（无机化学专业论文）微吸水性聚合物的合成及其固定化酶的研究.pdf

摘要 基于水对维持酶在有机相进行酶促反应有重大的 意义，本文借鉴高吸水性树脂的知识，利用长链强吸 水性高分子，在固定化酶载体内部为保持酶的高活性 营造了个适宜的微环境，重点探讨了水对于维持酶 活性构象的重要意义，在固定化酶方面取得定成 功，所制得的固定化酶经证明活性和稳定性都得到很 大提高，可以用于有机相中进行同水溶液中样的酶 促反应。 a b s t r a c t b e c a u s ew h e nt h ee n z y m ep r o c e s st h er e a c ti o n ， t h ew a t e rc a nm a i n t a i nt h ec o n s t r u c lo fe n z y m e ，w e u s ef o rr e f e r e n c et h ek n o w l e d g eo fh i g hs o pw a t e r r e s i n ，w em a k e u s eo fl o n gc h a i na n ds t r o n gs o b w a t e rm a c r o m o l e c u l e ， b u i i d i n g af e a s i b l e t i n y c i r c u m s t a n c et ok e e pt h eh i g he f f i c i e n c yo fe n z y m e i nt h ec a r r i e ro ft h ei m m o b ili z e d e n z y m e ， d i s c u s s i n gt h ei m p o r t a n tm e a n i n go fw a t e rf o rk e e p t h ec o n s t r u c tw h i c hh a v et h eh i g he f f i c i e n c y ，w e h a v e m a d eg o o dw i n n i n gi nt h es i d eo fi m m o b i l i z e d e n z ，f i i e ，t h ei m m o b i i i z e de n z y m et h a t w eh a v e m a d e h a v e b e e np r o v e dt ob eh a v e g o o de f f i c i e n c y a n d s t a b i l i t ye n o u g h t ob eu s e di n t ot h eo r g a n i c r e a c t i o nj u s t1 i k ei nw a t e r 刖吾 众多研究表明，在有机相酶催化反应中，水参与维持 酶蛋白质的水化作用，与酶的催化活性构象的维持力，如 氢键，疏水键，离子作用，范德华力等因素有很大的关 系，此外，在酯化反应中，水作为反应产物之一时，水还 对有机相酶催化反应的化学平衡，反应速度，产物生成等 因素也有一定的影响，因而如何控制反应体系中的水对于 有机相中的酶促反应而言十分重要，本实验利用固定化酶 的知识，利用反胶团和高吸水性树脂的相关理论，在酶的 周围营造出一种很适合维持酶的高活性，高稳定性的含水 微环境体系，在脂肪酶上取得成功! 第一章文献综述 长期以来，人们一直认为生物功能大分子如蛋白质、 核酸等只能在水溶液中行使各自的生物功能，水溶液是这 些大分子存在及其相互作用的天然介质。自1 9 8 4 年z a k s 和k 1i b a n o vn 3 报道了脂肪酶在有机溶剂t l j 具有极高的热稳 定性和较高的催化活性以来，酶在有机介质中的催化作用 的研究取得了突破性的进展，使得传统酶学领域迅速生长 出一个全新的分支一非水酶学( n o n a q u e o u s e n z y m o l o g y ) 。与此同时，正如分子生物学理论的发展导 致了基因工程的兴起一样，非水酶学理论的飞速发展促进 了一门崭新的生物工程技术一介质工程( m e d i u m e n g i n e e r i n g ) 的诞生。介质工程和基因：1 ：程一起成为人为 控制、调节和利用生物大分子结构和功能的有效手段。借 助于生物物理手段和动力学方法，试图吲答为什么酶可以 在有机溶剂中发挥催化活力，为什么在有机溶剂中酶的催 化活力比在水中低而且在不同的溶剂中具有不同的活力， 为什么在有机溶剂中酶的专一胜、选择性不同于水中，而 且可以被溶剂控制甚至发生逆转等问题。这些问题的解决 成为人们根据实际需要来改变、调：诲生物催化剂的功能的 重要途径。研究在非水介质中酶的催化行为，不仅可利用 4 生物催化剂独有的高度选择性和极高的催化效率来取代化 学催化剂完成许多极为有价值的有机合成反应或动力学上 很难进行的反应，而且还为许多重大的理论问题的研究提 供了新的方法和手段。如可以利用非水体系来精确地控制 蛋白质分子表面的含水量以研究水分子与蛋白质结构和功 能的关系：研究蛋白质在有机溶剂中的x 晶体衍射可以给 出有机分子在蛋白质表面准确的结合位点，从而为针对蛋 白质的药物设计提供详细的信息，减少了原有的盲目性。 1 1 酶的作用机制 酶蛋白和其它蛋白质一样，由2 1 种基本氨基酸按一定 顺序排列，此即酶蛋白一级结构，又以定规则的氢键形 成a 一螺旋，t 3 一折叠层，b 一转角和自由刚转等二级结构， 这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成球状分子，即三 级结构，如果酶蛋白有四级结构，则必具二条或更多条肽 链，球状分子表面以疏水作用力，范德华力，盐键及氢键 互相联结起来，而成完整的酶分子，这些组成四级结构最 小单位肽链，称为亚基，而把含亚基不太多的蛋白质称为 寡聚体蛋白。 虽然球蛋白是紧密组装的，然而它们的确是具有一定 的柔性，已知有些酶在与配体或底物结合时经受着构象的 变化，这些变化有可能象溶菌酶那样是小的，也可能涉及 一些大的变迁，在有些类型的酶( 如变构的) 中，这些调 节活性的变化是重要的，有些配体( 变构效应物) 能够改 变蛋白质的形状，显然这影响着晶体结构的状况，虽然蛋 白质晶体约含5 0 的水，但是晶格力约束着蛋白质的结 构。 酶的一级结构与酶的催化活性有密切的关系，但是根 据现有的知识，仍不能由酶的一级结构推测它的催化活 性，酶的催化活性，取决于构成活性中心的少数氨基酸在 整个肽链中的顺序位置，同一酶和功能相近的酶其活性中 心附近的氨基酸系列具有惊人的相似性，序列问的差异， 一般发生在远离活性中心的地方。 酶蛋白的主肽链不同分支，同一肽链的不同位点之 间，或者不同肽链之间可通过胱氨酸的二硫键形成环，也 可以通过辅基( 如血红素) 与肽链的不同位置间以共价键 或配位结合，形成一定的环状结构，把整个分子牢牢锁 住，这是使其化学性质非常稳定的重要结构因素。 结构单位在酶结合配基过程中可以发生位移和转变， 从酶活性中心柔性特征来看，有人提出b 一折叠片结构 可能对肽链的构象相对位移有利，同时这种结构可以把一 些空间位置上邻近的链段固定在一起，以维持稳定的活性 构象。 许多酶分子亚基自发形成特定三维结构时，b 一折叠总 是沿主肽链方向呈右手扭曲，构成圆筒形或马鞍形的结构 骨架，而且平行的量一折叠结构的实例居多，因此分子内部 形成疏水性核心，而表面则多为亲水侧链占据。 在单亚基内，由肽链上邻近部分的二级结构单元紧密 折叠而成的局部性单位，称为结构域，结构域一般含1 0 0 - - 2 0 0 个残基，结构域之问由较为松散的链段连接，分隔 程度因酶而异，因而，它们有一定程度的活动余地，这对 结合底物或变构控制是很重要的性质。 酶分子表面，通常都有一个内陷的凹穴( 或称裂 隙) ，为疏水区域，活性部位，往往就在这里，单体酶， 一个分子中只有一个活性部位，含辅基的酶，辅基分子常 结合在这一区域，参与构成活性部位的。，部分，一些含单 核苷酸或二核苷酸辅基的酶，其辅基常结合在b 一折叠链的 羧基端中间，一些金属酶的金属离子，常常存在于凹穴深 处远离酶分子的中心不远。 酶的溶液中具有较为柔顺的结构，能从多种构象状态一 存在，在底物诱导下，构象改变为适宜丁二结合底物的状 态。 水溶液中的酶。般稳定性 醴差，嗨液只能使用一 次，同时工业酶制剂纯度较低。 酶组织化学，是利用酶化学反应的产物，在光学显微 镜和电子显微镜下被识别，借以判断酶在组织细胞内存在 部位的学位，半个世纪来，证明了大量生理和病理状态下 的酶组织，细胞定位，对阐明组织细胞的结构功能及生物 学意义作出了巨大的贡献，而且建立了一整套成熟的实验 方法和技术，从酶的应用角度看，酶的组织细胞的定位资 料，对于查寻酶源，设计酶的分离纯化工艺，研究固定化 多酶反应器，开发生物电池等都是十分有用的。 酶在结晶状态下，具有较大刚性，但也有一些酶在晶 状也表现缓慢的催化活性。 多功能酶，全酶由多个亚基构成，不同亚基有不同的 功能，其中有的亚基含有催化活性部位，但各自催化不同 的化学化学反应。 亚基之间一般主要靠疏水作用联结，范德华力，盐键 和氢键等也有一定作用。 酶作为一种催化剂，它的生物学功能，主要是催化特 异的化学反应，因此考察酶分子的功能部位( 或区域) 总 是把镜头对准酶的催化活性这个命题，这是顺理成章的 事。 酶催化反应的显著特征是：酶专一性地结合其底 物，反应发生在酶一底物复合物范围上。1 i 仅需要了解天然 酶的结构，也需要了解酶与它们的底物，中间物和产物的 复合物结构，这些问题一旦解决，我们就能够看到底物如 何被结合，催化基团是怎样接近底物的，及酶与底物在结 合时结构怎样发生变化的。这就需要有准确的测定方法， 随着科学的发展，x 一射线衍射法不仅为我们现有的关于蛋 白质结构的知识提供了实验基础，而且还证明为酶的机制 研究中唯一的最重要的因素。x 一射线衍射法的有关原理在 这里就不详述，只要知道它可以准确的描叙蛋白质的结构 而不会破坏蛋白质的构象或堆积方式就可以了。 7 酶一底物复合物反应给出产物是在一瞬间完成的，而 x 一射线数据的获得通常需要化若干小时，因此通常是测定 酶与反应产物，抑制剂或底物类似物的复合物的结构。 检验酶一底物复合物的方法有：1 ) 差值f o u r i e r 法； 2 ) 稳定复合物的产生测定法。 必要时，还可以直接检验快速反应条件下的生产性结 合的酶一底物复合物，当用有利于底物的方式在底物和产物 之间可以建立一个平衡时，就会遇到这种情况，将酶加到 平衡混合物不能改变溶液平衡法，这样可获得一个稳定的 酶一底物复合物。这时就可以利用x 一射线衍射法进行测量 了。 人多数酶是结合蛋白质，即除了多肽链组分外，还含 有非蛋白质组分，通常所各种低分子的热稳定性物质或离 子，称为辅因子，基础生物化学中叙述了一个公式：酶蛋 白+ 辅因子= 全酶。 随着酶的结构研究的深入，近年来不断发现，酶除了 催化功能外，还有其它生物学功能，亦即酶分子存在着其 它功能部位。 根据目前的资料5 ，酶分子的功能部位，除了构成催 化活性部位的底物结合部位，催化部位，辅因子结合部位 以外，还存在抑制剂，激活剂，别构效应结合部位，亚基 见相互识别的结合部位，这些部位都是与催化活性调整密 切相关的部位，另一些酶，还可能存在膜结合部位，受体 识别结合部位，核酸( 模板) 识n 结合部位，蛋白质识 别结合部位等等。 作为一种生物催化剂，酶的催化过程，就是酶与底物。 结合后，再由酶的催化部位的催化基团作用，将底物转变 为产物的过程，所以酶分子的底物结合部位和催化部位， 构成了酶的活性部位，至于其它功能部位，当它们结合不 同的配体( 抑制剂，激活剂，别构效应剂) 时，可以直接或 间接地影响酶的催化功能，即影响酶对底物的结合和催化 作用，因此酶功能部位的深入研究是酶学的重要课题。 酶和底物结合的作用力主要有如下几种： 1 离子间的作用力，或称离子键，离子对等。底物分 子上的电荷和酶分子上相反电荷之间的作用力。f = q 。q ：d r 2 其中q 。q 。是底物和酶的作用基团所带的电荷，d 是介电常 数，r 是两个带电基团间距离，酶上的侧链胍基，e 一氨 基，n 末端氨基都可作为阳离子和底物的阴离子中心作 用，同样酶上的羟基和巯基等可以作为阴离子中心，离子 键受溶剂，盐浓度，酶活性部位的微环境以及酶活性部位 与其他部位的侧链基团等因素的影响。 1 氢键，许多底物不具有负电荷，但和酶能结合得比 较牢固，氢键是其中一种重要的相互作用力，在酶与底物 形成氢键时，氢键键能在3 - 7 千卡克分子左右，氢键有方 向性，当氢键供体和受体在一直线上时强度最大，如两者 之问有一夹角，则强度减弱。 酶上可形成氢键的侧链基团可分为三类： 1 ) 作为氢键供体的基团，有色氨酸的n 引哚基和精氨 酸的胍基， 2 ) 可以作为氢键供体也可作为氢键受体的基团，如 谷氨酰胺和天门冬酰胺的酰胺基，丝氨酸和苏氨酸的羧 基， 3 ) 随着p h 不同，有时可以作为氢键的供体，有时可 以作为氢键的受体，如一氨基，赖氨酸的e 一氨基，天门 冬氨酸和谷氨酸的羧基， 酪氨酸的羟基和组氨酸的咪唑 等，如羧基的质子化形式可作为氢键供体，非质子化形式 可作为氢键的受体 2 v a nd e rw a w l s 力，是一种非专一陀的相互作用 力，比离子键和氢键都弱，它是由于电子在原子中运动的 不对称性而产生的，瞬时偶极诱导了另一原子产生了诱导 偶极，诱导偶极反过来又稳定了原来的偶极，产生了相互 作用力，这种力又l o r d o n 色散力，偶极的方向瞬时变化， 两个非极性分子分别具有半径r r 2 其距离为d ，作用力 u v 有下列关系： 枷，当媳，r 1 肛当出碾，r ( 8 - 2 ) 当两原子进一步靠近时，电子云重叠产生了斥力，因 此这种作用力只有当两个原子达到一定距离时，作用力最 大，这个距离叫做接触距离。 v a nd e rw a w l s 力对于一对原子来说，数值很少，只 有l 千卡克分子，仅略大于室温下分子的热能( o 6 千卡 克分子) ，但在酶和底物结合，许多原子键的v a nd e r w a w l s 力加起来就不容忽视了。 酶为什么比一般催化剂的效率高? 要回答这个问题需 要从理论方面，酶的特性方面和化学反应性质方面来研 究， 1 ) 邻近效应：文献中有很多提法，a p p r o x i m a t i o n ， o r i e n t a t i o n ，p r o p i n q u i t y ，p r o x i m i t y ， o r b i t a l s t e e r i n g 等一个双分子反应，在有酶存在下，可以把二个 底物结合在活性部位，彼此靠近，并有定的取向，显然 要比一个稀溶液中双分子反应有利得多，这一过程从热力 学观点看是不利的，但是由于酶的底物多点结合，结合的 自由能可以补偿这一非自发过程，于是一个分子问反应变 成了一个类似于分子内反应，从而增加了反应速度。 2 ) 多元催化：在酶催化反应中，常是几个基元催化反 应配合在一起共同起作用，例如核糖核酸酶，胰凝乳蛋白 酶。 1 0 3 ) 微环境的影响：一般催化反应中，尽管多元催化已 证明可以使催化效率提高，但是如果要使一个溶液中同时 存在高浓度的酸和高浓度的碱却是办不到的，在酶的活性 中心，由于微环境的影响，可以创造出这样的条件，不但 如此，还可以使同样二个基团，一个起酸的作用，一个起 碱的作用，有利于催化反应进行。 4 ) 诱导契合：当底物和酶结合之前，酶的催化基团排 列状态和底物结合后不同，只有在底物结合后，酶的构象 发生了一定变化，才能使催化基团能够合适地处在被作用 键的地方，这假设是k o s h l a n d 在5 0 年代提出的，x 射线 衍射的结果证明了底物或抑制剂和酶结合后，酶的构象发 生了一定的变化。 5 ) 底物的形变：酶的底物结合后，一部分结合能被用 来使底物的某些键减弱，底物比较接近它的过渡态，降低 了反应的活化自由能，这一点为x 射线衍射的结果所证 实。 酶的作用特点具体而言有如下几个方而： 1 ) 酶的特点主要在于它具有催化作刚这一特殊的运动 形式，人们主要是围绕催化作用来进行讨论的，为了比较 深入讨论这特点，我们不得不撇开一些j 点他方面，把讨论 的焦点局限在酶的活性部位上，既然催化反应是在活性部 位发生，无疑，活性部位是非常重要的，但是决不能错误 地把酶看着是除了活性部位以外其余部分都是一堆废物， 调节酶除了催化部位以外，还有受调节剂调节的部位，有 很多酶还有糖结合在上面，这些糖在生物体内也有一定的 生物作用，酶除了主要起催化作用外，在体内还有和免疫 相关的部位，还有一些部位是和酶本身合成和被分解有 关，就是活性部位也被可能是孤立的存在，而是和酶分子 主链在一定条件下各种力的相互作用，相互制约下产生 的，因此根据活性部位的结构讨论催化运动的特点时，得 到的不仅仅是个映像，这些映像是否巾确的反映了客观 规律，必需从它们的联系，它们的连结，它们的运动，它 们的产生和消失方面去考察。 2 ) 单元催化是构成酶催化作用的基础，不认真研究 它，就无法理解酶的催化作用。但是酶的催化作用是比普 通有机催化作用更高一级的运动形式，酶除了单元催化作 用中存在的特点之外，还具有本身的运动特点，例如底物 和酶在催化过程中都有构象的变化等，因此单元催化在酶 催化作用中不是叠加，而是由量变到质变的关系，同样酶 的催化作用和生命活动的关系也是如此。 3 ) x 射线结晶学对酶的研究加深了对酶作用机制的理 解，使我们看到了一个酶存在的方式，酶和底物结合的模 型，但是也是这个模型容易使人将一个运动着的事物静态 化，酶和底物结合前后构象不同，结合反应过程中也在不 断的变化，因此我们必须有一个动的概念来理解酶的作 用，因为物质和运动是不可分割的。 4 ) 酶的专一性和高效率是否表明酶已完美无缺了，人 们发现对酶进行改性或合成化学酶，有时可以得到比生物 酶更高的催化效率，这些都说明从催化效率方面来说，酶 也不是到了顶了，酶的合理性是相对的，它存在于生物体 内，所以这种合理性是统一于生物前提下。 1 2 酶固定化的方法与载体 酶促反应机理的研究，是阐明生物体内各种复杂代谢 过程及其调控的基础，随着分子生物学的研究，现在己愈 益清楚地认识到，生物细胞内大多数主要代谢酶，都是定 位在生物膜上或亚细胞结构之中，它们在细胞中的这种结 合状态，则是构成代谢过程乃至整个生命物质运动的严密 有序性的基础。 以往酶学研究中，人们总是把酶从细胞的结合状态分 离出来，加以探讨，酶学在理论上和实践上取得的辉煌成 就，表明这种研究方法无疑是必要的，接近真实的，然而 现在确也证明，结合在细胞膜的亚微结构中的酶，在催化 1 2 性质上，毕竟与水溶状态下的酶存在差异，为了阐明生物 体内的代谢规律，对于这种结合状态的酶，必须用更逼近 真实的体系和方法来深入探讨，而固定化酶在很大程度上 可用作这种研究的理论和实验模型，固定化酶的研究，有 助于了解生物体内膜或凝胶类的微环境对酶功能的影响， 在一定程度上可以说是一种生物模拟。 利用酶的固定化技术，可以进行调节酶的亚基固定化 和重组酶。 固定化酶作为一个科学领域比起在传统上具有强烈生 物学特性的发酵法，酶法不同，它是作为一种化学工程手 段而被人们加以利用的，因此不仅酶化学及生物化学工作 者，就是化学工程工作者也正在对它产生浓厚的兴趣。 固定化酶是七十年代迅速发展起来的一个新的科技领 域，它的产生和发展不仅打破了生物化学的传统概念，也 给工业革命带来了强大的动力，在国外，固定化酶己被广 泛用于氨基酸的拆分和提纯，葡萄糖和果糖的生产，诊断 和分析试剂的制造，消除公害，特定的化! 学反应等，几乎 包括水产，纤维，造纸，化学，药品，石油，钢铁，金 属，机械，电力等所有的产业部门。 目前对于固定化酶的研究，已经涉及到生物学，生物 化学，酶化学，发酵工程，生物化学工程，有机化学，合 成化学，催化化学，高分子化学，化学工程，医学以及药 学等各个学科领域。 应用开发更加活跃起来。酶是由蛋白质组成的生物催 化剂，在机体内参与多种化学反应，其特点与一般化学催 化剂不同，在常温，常压的温和条件下，能高效地进行催 化反应，并具有很强的特异性。 但是这种酶，是生物为维持自身的生命活动而产生 的，其生物作用并不适合人类的需要，即这种酶只适用于 在生物体内进行化学反应，如果作为人类所需要的催化剂 还远不够理想，还有缺陷。 酶是由蛋白质组成的，在一般情况下，对热，强酸， 强碱，有机溶剂等均不够稳定，即使在酶反应中给予适合 的条件，也会很快失活，而且随着反应时间的延长，反应 速度便逐渐下降，这是它的缺点。如果能找到一种方法， 既能保持酶所特有的催化活性，又得到不溶于水的性能稳 定的酶标准品，是最为理想的，而固定化酶就能克服上述 大多数缺点，这种酶，就象有机化学反应中所使用的固体 催化剂一样，也具有生物体内酶一样的很强的催化特性， 这种方法对酶的利用将是非常有利的，而且由于酶参与下 的反应特异性强，又可在常温，常压条件下进行，因此如 果能把这一技术应用于有机合成工业，对于防止热损失， 消除热公害，也是有价值的。 这种固定化酶也可被看做是一种修饰酶，用以探讨蛋 白质的结构与酶活性的关系，或者阐述酶的反应机理，可 能是一个非常有效的手段，大多数酶在生物体内是以颗粒 或膜状结合的状态存在的，可以认为固定化酶是这些结合 型酶的模型，它将作为一个有兴趣的研究领域而越来越被 人们所重视。 酶被溶于水而且有活性这一现象，是由n e l s o n 和 g r i f f i n 在1 9 1 0 年首先发现的，真正开始有效地研究利用 并积极开展固定化的研究工作，是由g r u b h o f e r 和 s c h l e i t h 在1 9 5 3 年首先开始的，他们采用的方法，是将 聚氨苯乙烯树腊重氮化，并将羧肽酶，淀粉酶，胃蛋白 酶，核糖核酸等结合固定到重氮化聚氨苯乙烯树脂上，从 而第一次实现了酶的固定化。 继g r u b h o f e r 等人开始研究固定化酶之后，在五十年 代，仅有不足十篇报道，但进入六十年代后，以以色列前 总统k a t z i r - k a t c h a l s k i 教授为首的w i s m a n 研究所学派的。 研究报道都很多，尤其是k a t z i r k a t c h a l s k i 学派研究开 发了许多种新的酶的固定化方法，并对周定化酶的理化性 质，进行了大量的研究工作。 1 4 千烟一郎“1 为了模拟合成化学上所有的催化剂，将固 定化酶应用到工业上，从1 9 6 0 年便开始了氨基酰化酶的固 定化研究，并于1 9 6 9 年夏，成功地将固定化氨基酰化酶反 应用于d ，l 一氨基酸的化学拆分上，实现了酶连续反应的 工业化，这是世界上固定化酶应用于工业的开端。 到了六十年代后期，美国和欧洲有固定化酶的研究工 作上发展很快，有关固定化酶的报道也逐年增多起来。 关于固定化酶的应用研究，不仅已应用到合成反应 上，而且还开辟了许多新用途，但将酶应用到工业上实际 要受到下列条件的限制： 1 ) 生产成本要低； 2 )不受当地条件和季节的限制； 3 )生产周期要短： 4 )能够大量生产。 基于一卜述理由，采用微生物来源的酶是最合算的，为 减少从微生物中提取酶的麻烦，或有目的的利用微生物的 复合酶系统，最近正在研究利用直接固定化微生物体的方 法，即将固定化酶作为固体催化剂加以利用。 固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续地进行反应，反应后的酶，可以回收利用，英文名称 是i m m o b i l i z e de n z y m e ，这是在1 9 7 1 年第一届酶工程会议 上被提议确定的。 酶大致可分为天然酶和修饰酶，固定化酶属于修饰 酶，在修饰酶中，除固定化酶外，还有经过化学修饰的水 溶性酶或用生物学即在分子水平上用遗传方法改良的酶等 等。 在将酶进行固定化时，被包埋的酶并不是不溶性的， 仍是以可溶状态存在的，因此，在将酶作为催化剂使用 时，必须考虑下列三种情况。 1 ) 水溶性状态( s o l u b l e ) 2 ) 水溶性，但处于固定化状态 3 ) 水不溶的固定化状态 酶的固定化方法包括载体结合法，交联法和包埋法。 载体结合法又根据其结合形式，分为共价结合法，离 子结合法和物理吸附法。 酶的催化作用主要表现为酶蛋白质和底物的相互作 用，即酶的催化作用是靠其活性中心完成的，这个活性中 心由具有不同功能的两个位基组成，一个是参与酶催化反 应的反应配基或称催化配基，另一个是控制酶反应底物特 异性的特异性配基或称结合配基，这两个位基由数个氨基 酸基团构成，并保持，酶所具有的高级结构。 因此，为保持酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨 基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶 时，需要在非常严密的条件下进行，当酶的活性中心的氨 基酸基团或其高级结构发生变化时，酶的催化作用便下 降，底物的特异性等性状也会改变。 在制备固定化酶时，还应注意酶蛋白质的功能团如游 离的氨基，羧基半胱氨酸的巯基，组氨酸的咪唑基，酪氨 酸的酚基，丝氨酸和苏氨酸的羟基等参与反应的可能性， 当这些功能团处于酶的活性中心时，要求其不参与酶的固 定化结合，此处由于酶蛋白质的高级结构是靠氢键，疏水 键，离子键等弱键来支持，所以在酶的固定化过程中，必 须避免用高温，。强碱，强酸等处理，而且有机溶剂，高浓 度盐类也会使酶变性失活，因此操作应尽量在非常温和的 条件下进行。 关于酶的固定化方法如前所述，较合理的方法大致有 下列三种： 1 ) 载体结合法，即将酶固定化在非水溶性载体上； 2 ) 交联法，即使酶与：特有两个以上的多官能团试剂进 行交联反应； 3 ) 包埋法，即将酶包裹于凝胶的微小格子中或半透膜 聚合物的超滤膜内。 一) 载体结合法： 此法是将酶结合在非水溶性的载体_ i ：，在固定化酶的 制备方法中，这是一个古老的方法，有关这方面的报道也 最多。 用这个方法制各固定化酶时，除结合方法外，还要切 实注意选择好的载体，因为选用的载体种类对酶的结合量 关系极大，且常常影响酶的活性，而载体的选择是由固定 化酶本身的性质决定的，在选择载体时，应认真搞清下列 几个冈素： 1 载体粒子的大小： 2 三维网状结构表面积的大小： 3 亲水性基团的多少； 4 化学组成。 一般讲载体的亲水性基团越多，表丽积越大，单位载 体结合的酶量也越大，因而所制备得到的高活性固定化酶 也越多。 经常使用的载体有：纤维素，葡聚糖，琼脂糖等多糖 类衍生物和聚丙烯酰胺凝胶等 这些载体结合法，根据结合的形式不同，可分为共价 结合法，离子结合法及物理吸附法等三利，。 a 共价结合法 所谓共价结合法，就是将非水溶性载体和酶以共价键 的形式结合固定在一起，这种方法在已经报道的载体结合 法中最为多见。 采用这种方法时，酶与被结合在载体上的官能团是： 1 a 一氨基或e 一氨基： 2 一，t 3 一和y 一羧基： 3 巯基或羟基； 4 昧唑基； 5 酚基等。 这些官能团能和各种重氮盐类，酰胺叠氮，异氰酸盐 或活性卤化烷等进行反应。 因此，当给载体和酶以适当的反应条件，这些富有活 性官能团的载体，便于与酶结合而制备成固定化酶，根据 其结合形式，可把固定化酶的制备方法分为重氮法，肽 法，烷化法三种类型。 共价结合法与下面谈到的离子结合法和物理吸附法相 比，控制条件苛刻，反应激烈，操作复杂，常常引起酶蛋 白质的高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏，从 而难于保证每次都能制得高活力的标准品，有时还会使酶 所具有的底物特异性发生变化，但是共价结合法制各的固 定化酶，酶和载体结合极其牢固，即使用高浓度的底物溶 液或盐类溶液也不会简单地使酶脱掉。 a 重氮法，此法是将具有芳族氨基非水溶性的载体 ( r y n h ：) ，用稀盐酸和亚硫酸钠处理，生成重氦盐化合 物，然后和酶发生重氮偶合反应，制备成固定化酶，如式 r - y n h ：一 r - y n 三n c 1 一r y n = n 一酶 酶蛋白质中的游离氨基，组氨酸的咏唑基，酪氨酸的 酚基等也参与此反应，重氮法所用的载体有多糖类，氨基 酸聚合物，聚丙稀酰胺，苯乙烯树脂，乙烯马来酸聚合物 和多孔玻璃芳香胺衍生物等。 1 8 a 肽法，这个方法主要是将近代发展起来的合成技术 应用到固定化酶技术上，使载体和酶蛋白间形成肽键而固 定化，有下列几种作法： i ) 将含羧基的载体处理或叠氮衍生物，氯化物，碳化 二亚胺，异氰酸盐等衍生物，再与酶蛋白质的游离氨基起 反应，形成肽键结合，使酶固定化。 2 ) 利用肽合成上使用的双环乙基碳酸亚胺类的碳化二 亚胺试剂或伍德沃德试剂( n 一乙基一5 一苯异恶唑一3 一磺 酸试剂) 使羧基或氨基载体与酶蛋白的游离氨基或羧基间 直接形成肽键而将酶固定化。 c 烷化法，本法是将酶蛋白质中的游离氨基，酚性羟 基和巯基与含有丰富的卤紊官能团的非水溶性载体进行烷 化反应，使酶固定化。 d 载体交联法，本法的原理是使含有二个或二个以上 官能团的试剂作用于游离的氨基，从而使含有氨基的载体 和酶蛋白中的氨基进行交联获得固定化酶。 e 乌其反应载体结合法，本法用交联度较高的异氰化 物来制备固定化酶。 f 其它共价结合法，还有很多，在这就不一一列 举。 b 离子结合法，是通过离子效应，将酶固定到具 有离子交换基团的非水溶性载体上的一利，方法。 能引起离子结合的载体，除具有离子交换基团的多糖 类外，象离子交换树脂，那样的合成高分子衍生物也可用 作载体。 离子结合法与前述的共价结合法比较，操作更加简 便，处理条件比较温和，而且酶的高级结构和活性中心的 氨基酸很少发生改变，因而可以得到较高活性的固定化 酶，但这种方法与麸价结合等化学方法比较：载体和酶的 结合力不够牢网，易受缓冲溶液种类和p h 的影响，在离 子强度较大的状态下进行反应，有时会使酶从载体上脱落 下来。 c 物理吸附法，物理吸附法是将酶蛋白吸附到不 溶于水的载体上而使酶固定化的方法。这个方法与前述的 离子结合法比较，酶蛋白的活性中心不易被破坏，酶的高 级结构变化也不明显，从载体对酶的适应性来看，这个方 法是好的，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，因而被 吸附的酶极易从载体上脱落下来。 此种方法除可利用活性炭，多孔玻璃，酸性白土，漂 白土，高岭土，矾土，硅胶，膨润土，羟基磷灰石，磷酸 钙凝胶等无机物作载体外，也用淀粉，谷蛋白这类高分子 天然化合物做载体。 二) 交联法 交联法与上述的共价结合法一样，都是靠化学结合的 方式使酶固定化，其区别仅仅在于交联法所采用的载体是 非水溶性的，即交联法是利用带有二个或二个以上的官能 团试剂的作用与酶之间发生交联而把酶固定化。可做交联 剂的有产生席夫碱的戊二醛，形成肽键的异氯酸酯。发生 重氮偶合反应的双重氮联苯胺或n ，n 一聚甲撑双乙酰胺， n ，n 一乙烯双马来强胺等，参与此反应的酶蛋白中的官能 团有n 末端的a 一氨基，赖氨酸的e 一氨基，酪氨酸的酚基 和半胱氨酸的巯基，组氨酸的眯唑基等。 交联法和上述共价结合法一样，反应条件比较激烈， 固定化酶的活力在多数情况下都较脆弱。 二) 包埋法 包埋法分为格子型和微胶囊型两种，将酶包裹在凝胶 的微小格子中，称为格子型，r - t j 半透性聚合物膜将酶包裹 起来，称为胶囊型。这种方法与载体结合法和交联法有所 不同，从原理上讲，采用这种方法酶蛋白的本身不发生结 合反应，如果包埋得好，训玎米制备多利固定化酶，但是 在发爿i 化学聚合反应时，需要在比较苛刻的条件下进行， 从而比较容易导致酶失活，因此要设计好包埋条件。 a 格子型 格子型是将酶包埋在聚合物的凝胶格子中，使之处在 不脱离状态下，达到固定化酶的目的。 此法所用的聚合物有合成高分子物质聚丙烯酰胺凝 胶，聚乙烯醇凝胶和天然高分子物质淀粉等。 据报道，最近有人把x 射线或y 射线等射线作为引发 能量，应用于丙烯酰胺聚合反应上。应用放射线照射法， 琪特点是操作需要在低温条件下进行，因而可使酶的失活 率达到最小限度，同时通过变换固定化酶反应装置，可制 备多形态不同的固定化酶。 但是在实际上，利用这种方法制得的固定化酶较之用 化学催化法制得的酶其活力并不太高，而且不论在经济上 还是在反应装置上都还存在不少问题，因此目前没有很高 的实用价位。 b 微胶囊型 本法是以半透明性的高聚物薄膜包裹固定化酶的技 术，制得的微胶囊酶，通常为直径由几个到几百个微米的 球状体。 制备微胶囊有三种方法：1 ) 界面聚合法：2 ) 液中干燥 法：3 ) 相分离法。 a 界面聚合法，此法是应用亲水性单体和疏水性单体 在表面上发生聚合的原理而将酶包围起来。本方法是把含 有酶的亲水性单体，乳化分散在不与水混合的有机溶剂 中，然后加入溶于有机溶剂的疏水性单体，于是在水和有 机溶剂界面上发生聚合反应，形成聚合薄膜将酶包裹，反 应结束后，再用有机溶剂洗净，除去未反应的单体，所用 的单体都是具有缩合聚合反应性能的多功能单体。 本法可任意改变胶囊颗粒的大小，制备时间也很短， 但不同的酶对所用的单体不够稳定，故在制备过程中，有 时会导致酶的变性失活，因此要根据拟胶囊化的酶的性质 和微型胶囊酶的用途来选择单体的配伍，最早采用这样的 方法制备出来微胶囊酶的是c h a n g 等人。 b 液中干燥法，该法是把酶液在含有高聚物的有机溶 剂中进行乳化分散，然后再把该乳化液转移至水溶液中使 之干燥，形成高聚物半透膜而将酶包裹起来。 可用做胶囊半透膜的物质都是疏水性溶剂性( 溶于有 机溶剂) 的聚合物，如乙基纤维素，聚苯乙烯，氯化橡 胶，苯硅氧烷梯形聚合物等，聚合物溶剂可用苯，硅氧 烷，氯仿等。 胶囊的大小，可以通过改变聚合物的浓度，搅拌速度 或保护胶体物质的种类等来控制，但一般不适于制成粒度 在十微米以下的小型胶囊，本法与上述界面聚合法不同， 因为开始用的是聚合物半透膜，而不是反应性试剂，因 此，在制备过程中酶的变性失活不大，故而是制备微型胶 囊酶的较好方法。但是，在二次乳化分散过程中，往往不 能形成乳化液，酶的胶囊化收率低，而且需要去除有机溶 剂，聚合物固定化时间较长。 c 相分离法，将聚合物溶解在不与水混溶的有机溶剂 中，然后将酶乳化分散在此溶液里，继之在搅拌下。徐徐 加入引起相分离的非溶性溶剂，聚合物的浓厚溶液将酶溶 液包围，聚合物相继析出，形成半透膜，酶被包裹起来， 采用这种方法，应特别注意不要一下子使聚合物析出，而 必须使部分浓厚溶液进行相分离，如果没有这个过程，只 会发生聚合物沉淀，而不能将酶包裹进去。 本法和上述的液中干燥法一样，微胶囊化的条件比较一 温和，因此适用于制备微胶囊型酶，其缺点是残留在聚合 物半透膜上的有机溶剂要清除干净，但操作起来非常麻 烦。 上面所叙述的酶微胶囊化法，都是采用不溶于水的半 透膜包裹酶的方法。据报道，最近有人用表面活性剂和卵 磷脂等两性液态膜来包裹酶，这是一个有趣的方法，为了 获得性能稳定的乳化液，首先需要将酶溶液乳化分散在含 碳氢化合物的表面活性剂的溶液中，在这种情况下，膜本 身呈现一种可流动的液体状，而不是固定化半透膜。这种 液膜微型胶囊的最大特点在于底物或反应生成物的膜通透 性不取决于膜孔径的大小，而取决于对膜成分的溶解度。 综合已经报道过的固定化酶，其形态大致可以分为粒 状，膜状，管状，纤维状等4 种，但绝大部分固定化酶为 粒状，因为有如下原因，1 ) 容易处理：2 ) 能用于制备固 定化酶的市售载体几乎都是粒状：3 ) 与：其它形状比，粒 状载体表面积大，反应效率高。 除上述介绍的酶形态外，还有一种尚未普遍应用的固 定化酶的方法，即应用超滤膜法制备固定化酶，可以将酶 装入附有超滤膜的容器中进行连续酶反应，然后把反应生 成物取出即得，这种固定化方法简单易行，但需要用高分 子物质作底物，反应生成物为低分子物质，酶本身必须稳 定。 许多酶经固定化后都比原酶的活力降低了，但是在可 溶性状态下，经过化学修饰的酶，也有比原酶活性高的， 因此通过研究，有可能获得比原酶活力更高的固定化酶。 载体结合法使酶活降低的原因大致如下： 1 ) 构成酶蛋白的氨基酸官能团与载体结合时，活性中 心的氨基酸和非活性中心的氨基酸都毫无区别地参加了反 应： 2 ) 酶的固定化使酶的高级结构发生变化；， 3 ) 酶分子在不失活的情况下与载体结合后，由于载 体的立体排斥，使底物分子的接近受到阻碍； 包埋法导致酶活下降，主要是由于有的在包埋时酶就 发生变性，也有的受到底物或反应生成物的通透速度的影 响造成的。 经常采用与酶有特殊亲和力的抑制剂底物或反应生成 物，事先将酶的活性中心保护起来再固定的方法。 共价结合法和交联法比离子结合法或物理吸附法的固 定化条件激烈，酶蛋白的活性中心和高级结构容易受到破 坏面改变，因此如果不能妥善考虑其固定化条件，往往难 以获得活力较高的固定化酶标准品，但其优点是酶与载体 结合力较强，虽用高浓度底物或盐类溶液，酶也不会脱落 下来，另一方面，因其结合牢固，故使用时导致酶活下 降，很难再生回收。 与此相比，离子结合法则操作简便，要求条件缓和， 在很多情况下，可以制各成活性较高的固定化酶标准品， 但载体和酶的结合力比共价结合法弱，在受到离子强度， p h 的变化等影响后，有时酶会从载体上游离出来，但是这 种活性低的固定化酶容易再生回收，这一点与共价结合法 相比，尤其在使用价格较高的载体或酶时是可行的。 包埋法与共价结合法，离子结合法和交联法不同，从 理论上讲，不与酶本身发生结合反应，较易制得高活力酶 标准品，但此法与共价结合法一样，酶活降低后的固定化 酶，不能再生回收，因为酶被半透膜聚合物所包裹，所以 底物或生成物不适用于高分子物质，这是本法的缺点。 为充分发挥酶的作用，往往需要一定的辅酶，这种酶 和辅酶之间的结合，在大多数情况下，结合力弱，而且是 可逆的，所以蛋白部分( 酶蛋白) 和辅酶容易分离开来。 辅酶是维生素的衍生物，其结构已经搞清，因而将辅酶结 合到载体一i - _ ，因受立体的排斥作用，高分子酶蛋白往往不 易接近，为此，可以在载体和辅酶之间，插入一定长的链 状结构( 间隔基，支撑架) ，用以排除立体干扰。 弄清酶经过固定化后的性质变化，不仅对于应用固定 化酶十分重要，而且对于闸f 归蛋白质的结构与酶活力的关 系及酶反应机理也很有价值。 酶经固定化后所引起的酶性质的改变，一般认为其原 因可能有两种，一是酶本身的变化，二是受固定化载体的 物理化学性质的影响，所谓，酶本身的变化，主要是由于 活性中心的氨基酸残基，高级结构和电荷状态等发生了变 化，而载体的影响，则主要是由于在固定化酶的周围，形 成了能对底物产生立体影响的扩散层，以及静电的相互作 用等引起的，根据大量的观察证明，是上述诸种因素相互 影响的结果，因此，要准确地弄清究竟什么原因，引起什 么样的变化是相当困难的。 酶被固定到高分子非水溶性载体上后可引起立体障 碍，使高分子底物与酶表面的接近受到干扰，从而显著降 低了酶的活性，但是低分子底物则不会引起立体障碍，容 易接近酶表面，故和原来的酶活力无显著差别。 随着底物分子量的增大，酶活力比就相应下降，故此 可以判断，作用于高分子底物的固定化酶，因为载体和底 物之间的立体障碍，难以使固定化酶发挥应用的作用，另 外在用包埋法进行酶的固定化时，因为酶被高分子物质半 透膜所包围，自然就难于对高分子底物发挥作用。但比低 分子物质作底物时，酶经固定化后，一般讲，在多数情况 下底物的特异性均不发生变化。 酶是由蛋白质组成的，其催化能力对外部环境，特别 是对p h 非常敏感，所以在进行酶的固定化时，了解p h 对 酶反应的影响，对于弄清酶蛋白质的结构和机理极为重 要。 酶经固定化后，其最适p h 及p h 活性曲线有时发生变 化，有时则不发生变化，p h 活性曲线的变化，可视为酶蛋 白质本身的电子状态发生了变化，或在采用载体结合法的 情况下，受到了载体表面电荷的影响等j ， 也有的最适p h 发生变化，但p h 活性曲线并不发生变 化，这种现象称之为最适p h 的平行移动。最适p h 向酸性 一侧移动的现象，可解释为，当酶被结合到聚合阳离子载 体上时，酶蛋白质的阳离子数增多，从而造成固定化酶反 应区域p 1 1 值比外部溶液的p h 值偏碱，这样，实际上酶的 反应是在比反应液的p h 偏碱一侧进行的，从而使最适p h 值转移到了酸性一侧。 这说明最适p h 值的变化是由载体的静电性质决定 的，离子结合强度越高，越接近固定化前的酶最适p h 值。也有最适p h 不变，而p h _ 活性曲线却发生变化的例 子。在某些情况下，p h 的变化是有一定的规律的。故认 为，当酶本身的最适p h 与其所处的环境的p h 不相同时， 则可以通过选择适当的固定化方法，根据需要调节酶反应 的最适p h ，使酶发挥最大的活力。 温度对酶反应的影响，同普通化学催化剂一样，酶的 活力与温度有一定的依赖关系，当温度上升到一定高度， 酶蛋白就会变性而失去催化活性，因此弄清温度对酶固定 化后的影响，对于比较酶和化学催化剂有着重要的参考价 值。 酶被固定化后，酶反应的最适温度有时会发生变化， 但在很多情况下，固定化后的最适温度并不会发生变化， 活化能均比固定化前为高，也有没有明显差异的。 由固定化酶动力学的有关知识知，物质移动过程对酶 反应速度的影响，可简单地以米氏反应方程表示”“： e + s e s e + p ( e 表示酶，s 表示底物，p 表示产物) 式中e s 复合体形成的条件是，首先必须使底物与酶 接触，其运动过程称为物质移动过程，或物质扩散过程， 继之发生e s 复合体的形成反应过程和e s 复合体的分解反 应过程，即在反应阻力出现之前，这种反应过程是一种直 线关系的扩散过程，当最大反应速率常数k m 值非常大， 而米氏常数小时，就可出现扩散阻力的影响，结果米氏常一 数却明显增大了。 上面说的是普通酶溶液的反应，它浇明，使用酶溶 液，在反应时也存在物质移动阻力的影响问题，因此认 为，在扩散阻力较大的固定化酶反应中，就更应该十分重 视物质的移动问题。 各种形态的固定化酶模型描叙如下： a ：粒状固定化酶；b ：酶膜；c ：酶管；d ：微型胶 囊；e ：空心纤维。 一一 在上述模型中，无须考虑载体结合法，包埋法等酶的 不同，固定化方法所带来的影响，因为这些因素的影响主 要表现为对载体和其它内部分子扩散速度的影响，但在很 多情况下，均属于有效扩散系数的范围。 酶经固定化后，考虑到酶蛋白质的高级结构发生的变 化，以及由于载体的影响而使底物的亲和力发生改变，故 此对固定化酶的动力学常数l ( i i l 进行测定是很有意义的。 采用载体