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2 0 0 8 毕业生年硕士论文 固态发酵法利用茅台酒糟 生产燃料乙醇 中文摘要 从茅台环境通过自然分离得到发酵性能优良的m t l 7 菌株，麦芽汁( 1i 1 2 0 ) 发酵试验残糖仅为0 7 0 ，发酵酒精达到6 9 ( v v ) ，高于t h - a a d y ( 0 9 1 、 6 5 ( v ) ) 。通过正交试验发现，发酵最适条件温度3 2 - 3 6 c ，p h3 6 ，发酵最适 时间8 4 h 。m t l 7 初步归类为酵母属的酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e m v i s i a c ) 。 复合酶最佳配比为：液化酶1 6 u g 酒糟、纤维素酶3 2u g 酒糟、糖化酶6 0u g 酒糟。复合酶中对酒糟样品糖化影响最大的是纤维素酶，其次是糖化酶，影响最 小的是液化酶。添加复合酶比只应用单因子酶效果更好。复合酶适合的温度范围 在5 5 ( 2 左右、p h 值在5 o 左右、作用时间在5 蛀右。 调整酒糟生物质p h 3 0 左右、含水率5 5 - - 6 0 ，接种康氏木霉，按照最佳固态 发酵工艺进行发酵，发酵过程第7 d 后基本发酵完毕。发酵7 d 后纤维素下降了 5 2 4 ，淀粉下降了4 4 8 ，纤维素的利用率最大达至1 j 2 7 1 5 ，淀粉利用率最大 达至l j 4 1 1 1 ，燃料乙醇产率达到6 1 5 。实验证明本课题为酒糟生物质的合理利 用提供了一条途径。 关键词：燃料乙醇酒糟生物质酵母菌固态发酵酶 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 a b s t r a c t t h ea i my e a s tm t l 7w a si s o l a t e dn a t u r a l l yf r o mm o u t a ie n v i r o n m e n t , t h e r ei s o n l y0 7 0 r e s i d u a ls u g a rw h e ni tf e r m e n ti nt h ej u i c eo fm a l t ( 1l 一1 2 0 ) ，a n di tp r o d u c e 6 9 ( v v ) e t h a n o l ，b e t t e rt h a nt h et r - d d yu n d e rt h es a n l ec o n d i t i o n b ya n a l y s i so f e x p e r i m e n t , t h ey e a s tc o u l dn o r m a l l yf e r m e n tp h 3 6 ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r ei s3 2 - 3 6 c ，t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nt i m ei s8 4 h a f t e rp r e l i m i n a r y i d e n t i f i c a t i o n ，m t l7w a si d e n t i f i e da ss a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e t h eb e s tm a t c h i n go fe n z y l n ei st oc o m p o u n d ：l i q u e f a c t i o ne n z y m e ( 1 6 u g d i s t i l l e r sg r a i n s ) ，c e l l u l a s e0 2 t a gd i s t i l l e r 。sg r a i n s ) ，s a c c h a r i f i c a t i o ne n z y m e ( 6 0t a g d i s t - i l l e r sg r a i n s ) i tw a sc e l l u l o s ee n z y m et h a tm a k eal a r g e s ti n f l u e n c eo n a c c h a r i f i c a t i o no fd i s t i l l e r s g r a i n s ，s e c o n d l y i t i sa c c h a r i f i c a t i o ne n z y m e ，t h e l i q u e f a c t i o na l l z y m ei st h em i n i m u m a n dt oa d dt h ec o m p o u n de n z y m e si sb e t t e r t h a nt oo n l ya d dt h es i n g l ef a c t o re n z y m e t h eo p t i m u mo fc o m p o u n de n z y m e s t e m p e r a t u r ei s5 5 ca b o u t ，p s5 0 ，5 hp r e s e r v a t i o ni nw a t e rb a t h i n g a d j u s td i s t i l l e r sb i o m a s sp h 3 0a b o u t ，5 5 - 6 0 o fm o i s t u r ec o n t e n t , i n o c u l a t e t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ( t r 6 ) ，a c c o r d i n gt ob e s ts o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o ne m i l f e r m e n t a t i o ni sf i n i s h e db a s i c a l l yb e h i n dt h e7 d t h ec e l l u l o s ec o n t e n th a sd r o p p e db y 5 2 4 a f t e rf e r m e n t e d7 d , t h es t a r c hh a sd r o p p e db y4 4 8 ，t h ec e l l u l o s i cu t i l i z a t i o n r a t i or e a c h e s2 7 15 t h em o s tg r e a t l y , t h es t a r c hu t i l i z a t i o nr a t i oi sm o s tg r e a t l yu pt 0 41 11 ，t h ep r o d u c i n gr a t eo ff u e le t h a n o li su pt o6 15 t h ee x p e r i m e n tp r o v e st h a t t h i ss u b j e c th a so f f e r e da w a yf o rr a t i o n a lu t i l i z a t i o no f t h ed i s t i l l e r sb i o m a s s k e yw o r d s ：f u e le t h a n o l d i s t i l l e r sb i o m a s sy e a s ts o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n e n z y m e 2 - 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论丈，是本人在导师的指导下，独立进行 研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的科研成果对本文的研究在做出重要贡献的 个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律责 任由本人承担 论文作者签名： 兰! 必 日 期：2 q 遂生鱼旦 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅；苓人授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：之三型蔓导师签名： 日期： 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 前言 目前，世界传统化石能源的供给日益紧张，燃料乙醇作为一种新型的可再生、 清洁能源，得到许多发达国家的关注和重视。我国对燃料乙醇的需求量日益增加。 国内生产燃料乙醇主要利用糖质原料和淀粉质原料生产燃料酒精，原料成本高。 而且粮食是人类赖以生存的重要战略资源，用粮食生产乙醇的发展规模将受到限 制。因此，降低燃料酒精生产成本的一个选择是开发廉价的原料资源。 我国是饮料酒生产和消费的大国，每年都要排放大量白酒酒糟。酒糟生物质 不易保存，极易腐烂变质，发酸发臭，造成了严重的环境污染。因此，寻求一种 新的酒糟生物质利用途径是很有必要的。 本课题通过选育优良的固态发酵高产酒精酵母，研究添加酶对酒糟生物质的 作用效果，优化固态发酵法的生产燃料工艺参数，最大限度生产燃料，对酒糟生 物质资源的开发利用、降低环境污染，开发可再生新能源提供了一条新的途径。 1 酒糟生物质的开发利用 我国年产白酒酒糟达2 0 0 0 万t 以上，量大而集中。目前我国酒糟大多用于医 疗上提取蛋白等高价物质等，或直接用来培养食用茵，制作饲料，生产沼气等方 面的初级利用1 1 3 1 1 $ l p 利用水平和利用率不高、附加值较低。同时酒糟生物质中 的残余糖分、淀粉、丰富的纤维素和半纤维素等资源也不能得到合理的利用，造 成巨大的资源浪费。 而茅台酒如果按5 0 0 0 0 甑丢糟( 每年) ( 每甑丢糟1 i t ) 计算，每年的丢糟量 达到了5 5 0 0 0 t ( 2 0 0 6 年计) 。茅台酒采用传统的生产工艺，经9 次糊化、8 次发酵、 7 次蒸馏后的鲜丢糟残余淀粉含量约为1 1 左右，纤维素在2 0 左右，还原糖在 3 左右，还含有氨基酸、有机酸等大量的营养物质。开发利用价值很大。本试 验在优选高产酒精酵母的基础上，优化发酵工艺，利用茅台丢糟固态发酵法生产 乙醇。而且所得的糟醅仍可用作生产有机肥、产沼气、栽培食用菌等，这就可以 最大限度的增加利用了丢糟的价值，增加了产品的附加值，也增加新能源的开发 途径。 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 2 燃料乙醇的生产 燃料乙醇是2 0 世纪初面市的传统产品，后因石油的大规模、低成本开发，其 经济性较差而被淘汰。随着一些先进农业国劳动生产率的大幅度提高，以及七十 年代中期以来四次较大的“石油危机”，又推动燃料乙醇工业在世界许多国家得 以迅速发展。自巴西、美国率先于七十年代中期大力推行燃料乙醇政策以来，加 拿大、法国、西班牙、瑞典等国纷纷效仿，均已形成了规模生产和使用。 近年来，由于石油、天然气、煤炭等能源的过量开采，中国也已面临严重 的能源危机，寻找新型可替代能源，成为中国未来能源战略的关键。人大常委会 已审议通过了 r c ， 则因素影响b a c 。其中i 、i i 、分别为各对应列( 因子) 上1 、2 、3 水平 效应的值，其计算式是：ii ( u i ，沪第i 列上对应水平( 1 ，2 ，3 ) 的数据和。 k l 为1 水平数据的综合平均，k l = i 水平1 的重复次数。以次类推， k 2 = i 水平2 的重复次数，k 2 = i 水平2 的重复次数。 r 行称为极差，表明因子对结果的影响幅度。 2 2 复合酶糖化效果的研究 2 2 1 纤维素酶用量的研究 纤维素酶( c e l l u l a s e ) 是指能水解纤维素1 3 1 ，4 葡萄糖苷键，使纤维素变成纤 维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。茅台酒鲜丢白酒糟里的纤维素在2 0 左右。在 进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精产率和原料的利用率缩短发酵时 间；可帮助解决能源危机、环境污染和资源浪费问题。 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 本实验所用纤维素酶：4 0 0 0 u g 。操作：将干酒糟粉碎，过4 0 目筛，取2 5 0 9 酒糟放人1 0 0 0 m l 三角瓶中，加水至1 0 0 0 m l ，摇匀，空白样作对照，添加不同 量纤维素酶，n a o h 调p h 4 5 ，放人5 0 水浴中保温2 h ，保持体积不变，过滤， 测粗纤维素、还原糖含量。 2 2 2 液化酶用量研究 液化酶能使淀粉迅速液化而生成低分子。有助于白酒酒糟中的淀粉液化为可 发酵性糖。 本实验所用液化酶：2 0 0 0 u g 。将干酒糟粉碎，过4 0 目筛，取2 5 0 9 酒糟放人 1 0 0 0 m l 三角瓶中，加水至1 0 0 0 m l ，摇匀，空白样作对照，n a o h 调p h 4 5 ，添加 不同量纤维素酶，放人6 0 水浴中保温2 h ，保持体积不变，过滤，测还原糖含量。 2 2 3 糖化酶用量研究 糖化酶是将白酒酒糟中的淀粉液化为可发酵性糖的主要力量。 本实验所用糖化酶：5 0 0 0 0 t e g 。将干酒糟粉碎，过4 0 目筛，取2 5 0 9 酒糟放人 1 0 0 0 m l z 角瓶中，加水至1 0 0 0 m l ，摇匀，空白样作对照，n a o h 调p h 4 5 ，添加 不同量的糖化酶，放入6 0 c 水浴中保温2 h ，保持体积不变，过滤，测还原糖含量。 2 2 4 复合酶正交试验 目的：得到糖化效果最好复合酶配比。 操作：按2 2 1 、2 2 2 、2 2 3 所得的结果设计三因素三水平的正交实验，c 0 2 失 重值作实验指标( 越大越好) 。设计好因素水平后，将干酒糟粉碎，过4 0 目筛， 取2 5 0 9 酒糟放人1 0 0 0 m l 三角瓶中，加水至1 0 0 0 r n l ，摇匀，n a o h 调p h 4 5 ， 按因素水平表添加不同量的糖化酶，液化酶，放入5 0 水浴中保温2 h ，保持体 积不变，过滤，测还原糖含量。 其余方法同2 1 1 0 。 2 2 5 复合酶作用参数的优化 2 2 5 1 温度对复合酶作用效果的影响 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 将干酒糟粉碎，过4 0 目筛，取2 5 0 9 酒糟放人1 0 0 0 m l 三角瓶中，加水至1 0 0 0 m l ， 摇匀，添加( 按比例：液化酶1 6 l g g 酒糟、液化酶3 2u g 酒糟、糖化酶6 0t a g 酒糟) 复合酶，放人不同温度水浴中保温2 h ，保持体积不变，过滤，测还原糖 含量。 2 2 5 2p h 值对复合酶作用效果的影响 将干酒糟粉碎，过4 0h 筛，取2 5 0 9 酒糟放人1 0 0 0 m l 三角瓶中，加水至 1 0 0 0 m l ，摇匀，添加( 按比例：液化酶1 6 u g 酒糟、液化酶3 2t a g 酒糟、糖化酶 6 0t a g 酒糟) 复合酶，调节不同的p h 值，放人5 5 c 水浴中保温2 h ，保持体积不变， 过滤，测还原糖含量。 2 2 5 3 复合酶最佳作用时间的确定 将干酒糟粉碎，过4 0 目筛，取2 5 0 9 酒糟放入1 0 0 0 m l - - - 角瓶中，加水至 1 0 0 0 m l ，摇匀，添加( 按比例：液化酶1 6 u d g 酒糟、液化酶3 2u g 酒糟、糖化酶 6 0t a g 酒糟) 复合酶，调节p h 值5 0 ，放人5 5 c 水浴中保温2 h ，保持体积不变，过 滤，测还原糖含量。 3 酒糟生物质燃料乙醇发酵试验 3 1 设计酒糟生物质燃料乙醇发酵试验采取下面的工艺路线如下图： 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 图1 酒糟生物质发酵生产燃料乙醇工艺路线 3 2 菌种的扩大培养与接种 3 2 1 酵母活化扩大培养： t h a a d y 活性干酵母使用前必须进行正确的复水活化，以3 糖液作活化培 养液。3 0 c 活化2 h 后酵母开始出芽，使3 h - 4 h 活细胞率达n 8 5 以上。 将活化了的m t l 7 菌株、接种试管5 m l 种子培养基，2 8 - - 3 0 恒温培养箱中 培养2 4 h 。转入装有3 0 m l 种子培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，在2 8 ( 2 ，1 5 0 r m i n 下振荡培养1 8 h 。再3 0 0 0 r m i l l 离心1 0 m i n 收集湿菌体。 3 2 2 康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 的活化扩大培养接种 将康氏木霉活化转移至少三次后，从斜面培养基上挑取霉菌孢子，制成孢子 悬液( 1 1 0 6 ) ，取上述悬液按干培养基重的2 接种2 5 0l l l l 三角瓶发酵培养基， 每瓶装料6 0g ，置于3 0 ( 2 ，湿度8 0 左右的恒温恒湿箱中培养，取处于对数生长 期的菌体按3 接种量接种于固态生物反应器培养基。 3 3 发酵工艺的优化 3 3 1 起始酸度对酒糟生物质发酵生产燃料乙醇的影响： 取2 5 0 9 酒糟生物加入5 0 0m l 三角瓶中，添加最佳配比的复合酶( 不经过5 5 保温) ，调整酒糟生物质不同的起始酸度，接入经活化扩大培养的m t l 7 、康氏 木霉菌种，密闭发酵3 d ，测燃料乙醇含量。 3 3 2 不同水分含量对酒糟生物质发酵生产燃料乙醇的影响： 取2 5 0 9 酒糟生物加入5 0 0m l = 角瓶中，添加最佳配比的复合酶( 不经过5 5 保温) ，调节好酒糟生物质起始3 o 左右酸度，接入经活化扩大培养的m t l 7 、 康氏木霉菌种，密闭发酵3 d ，测燃料乙醇含量。 3 4 康氏木霉添加对比试验，以确定康氏木霉的作用效果 取2 5 0 9 酒糟生物力n a s o oi n l 三角瓶中，添加最佳配比的复合酶( 不经过5 5 保温) ，调节好酒糟生物质起始3 0 左右酸度，接入经活化扩大培养的m t l 7 、 康氏木霉菌种，另外不接种康氏木霉作为对照，密闭发酵3 d ，测燃料乙醇含量。 同时作五个对比样。 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 3 5 实验室小型发酵试验 根据上述实验得出的最佳工艺条件，按上工艺路线，进行试验室小型发酵试 验。 取定量酒糟生物加入发酵瓶中，按比例加入复合酶，混匀，用生石灰调节好酒糟生物质 起始3 0 左右酸度，5 5 1 2 保温5 h ，冷却到温度2 4 - - 2 8 c 接入经活化扩大培养的m t l 7 、康氏木 霉菌种，密闭静止发酵发酵过程中每天测纤维素、淀粉、还原糖、燃料乙醇产率。 2 3 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 结果与分析 1 选育固态发酵高产酒精菌种 菌种的优良与否直接关系到燃料乙醇产率的高低，选育出适合的优良酵母， 可起到事半功倍的效果。本课题从酒醅中选育高产的酒精酵母。酵母分离纯化后， 选耐酸、耐酒精的菌株作为出发菌，测其酒精发酵能力，将发酵酒精能力高者进 行生理生化实验，再进行酒精发酵，以选育出优良的菌种。 1 1 样品的富集培养与分离 在茅台酒醅、酒曲、窖底水( 泥) 、土壤、河水、空气等样品中，首先通过 富集培养之后，经平板分离，镜检初步确定为酵母菌后，进一步分离纯化，挑选 在y p d 平板上生长较快、菌落平滑的菌株共3 0 5 株菌为出发菌株。 1 2 初筛 通过t t c 法，选择酵母菌落呈深红色、粉红色产酒精能力强的酵母菌。得到 2 0 株酵母菌，编号为m t l - 2 0 。 1 3 复筛 麦芽汁发酵法：培养后对发酵液进行分析。 表2 复筛发酵结果 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 由表2 分析：菌株m t 4 、m t 6 、m t l 0 、m t l 3 、m t l 7 这五株菌7 2 h c 0 2 失重 达1 5 9 以上。发酵成熟醪残还原糖仅有0 7 0 1 0 0 ，酒精体积分数达到6 5 “9 。 综上分析，此五株菌为复筛性能较为优良的菌株。其q b m t 4 、m t l 7 表现最为优 良，m t 4 、m t l 7 残糖分别仅为0 7 6 、0 7 0 ，发酵酒精体积分数达到6 8 、6 9 。 也高过用于对比发酵的t h - a a d y ( o 9 1 、6 5 ) 。 1 4 温度耐受力试验 对五株菌作温度耐受力试验中，不同温度下发酵液酒精浓度检测结果如下 表： 表3 温度耐受力结果 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 从表3 可以看出，六个样品菌株在3 2 3 6 左右达到了最大的发酵值，是其 最适发酵温度。3 6 以下温度表现较为正常，3 8 c 发酵受到影响，4 0 1 2 以上则明 显受温度的抑制。 所分离出的五株菌中，以m t l 7 发酵力最强，且耐高温效果明显。 1 5 酒精耐受力试验 对五株菌作酒精耐受力试验，把t h - a a d y 作对照样品。 表4 酒精耐受力试验结果 酒精是酵母厌氧发酵的重要产物，但对酵母细胞本身又是毒素和抑制剂。从 上表看出，菌株对酒精的耐受力差别不大，基本都能满足酒精发酵的需求。 1 6 菌株耐乙酸、丁酸试验 测定菌株在乙酸、丁酸存在下的酒精发酵能力，确定菌株对乙酸、丁酸的最 小敏感浓度和最小抑制发酵浓度。测定结果如下表： 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 表6 丁酸耐受力测定结果 从表5 中可以看出，m t l 7 耐乙酸、丁酸t h a a d y 稍强，比较所分离得的五 株菌，m t l 7 也是其中较强的。 1 7 菌株的性能的比较 经过分离纯化、初筛、复筛，耐高温、耐酒精耐力等实验，再结合以下几个 方面进行选优：酶活性较强，酒精生产率高；适于高温发酵，发酵速度较 快；耐酒精能力强，发酵残糖较少；耐酸性强，抗杂菌能力亦强；生产稳 定，发酵时产生泡沫较少；发酵完全发酵时酸度增加较少；能抗重金属， 减少毒害作用：环境适应性强，变异性小。 综合分析，比较上述分离出来的2 0 株菌，可知m t 4 、m t l 7 的酒精生产率明 显高于其它选育菌株；耐高温、耐酒精、耐酸性能力较强；性状也较为稳定，所 以确定m t 4 、m t l 7 为此次选育出的性能较为优良的菌株。 1 8 进行生长曲线的测定，确定菌体生长规律 1 8 1m t 4 菌株生长曲线的测定绘制： 2 0 0 8 毕业生年硕士论文 1 4 1 2 1 趔0 8 宕o 6 o 4 0 2 0 03691 21 51 82 12 4 培养时间( h ) 图1m t 4 菌株生长曲线 1 8 2m t l 7 菌株生长曲线的测定绘制： 1 4 1 2 1 趔0 8 宕0 6 0 4 o 2 0 03691 21 51 82 12 4 培养时间( h ) 图2m t 4 菌株生长曲线 由生长曲线看出：m t 4 、m t l 7 菌株在耗氧条件下培养，在3 - - 9 h 2 _ 问表现出 明显的对数生长期。2 1 d , 时后细