荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用.doc

荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒的作用 作者：梁荣感，刘卫兵，唐祖年，徐庆 【关键词】 荔枝核；黄酮类；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用 【Abstract】 AIM: To evaluate the antirespiratory syncytial virus (RSV) effect of flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis in cell culture in vitro. METHODS: By the method of cell culture and using ribavirin as a positive control, the cytopathic effect(CPE) was observed. RESULTS: The TC50 and IC50 of the flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis was 152.9 mg/L and 58.6 mg/L respectively. The therapeutic index (TI) was 2.6, It had the same effect as Ribavirin in antiRSV. Moreover, flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis also showed a concentrationdependent response in inhibiting RSV. CONCLUSION: Flavonoids extracted from the core of Litchi Chinensis can inhibit RSV in Hep2 cells in vitro. 【Keywords】 semen litchi; Flavones;respiratory syncytial viruses (RSV); antiviral effect 【摘要】目的： 探讨荔枝核黄酮类化合物体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用. 方法： 采用细胞培养技术，以病毒唑为阳性对照，观察比较荔枝核黄酮类化合物对RSV引起的细胞病变(CPE)的抑制作用. 结果： 荔枝核黄酮类化合物半数中毒浓度(TC50)为152.9 mg/L，其抗RSV的半数有效浓度(IC50)为58.6 mg/L，治疗指数(TI)为2.6，体外抗RSV作用与病毒唑相当，且对RSV抑制作用存在明显的量效关系. 结论： 荔枝核黄酮类化合物在Hep2细胞中对呼吸道合胞病毒有抑制作用. 【关键词】荔枝核；黄酮类；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用 荔枝核是无患子科植物荔枝（Litchi Chinensis Sonn）的成熟种子. 又名荔仁或荔核，味甘、微苦，归肝、肾经. 功效行气散结、祛寒止痛. 荔枝核的化学成份包括甾类、皂甙、挥发油、鞣质、脂肪酸、聚合花色素成份、糖类、蛋白质以及无机盐1-2. 荔枝核有降血糖、调血脂和抗氧化、保肝作用. 其水提取物及黄酮类化合物的体外实验表明，荔枝核对乙肝病毒HBsAg, HBeAg, HBVDNA有明显的抑制作用3-4. 我们旨在探讨荔枝核是否具有抗呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)的作用. 1材料和方法 1.1材料MTT（4,5二甲基噻唑2,5二苯基四唑溴化物，Sigma公司)，以无血清MEM培养基配制成5 g/L溶液，过滤除菌后置4冰箱保存备用；MEM和RPMI 1640(Gibico公司)；二甲基亚砜（DMSO，上海菲达有限公司)；新生小牛血清(杭州四季清公司)；10 mL/L鸡血由来亨公鸡翅下静脉取血，按14加入Alserver液后4保存，使用时用生理盐水配成10 mL/L鸡红细胞悬液；RSV毒种为RSVLong株（香港中文大学），于Hep2细胞中活化增殖，当细胞病变（CPE）达75%以上（）时收获，滴定RSV滴度为1108TCID50(半数感染量)/L； Hep2细胞（武汉大学典型培养物保藏中心），细胞生长液为RPMI 1640中加100 mL/L小牛血清、1105 U/L青霉素及100 mg/L链霉素，细胞维持液除小牛血清为20 mL/L外，其余同细胞生长液；中药荔枝核黄酮类化合物由桂林医学院药理实验室提取分离，经定性试验和盐酸镁粉检测为黄酮类化合物，总黄酮含量达853 g/kg，将药物用纯净水配成100 g/L 水剂，过滤除菌；阳性对照药病毒唑（又名利巴韦林， Ribavirin，湖北医工所，批号0301006），用生理盐水稀释至100 g/L备用. 1.2方法 1.2.1药物对Hep2细胞的毒性作用根据文献5检测药物对Hep2细胞的毒性作用. 用胰酶将生长良好的Hep2细胞分散成单个细胞悬液，按1108/L的细胞密度分种于40孔板，每孔0.1 mL. 置37, 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h. 待细胞长成单层后弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每种浓度重复4孔，并设正常细胞对照. 继续培养48 h后弃培养液上清，每孔加入含5 g/L MTT的无血清MEM培养基50 L，置CO2培养箱中继续培养23 h后弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液（DMSO： 乙醇体积比为11）100 L，振荡510 min，待结晶完全溶解后于96孔酶标测定仪上测定A570 nm值，并根据下式计算细胞存活率，计算药物对细胞的最大无毒浓度范围. 细胞存活率（%）=（实验孔A570 nm/对照孔A570 nm）100%. 1.2.2药物对RSV增殖的抑制作用在已长成单层Hep2细胞的40孔板上接种RSV，每孔50 L（100 TCID50），33吸附90 min后弃病毒上清. 根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度范围内加入不同浓度的含药维持液，每孔0.2 mL，然后将RSV培养板置33，50 mL/L CO2培养，每日观察CPE. 隔日换新鲜含药维持液. 实验同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和药物组. 当细胞发生病变时，细胞出现肿胀、变圆，折光性减弱，有合胞体形成. CPE记录方法为： -为无CPE，+为1%至25%细胞出现CPE. 为26%至50%细胞出现CPE；为51%至75%细胞出现CPE；为76%至100%细胞出现CPE. 约在病毒对照孔为时弃培养液上清，每孔加入含5.0 g/L MTT的培养液50 L，继续培养23 h后洗去MTT上清，每孔加DMSO溶解液100 L，混匀510 min后测A570 nm值. 并按下述公式计算药物对RSV抑制率. 病毒抑制率（%）=（药物处理组A570 nm-病毒对照组A570 nm）/（细胞对照组A570 nm-病毒对照组A570 nm）100%. 统计学处理： 用统计软件PEMS 3.1的加权直线回归法计算药物半数毒性浓度TC50和半数有效浓度IC50，得到药物治疗指数（Treatment Index, TI=TC50/IC50）. 2结果 2.1药物对Hep2细胞毒性作用表现Hep2细胞变圆，壁厚，胞质内颗粒增加，折光性增强. 不同浓度的荔枝核黄酮类化合物对Hep2细胞存活率的影响结果见表1. 表1不同浓度的荔枝核黄酮类化合物对Hep2细胞存活率的影响（%） 药物药物浓度（mg/L）10204080160320640800160050%毒性 浓度TC50BHDG2，WK7*4/5ZQ，WK6DW，WK5DW，WK6DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK5DW，WK7DWW荔枝核黄酮类化合物100.080.574.364.053.035.125.512.48.6152.9病毒唑100.080.276.565.052.534.225.113.28.5154.9 2.2药物对RSV增殖的抑制作用RSV对Hep2细胞CPE表现为细胞肿胀、变圆，折光性减弱，有合胞体形成. 根据细胞毒性实验的结果，选择在无毒浓度范围内，将药物分别以不同的浓度进行抑制RSV实验，其病毒抑制率见表2.表2不同浓度的荔枝核黄酮类化合物作用后RSV病毒抑制率的变化 3讨论 RSV属于副黏病毒科肺炎病毒属，均为单负股RNA病毒，按血清学确认有两种亚型(A和B).在生物学表现方面RSV比其他病毒更接近于流感和副流感病毒,但在血清学和其他方面(例如不能在鸡蛋中生长及产生血凝素)可与之进行鉴别. RSV亚型每年反复流行，患者可反复感染. 虽然在5岁儿童中有70%存在血清抗RSV的抗体,但感染仍可不断发生于任何年龄. 几乎所有2岁以下的儿童都有过RSV感染6. 近年来又发现RSV感染是老年人和免疫抑制成人的重要病毒7. 目前对RSV感染仍缺乏特异有效的治疗方法. 病毒唑被证明可以用于治疗RSV感染，但由于其毒性较大，只能雾化吸入，并且近年来随着对其疗效的争议使其临床应用受限8. 目前尚无安全有效的抗RSV感染的疫苗，因此抗RSV药物的研究成为近年来国际医药学界瞩目的课题. 近来有报道甘草、咽康片等在体外对RSV有抑制作用9-10，通过对抗病毒中草药筛选研究，我们发现荔枝核黄酮类化合物具有较强的抗RSV的功能，从结果可知随荔枝核黄酮类化合物浓度增加，抗病毒活性增强，表现为病毒抑制率升高. 经直线回