清溶菌 酶、人及哺乳动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物产生的溶菌酶和细菌噬菌体产生的溶菌 酶。随着溶菌酶的发现，科学工作者对溶菌酶进行了大量的研究，也得到了广泛的应用。 随着实验技术的发展溶菌酶的提取方法也在不断发展，从传统的结晶法、沉淀法到色谱 法、离子交换法，特别是现在采用的新技术如亲和膜色谱、反胶团萃取、双水相萃取等。 溶菌酶的化学名称是n 乙酰胞壁质聚糖水解酶，它是由1 8 种氨基酸，2 2 0 0 个原子组 成，具有四个二硫键，分子量1 4 3 0 0 1 8 0 0 0 。每个溶菌酶分子带1 0 个单位j 下电荷，分子 中精氨酸、天冬氨酸和色氨酸的含量高，酪氨酸的比例较低【2 】。s h a h 椰等报告牛奶中的 溶菌酶分子量为1 8 0 0 0 ，分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸含量较高，如色 氨酸的比例较高【3 】。溶菌酶是一种碱性球蛋白，等电点高达l o 1 7 1 1 1 0 ，化学性质非常 稳定，对热也极为稳定，作用的最适温度为4 5 5 0 。当p h 在1 1 2 1 1 1 3 范围内剧烈变化 时，其结构几乎不变；在酸性环境中，溶菌酶对热的稳定性很强，p h 为4 7 时，1 0 0 处 理1m i n 仍能保持原酶活性；p h 为3 时，能耐1 0 0 加热处理4 5m i n 【4 5 l 。目前了解最清楚 并投入商业化生产的是鸡蛋蛋清溶菌酶，其分子量为1 4 3 0 0 ，等电点为l o 7 ，最适溶菌温 度为5 0 ，最适p h 为7 ，鸡蛋蛋清溶菌酶化学性质非常稳定，在p h4 7 的范围内，l o o 处理lm i n 仍能保持原酶活性，但在碱性环境中该酶对热稳定性较差，易变性。在干燥 条件下溶菌酶可以长期在室温下存放，其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定形粉 末，无臭，味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮和乙醚等。 溶菌酶也是一种有效的抗菌剂【6 】，它能切断肽聚糖中n 葡萄糖胺和n 胞壁酸之间的 p 1 ，4 糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细 菌裂解【7 】。它对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌均有良好 的分解作用。有些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶 东北大学硕士学位论文第1 章概述 的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。 1 2 溶菌酶的应用 近几年，溶菌酶被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面。如在同本，溶菌 酶被制成了漱口液及牙膏，用来防龋齿；在德国，1 9 9 5 年1 1 月2 2 r 发布了奶酪法规，批 准使用溶菌酶来阻止在半硬奶酪的生产中由厌氧孢子增殖体的作用所引起的胀气现象； 另外溶菌酶还可作为畜禽饲料添加剂，这种研究才刚刚起步，仅前苏联、法国做了一些 初步研究，国内也有人报道运用溶菌酶于畜禽饲料生产取得了较好效剁引。 1 2 1 在食品工业中的应用 食品在保藏过程中极易受微生物侵袭而导致变质，因此在食品中常常添加防腐剂抑 制微生物。目前使用的防腐剂多为化学防腐剂，其安全性越来越受到人们的关注，应用 也越来越受到限制。因此，寻找高效、安全、适用性广、性能稳定的天然防腐剂已成为 食品研究领域的热点。溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，能选择性的使目标微生 物细胞壁溶解而失去活性，因此完全可以替代对人体健康有害的化学防腐剂。现已被广 泛应用于水产品、肉食品、低度酒、饮料、蛋糕及乳制品的防腐。 1 2 1 1 食品的保鲜 溶菌酶可以选择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其它物质，保证食 品原有营养成分不受损失。对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作 用。因此，溶菌酶被广泛应用于水产类熟制品及肉制品的保鲜。 以前常用冰冻或腌制的方法对肉制品进行保鲜，常常会改变其口感和鲜度。现在改 用溶菌酶能起到较好的效果，如果将0 0 5 的溶菌酶直接喷洒在香肠等肉制品上【9 】，可 以延长肉制品的保质期、提高其营养价值和商用价值。 一些新鲜水产品( 如：虾、鱼等) 在含甘氨酸( o 1m o ll - 1 ) 、溶菌酶( o 0 5 ) 和食盐( 3 ) 的混合液中浸渍5m i n 后，沥去水分，保存在5 的冷库中，9 天后无异味、色泽无变化o 】 1 2 1 2 食品及饮料的防腐 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品 防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料的防腐；还可以添 入奶粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠 道中双歧杆菌的增殖。 酿造酒的酒精含量较低，有些微生物可在其中生长，而引起变质。例如f l l l ，清酒的 酒精含量为1 5 1 7 ，大部分微生物不能在其中生长，而有一种称为火落菌的乳酸菌， 一2 一 东北大学硕士学位论文第1 章概述 则可在清酒中生长，并生成乳酸和产生不愉快的味道。过去常加入水杨酸作防腐剂，但 由于水杨酸具有一定的毒性，目前同本已成功用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂，不 仅对酒的风味无任何影响，还可防止产酸菌的生长。溶菌酶也可用于p h 值6 o 7 5 的饮料 和果汁的防腐【12 1 。1 9 9 6 年，a c q u a 【3 】发表了用溶菌酶来监测和阻止葡萄酒在酿造过程中 由于细菌污染所引起变化的方法的专利。 人乳中含有大量的溶菌酶，而牛乳中则甚少，将溶菌酶添加至牛乳或其乳制品中， 可使牛乳人乳化。大量的实验结果表明溶菌酶还是双歧杆菌增长因子，有防止肠炎和变 态反应的作用，对婴幼儿肠道菌群有平衡作用，因此可将溶菌酶添加到婴幼儿奶粉中， 不但可以起到防腐保鲜、延长保存期的作用，而且还有利于婴儿肠道细菌正常化，增强 婴儿的免疫力，促进婴儿的身体健康【1 4 1 。 奶油和蛋糕等是极易变质的食品，在糕点中加入一定量的溶菌酶，可防止微生物的 繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶可起到一定的防腐作用【i 。 干酪在发酵过程中，常因酪酸菌的作用产生酪酸和气体。在于酪生产过程中添加溶 菌酶可代替硝酸盐，抑制丁酸菌的污染，防止干酪产气，以保证干酪的质量。 1 2 2 在包装工业中的应用n 5 1 溶菌酶可以固定于一些包装纸上，生产出有抗菌功效的包装材料，应用于医院手术 室及食品包装。用提取的蛋清溶菌酶配制2 3 的酶液，喷洒于包装纸上或将包装纸浸 入酶液2 3h ，取出后在5 0 6 0 条件下烘干( 酶活力基本不丧失) ，用处理好的包装纸 包装食品可延长其保质期。 目前许多食品软包装都需要经过高温灭菌，经过高温处理的食品品质变差，易产生 蒸煮味，如果在食品包装之前加入一定量的溶菌酶，然后进行低温灭菌( 巴氏灭菌) ， 可获得很好的保鲜效果。因此，用溶菌酶处理食品包装纸具有广泛的研究和应用前景。 1 2 3 在医学上的应用 溶菌酶作为酶类抗菌药，能参与黏多糖代谢，具有多种药理作用。该酶是一种能水 解黏多糖的碱性水解酶，催化水解细胞壁中的n 乙酰胞壁酸和n 乙酰氨基葡糖之间的 p 1 ，4 糖苷键，使细胞壁分解成可溶性多肽而使细菌溶解。由于黏多糖的分解，在配合内 服和外用药的同时，对微生物感染有强力的消炎作用，因此广泛用于各种炎症类疾病的 辅助治疗。溶菌酶也能抑制口腔致龋菌的生长，抑制菌体糖酵解和产酸，所以对预防龋 齿也有一定的效果。 卢冬梅等【6 峙艮道，由于溶菌酶是碱性蛋白质，可以和r n a 形成复盐，从理论上说应 3 东北大学硕士学位论文第1 章概述 该对管状病毒有作用，所以溶菌酶可能对s a r s 病毒有效，可应用于非典型肺炎的治疗。 其抗病毒机制为：溶菌酶是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的p h 环境下带有大量正电 荷，可与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和d n a 、r n a 、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入 体内的病毒失活。 溶菌酶还可以应用在体育领域，据俄罗斯巴戈托夫米夫的报道【1 7 1 ，用溶菌酶可以 对运动员身体机能进行评定，他认为，处于良好状态的运动员其唾液溶菌酶的滴定值高 于训练水平不佳的运动员，训练负荷大，能使运动员溶菌酶的滴定值下降。溶菌酶是构 成机体非特异性免疫功能的因素之一，在一定程度上能反映机体的免疫能力，是一项较 灵敏的亚i 临床指标。测定唾液溶菌酶取样属于无损伤方法，测定方法简单易行，便于较 长时间追综观察，有助于在训练期和恢复期进行机能评定。 此外，溶菌酶也是人唾液中重要的抗菌成分，具有抗体非依赖性防御功能，可通过 聚集细菌、导致菌胞解链、妨碍胞内代谢和改变细胞通透性等途径起到抑菌、溶菌和杀 菌的作用。 1 2 4 在生物工程上的应用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，用以制造和提取菌 体的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。在微生物育种制备原生质体时，是一种重要的 破壁酶【1 0 1 。 由于溶菌酶具有能够专一性的分解细胞壁的能力，也广泛的应用于科学研究中。如 用溶菌酶专一性的水解细胞壁的特点，可以了解微生物细胞壁的结构；分解细胞壁后制 备原生质体可以用于微生物育种以及微生物分类等学术研究和专业试剂学3 1 。 1 2 5 在环境工程上的应用 环境工程中用溶菌酶处理污水、污泥，即处理含有生物难降解物质的废水，它能加 快污泥脱水速率，使泥饼含水率下降，提高污泥消化率。利用酶工程技术在环境工程中 是一个很有前途的发展方向，溶菌酶以其特有的性质在环境工程中的应用更具潜力【1 8 】。 1 2 6 在发酵工业上的应用 酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分，它的制备目前大多是采用酵母自 溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的 收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间【1 9 l 。 一4 一 东北大学硕士学位论文第1 章概述 1 2 7 在饲料中的应用 溶菌酶是一种天然的防腐剂，具有良好的防腐作用，在饲料中添加溶菌酶可防止霉 变，延长饲料的贮存期。溶菌酶还可以提供高内源性蛋白酶的活性，促使抗炎多肽的产 生，具有抵抗和消除炎症的作用。在功能上，它与免疫球蛋白有着密切的联系，能增强 抗体，杀灭细菌，对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒具有较强的抑制作用， 能有效防止球虫病。另外，饲用溶菌酶可以促进饲料中营养物质的消化、吸收，提高饲 料的消化率，最大限度地提高饲料原料的利用率【8 】。 1 3 溶茵酶的提取方法 自从5 0 年代，国外开始了溶菌酶的工业化生产。目前，世界上溶菌酶的总产量为每 年1 0 0 吨左右。近年来溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了其市场需求，每年以1 0 的速率增长，现在市场规模约为7 0 0 吨。我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶 菌酶具有较大的需求。目前，我国溶菌酶的需求量约为1 5 0 吨，国内供货量仅约3 0 吨， 溶菌酶生产尤其是高活性的溶菌酶供应还不能满足我国同益增长的需求。作为工业原料 进口的溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸多方面的限制，在一定程度上制约 着食品工业、精细化工业、医药工业的发展。我国于2 0 世纪8 0 年代对蛋清溶菌酶提取技 术开始研究，已多次列为国家“8 6 3 ”计划及“十五计划”等重点科研攻关项目。因此，进行 溶菌酶的提取工艺研究，有着重大的科学意义和现实意义。 随着各种新的生物分离技术的出现，用于溶菌酶分离纯化的方法也愈来愈多，从传 统的结晶法、沉淀法到色谱法、离子交换法，到现在采用的新技术如亲和膜色谱、反胶 团萃取、双水相萃取等。 1 3 1 结晶法 结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法，通过改变溶液条件，使溶菌酶以结晶念析 出。结晶方法很多，可分为批量结晶、蒸发扩散结晶( 悬滴法座滴法) 、液液扩散结 晶和透析结晶【2 0 】。另外，还有凝胶扩散结晶、水热法及溶剂热法结晶、升华结剐2 1 2 2 】 和膜结晶【2 3 】等。溶菌酶结晶的常用方法主要是批量结晶和蒸发扩散结晶。近几年，人们 尝试用膜结晶法结晶溶菌酶，制得了质量较好的适合于衍射分析的溶菌酶晶体。蛋清溶 菌酶是用来研究晶体生长的使用最广泛的蛋白质。 结晶法提取溶菌酶的产率一般为6 0 8 0 。这种方法操作简单，应用于卵清溶菌酶 结晶品的工业生产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。但是其生产周 期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂。以王敏【2 4 】的制备卵清溶菌酶实验方 5 东北大学硕士学位论文第1 章概述 法为例，介绍结晶法制备溶菌酶，具体实验过程如下： 鸡蛋清_ 搅拌- 加入氯化钠( 使其终浓度为5 ) 一调p h ( 用1m o ll 1 的氢氧化钠溶 液调p h 至l o ) _ 加入溶菌酶晶体作为晶种_ 4 下静置1 2 周( 使溶菌酶慢慢析出) _ 收 集粗制晶体_ 用p h4 6 的醋酸溶液溶解一静置2 小时_ 过滤一收集滤液一按上述同样的 方法再次结晶( 此过程可根据纯度要求反复进行) _ 收集晶体。 g u l e w i c z 等【2 5 】在不同p h 条件下将溶菌酶沉淀在有n a c l 、异丙醇、p e g 一6 0 0 0 或2 甲 基2 ，4 戊二醇沉淀剂的琼脂糖4 b 色谱柱上，然后用n a c l 溶液线性洗脱，当用8 6 的n a c l 溶液洗脱时，洗脱剂中出现了溶菌酶晶体。其在实验中发现：( 1 ) 使用层析程序准备饱和 蛋白溶液时，无论是用n a c l 还是用p e g 6 0 0 0 作沉淀剂，在p h4 8 和p h7 5 时都有晶体形 成；( 2 ) 结晶过程不是由溶菌酶浓度决定的，室温下2 3 天发生结晶；( 3 ) 用异丙醇做沉淀 剂时，结晶只在p h7 5 的条件下发生。 近年来，c h e n g 等【2 6 】在高浓度的硫酸胺溶液中结晶溶菌酶。e w i n g 等【2 7 】通过阳离子 交换色谱纯化得商用溶菌酶，然后重结晶得纯度高达9 9 9 6 的溶菌酶。r o s e n b e r g 一2 8 】 研究了溶菌酶的结晶条件、晶体生长及晶体结构。尉m b l e 等【2 9 1 通过实验证明了与蛋清溶 菌酶有相近晶格结构的矿物质对溶菌酶的晶核形成时间和晶体特性有很大影响。 1 3 2 离子交换法 离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质 分离的操作技术。离子交换法是样品预处理中最常使用的方法之一，常用这种方法来回 收纯化蛋白质、多肽、核酸、多核苷酸和其他生物分子【3 0 3 。在大规模蛋白质的纯化过 程中，离子交换法有广泛的适应性、高的选择性、大的吸附容量等优点【3 2 】。另外，这种 方法的洗脱条件温和，使蛋白质保持它们固有的构像。离子交换法纯化蛋白质主要是由 蛋白质和带相反电荷的固定相之间的静电作用决定的【3 3 】，在蛋清中，其他蛋白质带负电 荷，溶菌酶带正电荷，所以用阳离子交换树脂可选择性的从蛋清中提取溶菌酶。现在， 许多离子交换树脂已经商业化，并应用于蛋白质的纯化【3 7 】。用于提取蛋清溶菌酶的常 用的离子交换剂有c ms 印h a r o s ef f 弱酸性阳离子交换树脂、铁固定化纤维素、n a + 型阳 离子交换树脂、h + 型阳离子交换树脂、p o l y v i n y l i d i l l en u o r i d e ( p v d f ) 、玻璃纤维等。高 威等【3 8 】采用弱酸性阳离子交换树脂c ms 印h a r o s ef f 作为层析柱填料来纯化蛋清溶菌 酶，可使溶菌酶比活力由吸附前的8 7 4u m 菩1 上升到1 88 3 0um 9 1 ，蛋白活力提高了2 2 倍，且收率较高。所得酶活力与传统提取工艺相比纯度有较大的提高，同时具有操作简 便、成本低、收率高、生产周期短等优点。其工艺过程如下： 1 0 0m l 纯净水_ 醋酸调p h 为3 5 _ 水浴加热到8 5 一加入5 0m l 新鲜蛋清一搅拌加 - 6 一 东北大学硕士学位论文第1 章概述 热5m i n _ 离心收集上清液_ 加到c ms e p h a r o s ef f 层析柱上一纯净水洗涤杂蛋白一n a c l 溶液沈脱溶菌酶 通过离子交换机制纯化溶菌酶的报导很多，l u 等【3 9 】用铁固定化胶原质纤维素吸附溶 菌酶，溶菌酶初浓度为2 5m gml 1 时，吸附容量为3 9 5m gg ，随着温度的升高吸附容 量增大。另外，铁固定化胶原质纤维呈现出极好的柱吸附动力学特性和高的键合能力， 在多次的吸附、解吸过程中柱吸附性能没有明显改变。用此交换柱纯化蛋清中的溶菌酶， 纯度高达1 0 0 ，回收率为7 0 5 。张文会等【4 0 】将n a + 型和h + 型树脂混合用于纯化蛋清中 的溶菌酶，然后用硫酸胺溶液洗脱，盐析得到溶菌酶，每1 0 0m l 蛋清可得到o 4 0g 溶菌 酶，酶的活力为1 00 0 0um 百1 左右。应用此方法其剩余蛋清所含杂质少，减少了蛋白变 性，提高了蛋清的再利用价值，降低了成本。陈刚等【4 i 】合成了化学修饰的单分散性的 p g m e d m a 多孔微珠，用于从蛋清中分离纯化溶菌酶，纯度达9 5 以上，活性为7 03 4 5 u m 百1 ，柱吸附容量为2 1 8m g9 1 。c h i u 等【4 2 1 将苯基三甲基硅烷键合的多孔玻璃纤维膜 磺化制得带有磺酸基的阳离子交换膜，用这种膜从蛋清中提取溶菌酶，在高盐浓度下降 低了非特异性的键合比率，纯化效果比商用的阳离子交换膜要好。李秀锦等【4 3 】研究了不 同方法处理7 2 4 树脂对蛋清溶菌酶吸附的影响，以不同方法对7 2 4 树脂进行再生处理，在 同样的提取工艺条件下，分析了不同方法再生的树脂对蛋清溶菌酶提取活力及产量的影 响。结果表明，7 2 4 树脂经用4 5 温水处理2h ，3 h c l 浸泡4h ，3 n a o h 浸泡6h ，0 1m o l l 1p h6 5 的磷酸缓冲液浸泡1 2h 以上，再生得到的7 2 4 树脂提取蛋清溶菌酶的活力及产 量最高，平均活力和产量分别为( 30 0 0 士1 0 9 5 ) um 岔1 与2 2 4gk 分1 蛋清。在树脂与蛋清比 例为l ：6 2 5 时，每克湿树脂可吸附约4 36 8 0 个活性单位的溶菌酶。 由于离子交换法不需要加热以及改变p h 值，溶菌酶不易变性失活，制得溶菌酶活性 较高。此外该方法还具有简便、高效、成本低、可以自动化连续操作的优点，提纯后的 蛋清不受破坏，可以进行再利用。因此，一直以来都是制备高纯度溶菌酶所常用的方法。 1 3 3 色谱技术 色谱是纯化生物分子的普适性技术，他利用溶质的性质差异来分离混合物溶液中的 各组分，拥有种类丰富的固定相，其上固载了能够与目标组分结合的配基或官能团，以 满足不同的分离任务。 色谱是几十年来分析化学中最富活力的领域之一，作为一种物理化学分离分析方 法，色谱技术是从混合物中分离组分的重要方法之一，能够分离物理化学性质差别很小 的化合物。当混合物各组成部分的化学或物理性质十分接近，而其他分离技术很难或根 本无法应用时，色谱技术愈加显示出其实际有效的优越性。色谱技术最初仅仅是作为一 7 东北大学硕士学位论文第1 章概述 种分离手段，直到2 0 世纪5 0 年代，随着生物技术的迅猛发展，人们才开始把这种分离手 段与检测系统连接起来，成为在环境、生化药物、精细化工产品分析等生命科学和制备 化学领域中广泛应用的物质分离分析的一种重要手段。自2 0 世纪8 0 年代中期就有人试图 将膜分离和色谱这两种技术有机地结合起来，发挥各自的长处，选择制备合适的膜，将 对生物大分子有特异性和选择性的基团连接到膜的表面及孔壁中去，制备一种新型的色 谱介质一膜色谱介质或膜吸附剂。这种将液相色谱与膜分离结合起来的分离技术称为膜 色谱，膜色谱中的每一片膜都相当于一个短而粗的吸附床层，膜厚相当于床层高度，当 床层体积一定时，这种结构有利于在相同压降下获得更高的流速，从而提高分离速度和 处理量。与传统的颗粒作载体相比，膜色谱有如下优点：( 1 ) 由于在膜多孔基质上配基与 液流之间扩散路径极短，传质极快，分离时间显著缩短，分离效率大大提高；( 2 ) 由于膜 的空隙率大，其孔表面积很高，膜的厚度很薄就能满足分离要求，使液流通过膜的压力 降低；( 3 ) 该过程由更快的键合动力学决定，吸附分离时间仅是普通填充柱的十分之一左 右m 彤】。用膜色谱分离时，由于它不单是利用膜孔径的大小，更主要的是利用其特异性 和选择性，不受相对分子质量大小的限制。原则上讲，只要选择合适的膜，采用有效的 活化手段，键合上能与这种物质产生亲和相互作用的配位基，它就可以从复杂体系，尤 其是细胞培养液和发酵液中分离和制取出任何一种目标物，可以预见，膜色谱分离是生 物大分子分离纯化的有力工具。膜色谱作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度 重视，广泛的应用于大分子物质的纯化。s a s a g a w a 等【删通过射线引发接枝获得g m a 膜， 先在中空纤维膜上接入环氧基团，然后通过亚硫酸钠接入s 0 3 h 基团，再与镁离子交联， 制成离子交换膜介质，用于从蛋清中分离溶菌酶，膜的蛋白质平衡容量可达到o 4 2g9 1 ， 用n a h c 0 3 n a o h 缓冲液作洗脱液，在p h9 o 时洗脱率达到1 0 0 。由于膜上螫合了m 孑+ ， 使得膜的透过速率也有较大增加。r u c k e n s t e i n 等【4 7 】开展了用聚乙酰氨基壳聚糖亲和膜分 离溶菌酶的研究，他们制得的这种膜孔隙率高，机械强度好，吸附容量比用壳聚糖微珠 进行柱分离的吸附容量高一个数量级以上。用此膜色谱从蛋清中提取的溶菌酶的纯度达 9 8 以上，活性为5 40 0 3um 9 1 。结果表明，这种多孔壳聚糖膜可以用于大规模的分离、 纯化和回收溶菌酶。由于膜色谱具有快速、高效、高选择性、易于放大、能满足生物大 分子高效分离与纯化的要求的特点，广泛的应用于溶菌酶的提取【4 骷5 0 】。 色谱技术有多种类型，其中高速逆流色谱( h i 曲一s p e e dc o u n t e r c u r r e 啊tc h r o m a t o 目叩h y h s c c c ) 技术是一种无固体载体的连续液一液色谱技术，与其他分离手段相比，h s c c c 最大的优点是不用固相载体做固定相，并具有分离纯度高、样品回收率高、适应范围广、 可一步制备纯品的优点，既适用于小量分析，也可用于规模纯化，在生物、医药、天然 一8 一 东北大学硕士学位论文第1 章概述 产物化学、环境分析、食品等领域有广泛的应用。近年来，随着仪器设备的不断改进和 完善，h s c c c 的保留能力和分离性能极大提高，使其能采用双水相体系进行生物大分子 如蛋白质和核酸的分离和纯化【5 。郅文波等5 2 1 利用多分离柱高速逆流色谱仪，研究了聚 乙二醇l o o o ( p e g l 0 0 0 ) 磷酸盐双水相体系的固定相保留率及该体系对鸡蛋清样品的分 离。采用p h9 2 的1 5 o p e g l o o o 1 7 o 磷酸钾盐体系，在1 om lm i n _ 流速和8 5 0rm i n 。 转速下，成功地进行了鸡蛋清样品的分离，得到电泳纯度为l o o 的卵白蛋白和溶菌酶， 收率均大于9 0 。 随着生物工程与生命科学的发展，对蛋白质纯化提出了越来越高的要求，即要求获 得高活性、高纯度的蛋白质，而以往基于生物大分子的理化性质进行分离的手段，如盐 析法等，都存在纯化效果不理想的问题。2 0 世纪6 0 年代a x e n 的亲和色谱技术部分解决 了这些问题。它是根据生物大分子与特定的固载化配基之间的亲和力，即特异性的可逆 结合和解离而使生物大分子得到分离，成为生物大分子纯化分离的一个有效工具。以亲 和力为基础的生物分离技术是将可逆结合的配基与不溶性的载体偶联，形成具有特异亲 和性的分离介质，并用其来选择性的吸附生物活性物质，再通过洗脱来分离所需要的物 质。a n c a 等【5 3 ，矧将染料配基( b l u e