（果树学专业论文）草莓再生体系的优化及转JERFlt33gt基因提高其抗病性的研究.pdf

摘要 草莓是一种重要的多年生常绿草本植物，其果实味道鲜美，营养丰富，经 济价值高，既可用于鲜食，又可用于加工，深受人们的喜爱。但由于各种病害 的危害，草莓的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性对草莓生产具 有重要的实际意义。草莓转基因已有成功的报导。 通过转基因的手段来增强植物的抗病性是一种行之有效的方法，转入特定 的病程相关基因( p r 基因) 能增强植物对某种或某几种特定病害的抵抗能办， 但要获得多抗、高抗的品种，就必须同时转入多个基因，就目前技术而言是难 以做到的。导入调节抗逆基因表达的转录因子基因可能对全面增强作物抗逆性 提供了一种全新的途径。 本研究主要以丰香、章姬为试材，对再生体系进行了优化，在此基础上， 利用农杆菌介导法将转录因子基因j e r f 刀基因导入草莓中。对抗性植株进行 p c r 、d n a 点杂交检测，获得了转基因草莓植株。对转基因植株接种炭疽病试 验发现，其抗炭疽病能力显著增强。 本试验获得的主要结果如下： 1 建立了丰香、章姬的叶片高效再生体系，其再生率均达到1 0 0 ，其中 丰香最适培养基配方为1 2 m s + 2 ，4 - 1 1 3 0 1 0 m g i , + t d z 4 0 m g l ，其平均再生芽数 为3 5 个，章姬最适培养基配方为1 2 m s + 2 ，4 - d 0 0 7m g l + t d z 4 0m g l ，平 均再生芽数目达到4 6 个。 2 草莓叶片外植体进行一个星期的暗培养有利于其不定芽再生率的提高。 3 对章姬草莓叶片进行转基因，经过k m 筛选再生出的植株进行p c r 检 测，其阳性率为5 4 ：对p c r 检测的阳性株进行d n a 斑点杂交，其阳性率为 6 6 7 。证明本研究已成功地将j e r f 3 3 基因导入章姬草莓中。 4 对转j e r f 3 3 基因草莓叶片进行针刺法接种炭疽病，结果表明转基因株 与对照株相比其抗性显著增强。 关键词：草莓再生体系遗传转化3 e , f f 3 3 基因抗病性 a b s t r a c t s w a w b e r r yi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta n dp o p u l a rc r o p sm o u n d t h ew o r l df o r i t sd e l i c i o u st a s t e 、r i c hn u t r i e n ta n de c o n o m i cv a l u e s h o w e v e r , p r o d u c t i v i t ya n d q u a l i t ya l eg r e a t l ya f f e c t e db yp a t h o g e na t t a c k , a l t h o u g hi m p r o v i n gi t sr e s i s t a n c eh a s b e e ns t u d i e df o ral o n gt i m e i ti sl a b o r i o u sa n ds l o wt oc r e a t ean e we a l t i v a rw i t h l l i 曲一m u l t ir e s i s t a n c ea n dh i g hy i e l da n dq u a l i t yt h r o u g ht r a n s f e rs i n g l ep r ( p l a t h o g e n r e l a t e d ) g e n e s ot r a n s f e r r i n gg e n ee n c o d i n gu a n s c r i p t i o nf a c t o ri n t oc r o pp l a n t s m a yp r o v i d ean e wa p p r o a c ht oi m p r o v i n gc r o pp l a n t sw i t he n h a n c e 、dp rg e n e e x p r e s s i o na n d d i s e a s er e s i s t a n c e t h er e s e a r c hu s i n gs t r a w b e r r yf e n g x i a n ga n dz h a n g j i 鹤m a t e r i a l s t h e o p t i m i z a t i o no fr e g e n e r a t i o ns y s t e m o fs t r a w b e n yl e a fw a se s t a b l i s h e d j e r f 嚣 g e n ew a s 仃a n s f e r r e d t oz h a n 舀i ，t h e nt h ep l a n tw e r ep r o v e da s t r a n s g e u l cp l a n t s b yp c e 、d n ad o th y b r i d i z a t i o n t h em a i nr e s u l t sa r e f o l l o w i n g ： 1 ah i g he f f i c i e n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mf o rs t r a w b e r r yl e a v e sw a se s t a b f i s h e d t h eh i g l le f f i c i e n tm e d i af o rf e n g x i a n g i s1 2 m s + 2 , 4 - d 0 t o m e t , + t d z4 0 m 妒。， a n df o rz h a n # i s l 2 m s + 2 4 _ d o 0 7 m g l + t d z4 0 m g l , b o t ho f t h er e g e n e r a t i o n m t ea r e1 0 0 t h ea v e r a g en u m b e ro fr e g e n e r a t es h o o tp e rl e a ff o rf e n g x i a n gi s 3 5 ，f o rz h a n g j ii s4 6 2 o n ew e e ko f d a r kc u l t u r ei sb e n e f i tf o rr e g e n e r a t i o no fs t r a w b e r r yl e a v e s 3 w a u s f e r j e r f ： 3g e n ep l a n t s w e r ep r o v e d b yp c ra n dd n ad o t h y b r i d i z a t i o n t h ep o s i t i v er a t e a r e5 4 a n d6 6 7 4 t h er e s u l to fi n o c u l a t i o no fa n t h r a e n o s es h o wt h a te c t o p i ce x p r e s s i o no f j e r f 3 3g e n ei l lt r a n s g e n i cs t r a w b e r r yp l a n t se n h a n c e dt h er e s i s t a n c eo ft h ep l a n t e d t o t h ep a t h o g e n k e yw o r d s ：s t r a w b e r r y g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nr e g e n e r a t i o ns y s t e m j e r f 3 _ ，t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rg e n e d i s e a s er e s i s t a n c e 英文缩写 2 ，4 一d 6 - b a a b a a m p a s b z c a m v c ! a r b c o r d r e d r e b e t e r e e r e b p e r f g u s i a a j a j e i u b j e r f k m 0 d p c r p r r d 硒f r p m s a s a r e t d z 缩略词表 英文名称 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d n 6 - b e n z y la d n i n e a b s c i s i ca c i d a m p c i l l i n 3 , 5 - m e t h o x y - 4 - h y d r o x y a c e t o p h e n o n e b a s i cr e g i o nl e u c i n ez i p p e r c a u f i f l o w e rm o s a i c m s c a r b e n i c l l i nn a 2s a l t c o l d - r e g u l a t i o n d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t d e h y d r a t i o n - r e s p o n s i v ee l e m e n t b i n d i n gp r o t e i n e t h y l e n e e t h y l e n er e s p o n s i v eh e m e n t e t h y l e n er e s p o n s i v eh e m e n t b i n d i n gp r o t e i n e t h y l e n er e s p o n s i v eh e m e m b i n d i n g f a c t o r 1 3 - g l u c u r o n i d a s e i n d o l 一3 - a c e t i ca c i d j a s m o n a t i ca c i d j a - a n de l i c i t o r - r e s p o n s i v ee l e m e n t j a s m o n a t i ca n d e t h y l e n er e s p o n s i v e e l e m e n tb i n g d i n gf a c t o r k a n a m y c i ns u l f a t e o p t i c a ld e n s i 哆 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p a t h o g e nr e l a t e d r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n r i f a m p i n r o u n d sp e rm i n u t e s a l i c y l i ca e q u a i r e dr e s i s t a n c e s a l i c y l i ca c i dr e s p o n s i v ee l e m e n t t h i d i a z u r o n 1 1 1 中文名称 2 ，4 一d 酸 n 6 - 苄基腺嘌呤 脱落酸 氨苄青霉素 乙酰丁香酮 碱性亮氨酸拉链 花椰菜花叶病毒 羧苄青霉素 低温调控制 早应答元件 干旱应答元件结合蛋白 乙烯 乙烯应答元件 乙烯应答元件结合蛋白 乙烯应答元件结合因子 b 一葡萄糖醛酸糖苷酶 吲哚乙酸 茉莉酸 茉莉酸激发因子应答元件 茉莉素乙烯应答元件 结合因子 卡拉霉素 光密度 聚合酶链式反应 病程相关 干旱应答 利福平 每分钟转速 系统性获得抗性 水杨酸应答元件 n - 苯基n - 1 ，2 ，3 - 噻二唑- 孓脲 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 时间：。 关于论文使用授权的说明 年月八日 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 孓：l 耳 一、 叫 i 导师躲穆闰n 净、 时间； 。、年6 月j 百 日搁：卅年么月纠日 1 草莓生产概况 第一章前言 草莓是一种多年生常绿草本植物，园艺学上将其归为浆果类。草莓果实以 其色泽鲜丽，芳香浓郁，果肉柔嫩多汁，酸甜适度，味道鲜美，营养丰富而深 受世界各国人民的喜爱。2 0 世纪后期，在世界各国草莓消费需求量持续增长的 推动下，草莓栽培规模以及产量得到迅速扩增，全球栽培面积由1 9 6 1 年的9 万h m 2 ，总产量7 5 万t 到1 9 8 1 年分别增加到1 6 万h m 2 和1 7 5 万t ，到2 0 0 4 年又 分别增加到2 9 h m 2 和4 8 0 万t 。 我国草莓病害的感染率高达8 0 2 ，灰霉病、白粉病是各地常见的真菌病 害，特别是灰霉病，已给不少地区造成严重的损失。自1 9 9 1 年上海首次发现 炭疽病以来，多年连作的草莓苗圃炭疽病危害有持续上升的趋势，尤其是匍匐茎 大量抽生的5 8 月，发生更为严重，某些感病品种几近毁灭。大田栽培中，草 莓苗一旦感染炭疽病，很难用药剂防治，最终导致小苗大量烂心死亡。传统的 提高草莓抗病性的育种方法存在时间长与工作量大的缺点，基因工程技术育种 能克服这些缺点，因此基因工程技术为增强草莓的抗病性提供了一种可行的方 法。 2 草莓离体再生与遗传转化研究进展 2 1 草莓无菌苗高效再生体系建立进展 草莓高效再生体系的建立是对其进行转基因的前提之一，草莓再生体系的 研究也是目前国内研究得较多的项目。其中再生培养基中以1 2 m s 为基本培养 基，不同的基因型，不同的外植体，不同的p h 值，生长调节剂的种类、配比 与浓度，以及a g n 0 3 对草莓叶片不定芽的再生均具有显著的影响【1 2 3 4 5 6 7 1 。 2 1 1 基因型对草莓再生能力的影响 张志宏【8 1 报导，基因型是影响草莓再生的一个重要因素。王海波等即通过 对四种草莓品种进行不定芽再生试验，得出不同草莓品种之间再生能力差异显 著的结果。 2 1 2 外植体类型对再生能力的影响 草莓叶片、叶柄等都可作为草莓再生的外植体，曾球n ”、吴雪梅1 0 l 等通过 再生能力比较发现同一基因型草莓中，再生能力是叶片( 叶片叶龄为3 0 d ) 叶柄。 2 1 3 外植体年龄对草莓再生能力的影响 于冬梅凹【l 习报导，2 0 - 3 0 天的草莓叶龄为诱导分化不定芽的最适叶龄， 而王海波报导，叶片以2 8 - 4 0 天的为适宜，不定芽分化率最高。 2 1 4p h 值对草莓再生的影响 普通培养基p h 为5 8 t 1 3 1 。通过尹淑萍等1 4 1 “嘲研究发现，再生培养基的p h 在5 4 到6 0 之间对叶盘的再生效率无显著性的差异。但在p h 低于5 4 时，培 养基很难凝固，在p h 高于6 0 时，影响到草莓不定芽的再生。 2 1 5 生长调节剂的种类、配比与浓度对草莓叶片分化不定芽的影响 2 1 5 1t d z 与2 ，4 一d 搭配对草莓不定芽再生的影响 张崇波悯、闫华晓1 7 1 1 1 8 、张志宏等0 9 研究发现，丰香的叶片在 1 2 m s + t d z 2 0 m g l + 2 , 4 - d 0 1m g l 培养基上再生频率可达6 4 ，t d z 可能是 “丰香”和“鬼怒甘”叶片再生出不定芽的主要影响因素。 2 1 5 2t d z 与n a a 搭配对草莓不定芽再生的影响 王建湘2 0 1 以叶龄为3 0 d 的草莓叶片为试材，发现“丰香，和“红丰”两个品种 在6 - b a 和n a a 组合的培养基上再生率低于4 0 ，在1 2 m s + t d z l 5m g l + n a a 0 0 5m g l 的培养基上再生率较高，分别达到7 2 3 和6 6 7 。王密恰【2 l 】 研究发现“全明星”、“新明星”两个品种在1 2 m s + t d z lm g l + n a a 0 0 5m g l 培养基上再生率分别达到9 3 和9 6 7 。张利义雎习等研究发现，全明星在 i 2 m s + t d z l 5m g l + n a a 0 0 5m g l 再生效果好，再生率高达8 6 6 ，陈琴芳i 2 3 研究发现，草莓培养基中随着t d z 浓度的增加，“丰香巧矿章姬”的再生频率及 每个外植体平均再生芽均有提高，章姬在t d z 8 0m g l 时再生率最高为6 0 5 丰香则在t d z 2 0m g l 时再生率最高为5 8 。 2 1 5 3t d z 与i b a 搭配对草莓不定芽再生的影响 吴雪梅发现，丰香叶片在1 2 m s + t d z 2 0m g l + i b a 0 ，8m g l 条件下不定 芽再生率达7 5 6 7 。 2 2 1 5 4t d z 与i a a 搭配对草莓不定芽再生的影响 魏源文等例研究发现，1 2 m s + t d z 2 0m g l + i a a 0 2 5m g l 使丰香叶片再 生率达到8 8 。 2 1 5 56 - b a 与i b a 搭配对草莓不定芽再生的影响 吴雪梅发现章姬在1 2 m s + 6 - b a 2 0m g l + i b a 0 4m g l 培养条件下不定芽 诱导率为8 3 3 。曾剐1 q 发现“章姬”叶片在1 2 m s + 6 b a 5 0m g l + i b a 0 1 m g l 条件下叶片再生率为6 0 o ，“丰香”“幸香”草莓叶片在1 2 m s + 6 - b a 5 0 m g l + i b a 0 1m g l 条件下为3 0 3 和3 2 4 。 2 1 5 66 - b a 与2 ，4 - d 搭配对草莓不定芽再生影响 王海波【卅发现，草莓“丰香”叶片在1 2 m s + 6 一b a 3 0m g l + 2 , 4 - 0 0 2m g l 下培养再生植株率达到4 0 。 2 1 6a g n 0 3 对草莓叶盘不定芽再生的影响 a g n 0 3 作为乙烯合成的抑制剂，可有效的防止植物细胞在离体培养过程中 乙烯的积累对外植体生长和不定芽分化的影响，并可显著提高植株的再生频 率，陈琴芳【捌报导a g n 0 3 的浓度过高( ) 1 2 m l ) 则分化率显著降低，这可能是 因为a g + 为重金属离子，对植物细胞的生理、代谢有一定的毒害作用。 2 2 草莓遗传转化研究进展 自n e h r a 首次建立草莓再生体系并得到草莓转基因植株以来，已有很多国 内外学者利用转基因手段对草莓进行过遗传改良。用于转化草莓的外源目的基 因有：改善果实品质基因嘲嘲、抗虫基因嘲闭卿、抗除草剂基因 3 0 1 p 1 】【如、 抗真菌基因【3 3 】、抗病毒基斟蚓等等。使用在草莓遗传转化上的方法主要有农杆 菌介导法瑚【硐i 韧 3 s l 3 9 1 4 0 1 、基因枪法【4 1 】 4 刁 。t 3 1 、以及电击法嗍。 2 2 1 外植体对转化效率的影响 2 2 1 1 基因型对转化效率的影响 基因型不同对草莓的转化效率有直接的影响。陈琴芳 2 0 l 报导，草莓品种丰 香和章姬在同样的培养和转化条件下，章姬分化出抗性芽的比率为3 2 ，丰香 为2 5 。 2 2 1 2 叶龄对转化效率的影响 叶片的年龄关系到叶片细胞分裂能力的强弱，而处于旺盛分裂期与否与草 莓的转化是相关的，所以叶龄影响到转化效率。 2 2 2 预培养时间对转化效率的影响 尹淑萍【1 4 1 研究发现，草莓叶片预培养4 天后，叶盘边缘细胞开始旺盛分裂， 此时对农杆菌的侵染较敏感，有利于t - d n a 的整合。当预培养时间过长时( 6 天) ，伤口快要愈合时，创伤所产生的小分子酚类物质逐渐减少，细胞已处于转 化的不敏感期，不利于农杆菌的侵染及t - d n a 的整合，使转化频率降低。袁 维风研究发现，预培养时间为2 4 天时，其转化效果较好。未经预培养的叶片 经农杆菌侵染后，切口易褐化，这可能是导致转化效率下降的主要原因。 2 2 3 农杆菌侵染对转化效率的影晌 2 2 3 1t 程菌液的浓度 闫华晓嗍报导，植物细胞的转化首先需要一定数量的农杆菌与细胞壁的接 触即贴壁，所以菌液浓度对转化频率有一定的影响，菌液的浓度过高或过低， 均不利于其转化，浓度过高就会导致受体被农杆菌感染致死，浓度过低就没 足够的农杆菌附着于外植体切口处导致转化细胞数量很低。因此，调整工程自 液浓度是成功转化的重要步骤之一。袁维风【4 5 】报导o d 6 0 0 值为0 3 - 0 5 的工翟 菌侵染液对草莓的遗传转化最适宜。 2 2 3 2 工程菌液侵染的时间 闫华晓【l 叼对草莓叶片采用不同侵染时间的研究表明，在o d 鲫值为0 5 自 条件下，叶盘在菌液中侵染时间长短对转化率有一定的影响。浸泡时间太短( 爿 于5 r a i n ) ，虽然芽再生率高，但达不到转化的目的；浸泡时间太长又会损伤 至淹死叶片。浸泡1 0 1 5 r a i n ，抗性芽再生的效率较高，浸泡时间达到3 0 m i n 上时，叶片受伤害程度严重，并且农杆菌在共培养时大量繁殖，在选择培养考 中仍然有大量的农杆菌生长，最终导致叶片坏死，不能再生出不定芽。即侵舅 1 0 m i n 是较适宜的。但k a s c h e s t i b r a t o v ， s v d o l g o v 所用侵染时间， 3 0 r a i n l 4 6 1 。袁维风报导菌液浓度为o d 6 0 0 = o 3 _ 0 5 时，侵染时间为3 - 5 r a i n 最魂 宜，转化效率最高。当菌液浓度为o d o = 0 9 ，侵染时问为7 m i n 时，叶片切 褐化较严重，在随后抑菌培养中农杆菌不易被去除，最终导致转化率大大降低 王海波1 9 】报导，用o d 甜o = 0 3 ，农杆菌菌液对外植体进行不同侵染时间的比较， 4 g u s 染色表明，侵染6 0 r a i n 的处理表达量最高，但l s d 检验分析表明侵染6 0 r a i n 与侵染3 0 m i n 的g u s 表达量无显著差异。说明在此体系下，侵染3 0 - 6 0 r a i n ， 都可获得比较理想的转化效果。只侵染1 5 r a i n ，g u s 斑点数明显降低。侵染 6 0 r a i n 的处理中，外植体在共培养和选择培养过程中表现出了与其它处理一样 的形态特征，无切口褐化、死亡现象，说明矮丰草莓品种对农杆菌e h a l 0 5 株 系耐受能力较强，侵染6 0 r a i n 不会导致受伤过度。陈琴芳报导，当农杆菌侵染 5 m i n 时，草莓外植体的出愈率最低，随着接种时间的延长，抗性愈伤和芽的形 成数量有不同程度的提高，当时间达2 0 n f i n 时，达最高值，丰香转化芽再生频 率达3 2 ，章姬转化芽再生频率达2 ，5 9 ，接种时间延长至3 0 m i n 时，抗性 愈伤和芽的形成数量略有所下降。由此推测，侵染时间可能与不同的转化材 料和农杆菌株以及工程菌液的浓度有关。 2 2 3 3a s 对转化效率的影响 尹淑萍 4 5 1 报导，经a s 浓度为1 0 0m g l 处理的叶柄，转化频率由对照的 8 3 3 提高到了1 8 3 3 。袁维风报导，a s 等酚类化合物对农杆菌介导的遗传 转化是十分有利的，当a s 浓度为1 0 0m g l 时，转化效率较高，且将a s 加入 菌液中的转化效果好于加入共培养基中。 2 2 4 共培养对转化效率的影响 陈琴芳 2 0 1 研究发现，外植体与农杆菌共培养能显著提高抗性愈伤诱导率和 芽再生频率。农杆菌侵染后立即进行选择，抗性愈伤诱导率和芽再生频率均低， 而共培养l 天后，抗性愈伤诱导率和芽再生频率均大幅度提高；共培养3 天后 达最高值，丰香抗性愈伤率为3 9 ，芽再生频率为3 4 ，章姬抗性愈伤率为 3 0 ，芽再生频率为2 6 ；延长共培养时间至4 _ 5 天，分化率不再提高。尹淑 萍【1 3 】报导，对于农杆菌l b a 4 4 0 4 介导的转化，在2 - 4 天的共培养时间范内，都 得到了较好的结果，以共培养4 天为佳。袁维风【4 5 】报导，共培养2 天时转化效 率最佳，而当共培养时间为6 天时，农杆菌大量繁殖，在以后的培养中难以去 除。王海波【5 1 研究发现，随着共培养时间延长，农杆菌菌斑增殖量呈上升趋势。 共培养至3 天时刚刚能够看出外植体下的农杆菌斑迹，培养至5 - 7 天，在外植 体周围可见过度增殖的农杆菌菌斑，g u s 表达量开始下降。 2 2 5 延迟培养与选择性培养 袁维风报导，延迟二周筛选的转化效率较对照有显著的提高，延迟一个 月时，也能得到较高的转化率，但由于时间过长，使大量的非转化细胞对转化 细胞形成强大的竞争压力，容易形成嵌合体。尹淑萍【1 3 1 报导，对于“土特拉” 这一脱分化和再分化所需时间较长的基因型，前期选择不利于转化细胞的生 长，未能获得转化芽，因而不宜进行前期选择，可采取延迟选择或后期选择的 方式。对于“丰香”，延迟选择和后期选择都明显提高了转化率，尤以后期选择 更为明显。对于“哈尼”，前期选择和延迟选择对转化率的影响不大，但后期 选择同样促进了转化率的提高。因此，对于草莓叶盘的遗传转化，共培养之后 不宜立即进行抗性筛选，而在脱菌培养基中恢复生长一定阶段，对于获得转化 体很重要。后期选择时，抗生素能够有效地淘汰非转化芽，从而避免嵌合体的 产生。 3 e r f 类转录因子 胁迫应答基因的诱导表达主要发生在转录水平，特定胁迫应答基因的时空 表达调控是植物胁迫应答反应的重要部分。植物基因组中有一大部分被用于转 录调控，例如拟南芥基因组就编码1 5 0 0 多个转录因子。这些转录因子通常属 于大的基因家族，其中某些家族是植物特有的。近几年来，研究较热并取得较 大进展，其成员与植物胁追应答有关的基因家族有：乙烯应答元件结合因子 ( e t h y l e n e - r e s p o n s i v e - e l e m e n tb i n d i n gf a c t o r , e l u q 、( b a s i c - d o m a i n l e l i e i n e - z i p p e r ，b z i p ) ，w r k y 蛋白和m y b 碱性亮氨酸拉链蛋白等1 4 7 1 。 3 1e r f 蛋白的结构特征及其功能特性 3 1 1e r f 蛋白的d n a 结合结构域及其d n a 结合特性 e r f 蛋白，以前称之为e r e b p s ( e t h y l e n e - r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n g p r o t e i n s ，乙烯应答元件结合蛋白) ，最先是从烟草中作为g c cb o x 结合蛋白分 离出来的网。e r f 蛋白具有一个高度保守的含有5 8 或5 9 个氨基酸的d n a 结合结构域饵r f 域，e r fd o m a i n ) 【4 司、1 4 9 。e r f 域的水溶液结构表明该结构及 其d n a 识别模式都是新型的嗍。现在从不同的植物中分离出大量编码e r f 蛋 白的基因，如：拟南芥的c b f i i s l l 、d r e b i 和d r e b 2 5 2 1 、a t e b p 5 3 1 、e r f f 卅、 6 a t e r f s l 5 5 】，番茄的p t i 4 5 6 【5 6 】，烟草的t s i l 嘲【5 8 】 5 9 1 , n i c o t i a n as y l v e s t r i s 的 n s e r f s 6 0 ! ，长春花的o r c a1 2 6 ”、o r c a 3 嘲，玉米的d b f i1 21 6 3 ，大麦的 c b f 3 6 q ，t a d r e b l 6 5 1 ，水稻的o s e b p 一8 9 6 0 3 ，o s d r e b1 6 7 。拟南芥基因组测 序确定有1 2 4 个编码具e r f 域的蛋白( e r f 蛋白) 的基因，表明单子叶植物和双 子叶植物都含有这一具多个成员的大基因家族，而且该家族现只发现于高等植 物中。在拟兰芥中，有1 4 7 个a p 2 e r e b p 转录因子家族得到发现1 6 8 】 嗍 a p 2 e r e b p 家族分为r a v ，a p 2 ，和e r e b p 亚家族。而e r e b p 亚家族分为 d r e b 和e r f 。e r f 包含6 5 个e r f 基因，包括所有a p 7 e r e b p 基因在内都 与抗病应答有关f r o ，研究表明e r f 基因具有对j a 和e t 应答的作用1 7 1 1 7 2 1 。 利用电泳迁移率变动实验1 2 m s a ) 、顺式作用元件突变分析以及体内瞬 间表达分析，证明拟南芥的c b f l 5 1 1 ，d r e b l 2 5 2 1 和玉米的d b f f 2 【6 3 1 能与 d r e c r t 特异性结合。拟南芥的e r fl 酬和a t e r f s l 5 5 1 ，番茄的p t i 4 5 6 闭， 烟草的e r f s ( 以前称之为e r e b p s ) 能与g c cb o x 特异性结合。而烟草的t s i1 既能与d r e c r t 特异性结合，又能与g c cb o x 特异性结合，但与后者的结合 能力更强些。长春花的o r c a1 2 能与类似g c cb o x 的顺式作用元件特异性结 合1 6 “。另外还发现g c cb o x 中碱基的突变对e r f 蛋白与g c cb o x 结合能力 的影响是不同的。例如，g c cb o x 中碱基的变化对a t e r f l 、a t e r f 2 和a t e r f 5 结合g c cb o x 的能力影响很大，而对a t e r f 3 和a t e r f 4 的影响相对较小【勰j 。 3 1 2e r f 蛋白的转录调节域及其转录调节特性 利用植物细胞瞬间表达分析、酵母瞬间表达分析和转基因植株分析，表 明e r f 蛋白家族中，烟草的e r f 2 ，e r f 4 和t s i l 5 5 1 【5 刀，拟南芥的a t e r f i 2 5 4 8 1 、e r f i1 5 4 、c b f l t 5 ”、d r e bl 2 【5 2 】，长春花的o r c a 2 1 7 4 1 和o r c a 3 7 5 1 ， 番茄的p d 4 5 6 1 7 6 j ； g ue ta l2 0 0 2 在转录调节中起着激活因子的作用：而被归 类于第类e r f s 的n t e r f 3 、a t e r p - b 和a t e r f 4 是转录的主动阻抑蛋( a c t i v e r e p r e s s o r ) m 。 o h t a 等利用烟草细胞瞬间表达和酵母瞬间表达分析了e r f 2 和e r f 4 的 转录激活域，发现e r f 2 的转录激活域位于其羧基末端，e r f 4 的氨基末端和羧 基末端都具有转录激活的功能。在酵母中，e r f 2 和e r f 4 的氨基末端 7 均有转录激活活性，而羧基末端都失去了转录激活活性。p a r k 等检测 了t s i l 在酵母中的转录激活活性，发现其羧基末端1 3 个氨基酸在t s i l 发挥转 录激活因子作用时是必须的。 前面提到属于第类e r f s 的n t e r f 3 。a t e r f 3 和a t e r f 4 是转录的主动阻 抑蛋白。所谓主动阻抑蛋白，是相对被动阻抑蛋e t ( p a s s i v er e p r e s s o r s ) 而言的， 它们含有独立的阻抑区域，并且通过这些阻抑区域的活性直接阻遏转录的起始 【7 3 】。o h m e t a l ( 2 0 0 1 ) 分析了一系列缺失突变结果，得出n t e r f 3 羧基末端的3 5 个氨基酸融合异源d n a 结合域g l a 4d b 能有效地抑制转录。与表达n t e r f 2 ， n t e r f 4 的载体分别共转化，n t e r f 3 的阻抑区域能抑制两者的激活活性。另外， 该阻抑区域与v p l 6 激活域融合完全抑制了v p l 6 的转录激活活性。比较分析 第类e r f 阻抑蛋白的氨基酸序列，发现一个保守序列i f d l n - i 卯( x ) p 。该 基序发生突变将失去阻抑活性，说明该基序是阻抑作用所必不可少的。他们将 该基序命名为e r f 相关两亲阻抑基序饵r f - a s s o c c a t e da m p h i p h i l i cr e p r e s s o r s ( e a r ) m o t i o 。有趣的是，他们还在大量来自小麦、拟南芥和矮牵牛等植物的锌 指蛋i 刍( z i n c f i n g e rp r o t e i n s ) 中发现有这一基序。这些锌指蛋白也是阻抑蛋白， 并且其阻抑区域就是那些含有f a r 基序的区域。 3 1 3e r f 蛋白的核定位信号及其细胞核定位 转录因子必须进入细胞核内才能行使转录调节功能。o h me ta l ( 2 0 0 0 ) 构建 了3 5 s - e r f 2 - g f p ，3 5 s - e r f 3 - g f p 和3 5 s - e r f 2 - g f p 三个融合载体，利用基因 枪分别导入烟草b y - 2 悬浮细胞，结果只在细胞核位置观察到g f p ( 绿色荧光蛋 白) 荧光，而3 5 s - g f p 载体表达后，g f p 荧光弥漫整个细胞。这些结果表明 e r f 2 3 4 是核定位蛋白。 p a r ke ta l ( 2 0 0 1 ) 对推定的t s i 蛋白进行了氨基酸序列分析，发现其n 一末端 区域含有一个碱性氨基酸结构k k r r ，该结构被认为是猿猴病毒4 0 ( v 4 0 ) - - 型的 核定位信号。利用聚乙二醇介导转化烟草b y - 2 悬浮细胞，证明了t s i 蛋白的核 定位能力。g t me ta l l 2 0 0 2 ) 对p t i 4 5 6 进行序列分析，发现它们都具有典型的核 定位信号： p t i 4 ( 1 5 4 - v r v t a k r r a s p e p a s s s g n g s m k r r r k a v q k c - 1 8 5 ) p i t 5 f 5 2 - l q c i g k k y r v r r r p w g k y - 7 0 ) 8 p t i 6 ( 7 6 一k s i g d r k r r s v s p d s d v t r r k k f r g v r - 1 0 3 ) 它们的开放阅读框分别与g u s ( b 一葡萄糖苷酸酶) 融合，利用基因枪转化 烟草w - 3 8 悬浮细胞，通过g u s 组织化学染色，结果表明p 6 4 5 6 是核定位蛋 白。 3 1 4 e r f 蛋白与其它蛋白的互作及其转录激活活性的调控 e r f 2 和e r f 4 的羧基末端在烟草原生质体中具有转录激活活性，而在酵母 中没有。这说明羧基末端功能的发挥需要某些修饰或与其它植物因子的互作 5 3 1 。已有证据暗示磷酸化作用在病原物侵染时激活p r 基因表达具有重要的作 用。烟草e r f 4 和a t e r f s 的羧基末端可以找到脯氨酸介导的蛋白激酶( 如 m a p k ) 的n - j 能磷酸化位点f 3 5 】。利用酵母双杂交系统，已确定了几种e r f 蛋白 家族成员参与的蛋白一蛋白相互作用类型。蛋白p t i 4 、p t i 5 和p t i 6 能与抗病基 因编码的p t o 激酶互作，说明p t o 激酶可能调控蛋白e r f 的功能1 5 6 1 。在体外， p t o 能将p t i 4 磷酸化，并提高其d n a 结合能力。拟南芥乙烯应答元件结合蛋 白( a t e r p ) 能与章鱼氨酸合酶元件结合因子( o b f 4 ) 互作，说明防卫基因的表达 受到蛋白e r f 与碱性亮氨酸拉链蛋白互作的调控。烟草的e r e b p 2 3 和番茄 p t i 4 5 6 能与类似睛水解酶蛋白( n i t r i l a s e - l i k ep r o t e i n , n i p ) 互作，暗示n l p 与 e r e b p s 的互作与防卫反应基因的表达相关 t s l 。因此，可能有多个信号转导途 径通过不同蛋白质- 蛋白质互作而交汇于e r f s ，不同类型的蛋白质调控e r f 家 族中不同成员。 3 2e r f 转录因子在植物胁迫应答中的作用 e r f 转录因子在植物胁迫应答中的作用是e r f 转录因子研究的重要内容， e r f 转录因子基因的表达特性研究为此提供了一定的线索，同时通过转基因植 株分析了e r f 转录因子对下游基因的调控作用以及对提高转基因植株抗逆性 的作用。根据所得的结果，主要在下面两个方面起作用：植物防卫反应和非生 物胁迫应答。个别e r f 转录因子可同时在两者中起作用。 3 ，2 1e r f 转录因子在植物防卫反应中的作用 番茄p t o 基因是一个抗病基因限g e n e ) ，以p t o 为b a i t ，利用酵母双杂交系 统，z h o ue ta 1 ( 1 9 9 7 ) 克隆分离到三个基因p t i 4 5 6 。对番茄植株接种p s e u d o m o n a s 9 s y r i n g a _ ep vt o m a t o ( 简称ps t o m a t o ) 的无毒小种t l ( a v r p t o ) ，在亲合反应和不亲 合反应中，p t i 4 5 都被诱导表达。p t i 4 还受到伤害、e t 和s a 的诱导表达，但 不受j a 诱导。而p t i 5 均不受上述非生物胁迫因素的诱导表达，它可能特异地 应答于生物胁迫因素。因此p t i 4 和p t i 5 在番茄胁迫应答中的作用有所差异【7 9 1 。 p t i 5 的超表达能够提高番茄对p s t o m a t o 抗性，但是并不影响p r 基因的本底 表达，不过能够提高病原菌侵染下cl u b 和c a t a l a s e 的表达。这说明p f i 5 在防 卫基因表达调控和抗病中起促进作用，而且病原菌激活的转录后调控可能是防 卫反应基因病原菌诱导表达所必需的 8 0 l 。w ue ta 1 ( 2 0 0 2 ) 在拟南芥中分析了番茄 基因p t i 4 的功能。利用基因芯片，发现所检测的约8 0 0 0 个基因中有2 8 个基因 在p t i 4 超表达下显著表达，这些基因都是些其启动子中含有g c c - b o x 或类似 g c c - b o x 序列的p r 基因。另外，表达番茄基因p t i 4 的转基因拟南芥植株的表 型与乙烯所处理野生型植株的相似，说明基因p t i 4 参与了具有c k 3 c b o x 的乙烯 应答基因的调控。g ue ta 1 ( 2 0 0 2 ) 也在拟南芥中分析了番茄基因p t i 4 5 6 的功能。 基因p t i4 5 6 在拟南芥中的表达能够激活水杨酸调控基因p r i 、p r 2 的表达， 同时也能激活茉莉素及乙烯调控基因p r 3 、p r 4 、p d f l 2 和t h i 2 1 的表达，但 是三者对它们的激活效应有所差异，其中转基因p t i 4 拟南芥中，p d f l 2 具有 非常高的转录水平。p t i 4 在拟南芥中超表达能够提高其对真菌病原物e r y s i p h e o r o n t i i 和细菌病原物p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t o 的抵抗能力。另外，也发 现番茄p t i 4 基因超表达的拟南芥植株的表型与乙烯所处理野生型植株的相似， 但是与乙烯组成型应答突变体c 仃有所不同，它并不严重地抑制根的生长。因 此，p t i 4 可能只激活乙烯应答途径中的下游环节。他们还发现p t i 4