（病原生物学专业论文）病原真菌对淡色库蚊致病力的研究.pdf

学位论文独创性声明 i t l li ii i i t i l l uilll1 1 1 1 1i i l 。 17 6 5 4 71 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医 学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及 申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论 文或成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。 论文作者签名： 导师签名： 目录 中文摘要l 英文摘要3 前言5日u 蟊5 第一部分菌株生物学特性9 l 材料与方法9 1 1 菌种来源9 1 2 培养基9 1 3 仪器与试剂9 1 4 操作条件1 0 1 5 菌种形态描述1 1 2 结果与分析1 1 2 1 g i m 3 4 2 8 1 1 2 2g i m 3 4 5 1 ：1 2 3g i m 3 4 3 6 1 2 2 4g i m 3 4 3 1 1 2 2 5g i m 3 9 5 1 2 第二部分五种致病真菌对淡色库蚊幼虫的致病性研究1 4 1 材料与方法15 1 1 供试菌株1 5 1 2 供试虫源1 5 1 3 实验用培养基1 5 1 4 孢子悬浮液的配制1 5 1 5 五种菌株对淡色库蚊幼虫的致病力测定1 6 1 6 统计分析l6 2 结果与分析1 6 2 1 五株致病真菌处理的淡色库蚊幼虫的死亡率1 6 2 2 感染五株致病真菌的淡色库蚊幼虫的逐日累计死亡率1 7 3 小结18 第三部分球孢白僵菌对淡色库蚊的致病力1 9 1 材料和方法19 1 1 供试菌株19 1 2 供试虫源l9 1 3 试验用培养基2 0 1 4 孢子悬浮液的配置2 0 1 5 生物测定2 0 1 6 统计分析21 2 结果与分析2 1 2 1 球孢白僵菌g i m 3 4 2 8 对对淡色库蚊不同龄期幼虫的致病力2 l 2 2 球孢白僵菌g i m 3 4 2 8 对淡色库蚊卵孵化率的影响2 2 2 3 淡色库蚊幼虫密度对菌株致病力的影响2 2 3 小结2 3 第四部分球孢白僵菌冷冻株与正常株对淡色库蚊的致病力比较2 5 1 材料和方法2 5 1 1 供试菌株2 5 1 2 供试虫源2 5 1 3 试验用培养基2 5 1 4 孢子悬浮液的配置2 6 1 5 生物测定2 6 2 结果与分析2 6 3 小结2 7 第五部分球孢白僵菌在淡色库蚊种群中的传递作用研究2 8 1 材料和方法2 8 1 1 供试菌株2 8 1 2 供试虫源2 8 1 3 试验用培养基2 8 1 4 孢子悬浮液的配置2 8 1 5 生物测定2 9 2 结果与分析2 9 3 小结3 0 结论3l 参考文献3 3 综述：应用绿僵菌防治害虫的研究进展3 8 攻读学位期间获得的研究成果5 2 致谢5 3 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 专业：病原生物学 研究生：韦玮 导师：公茂庆研究员 中文摘要 本研究测定了五株不同来源的白僵菌、绿僵菌、淡紫拟青霉对淡色库蚊幼虫 和卵的致病力，并对五株菌株生物学特性进行研究，筛选出致病力强、作用速度 快的球孢白僵菌菌株b e a u v e r i ab a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n 。在此基础上测定了 球孢白僵菌对淡色库蚊卵孵化的影响以及对不同龄期淡色库蚊幼虫的致病力，研 究了菌株对不同密度蚊幼虫的致病力，初步研究了该菌株在淡色库蚊种群中的水 平传递能力。现将主要结果分述如下： ( 1 ) 五种致病真菌对淡色库蚊幼虫的致病性研究：用五株不同来源菌株分 别对淡色库蚊三龄幼虫进行致病力测定。结果表明：菌株g i m 3 4 2 8 、g i m 3 4 3 1 、 g i m 3 4 5 、g i m 3 4 3 6 以及g i m 3 9 5 对淡色库蚊幼虫均具有致病性，五种致病真 菌处理蚊幼虫，蚊幼虫死亡数随时间的延长而增多，其中菌株g i m 3 4 2 8 的致病 力最强，在接菌1 0d 后，淡色库蚊幼虫的死亡率达1 0 0 ，是淡色库蚊微生物防 治的优良菌株。 ( 2 ) 球孢白僵菌g i m 3 4 2 8 对淡色库蚊的致病力：球孢白僵菌对淡色库蚊 l 、2 、3 、4 龄幼虫均具有致病性，随作用时间的延长，死亡蚊幼虫数逐渐增多。 但对淡色库蚊1 龄幼虫的致病力最高，试验第7d ，l 龄幼虫的死亡率达1 0 0 。 菌株的致病力受蚊幼虫密度的影响，蚊虫密度越大，菌株的致病力越高。淡色库 蚊卵的孵化随孢子悬浮液浓度的增高而降低，低浓度对淡色库蚊卵孵化影响不 大。 ( 3 ) 球孢白僵菌冷冻株与正常株对淡色库蚊的致病力比较：菌株冷冻处理 后，对淡色库蚊幼虫的致病力下降，主要因为冷冻处理后孢子的存活率降低，起 致病作用的物质为菌株自身分泌的毒素。经冷冻处理的菌株在害虫种群中不易形 成病害流行。 ( 4 ) 球孢白僵菌g i m 3 4 2 8 在淡色库蚊种群中的传递作用研究：用1 x1 0 8 山东省医学科学院硕士学位论文 孢子m l 浓度的孢子悬浮液处理淡色库蚊幼虫1 2h 后，将接菌蚊幼虫和未接菌蚊 幼虫以不同比例( 接菌蚊幼虫分别占蚊幼虫总数的o 1 0 0 ) 混合饲养，接菌l o d 后检查不同处理中蚊幼虫的总存活率和球孢白僵菌从接菌蚊幼虫到未接菌蚊幼 虫的传染率。结果表明，随着接菌蚊幼虫比例的增加，蚊幼虫的总存活率呈逐渐 下降的趋势，而传染率则呈逐渐上升的趋势。当接菌的蚊幼虫数量占蚊幼虫总数 的1 0 、2 4 、5 0 、7 2 时，球孢白僵菌在淡色库蚊幼虫之间的传染率分别为： 2 8 8 9 、4 4 7 3 、7 2 、8 5 7 。在接菌的蚊幼虫数量占蚊幼虫总数的9 0 的情 况下，白僵菌在淡色库蚊幼虫之间的传染率达到1 0 0 。 关键词：淡色库蚊；虫生真菌；菌株；致病力 2 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 s t u d yo ne n t o m o p a t h o g e n i cf u n g it oc u l e x p i p i e n sp a l l e n s s p e c i a l i t y ：p a t h o g e n i cb i o l o g y p o s t g r a d a t e ：w e iw e i s u p e r v i s o r ：p r o f m a o q i n gg o n g a b s t r a c t t h ep a p e rm a i n l yf o c u s e do ns t u d yo fe n t o m o p a t h o g e n i cf u n g io fc u l e xp i p i e n s p a l l e n s u s i n ge n t o m o p a t h o g e ni s a l li m p o r t a n tm e t h o da n dh a sb e e na p p l i e dt o c o n t r o lm a n yc r o p si n s e c tp e s t ss u c c e s s f u l l yw o r l d w i d e i nt h i ss t u d y ，as t r a i no f e n t o m o p a t h e n g e n i cf u n g ih a sb e e na c c e p t e df r o mm i c r o b i a lc u l t u r ec o l l e c t i o nc e n t e r ，n 圮v i o l u e n c eo ff i v es t r a i n so fe n t o m o p a t h e n g e n i cf u n g ia g a i n s tc p i p i e n sp a l l e n s w a sc o m p a r e da n dt h em o s te f f e c t i v es t r a i n , b e a u v e r i ab a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n ( g i m 3 4 2 8 ) w a ss e l e c t e d t h e n , t h ep a t h o g e n i c i t yo ft h i ss t r a i nt ocp i p i e n sp a l l e n s l a r v a ea n de g gw a se v a l u a t e d a l s o ，t h ee f f e c t so fl a r v a ed e n s i t yo np a t h o g e n i c i t yo f t h i ss t r a i n , t h et r a n s m i s s i o no fb b a s s i a n aw i t h i np o p u l a t i o no fc p i p i e n sp a l l e n sw a s s t u d i e d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) s t u d yo nf i v ee n t o m o p a t h o g e n i cf u n g io fc u l e xp i p i e n sp a l l e n s a c c o r d i n gt h eg r o w t hr a t e a n ds p o r u l a t i o n , f i v ei s o l a t e do fd i f f e r e n ts p e c i e so f p a e c i l o m y c e sw e r ec h o s e nt oc a r r yo u tt h eb i o a s s a yo ncp i p i e n sp a l l e n s a l lo ff i v e i s o l a t e dh a v es h o w nd i f f e r e n tl e v e lo fp a t h o g e n i c i t yw h i c hi n c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fe o n i d i a ls u s p e n s i o na n dt h et i m ea f t e rt r e a t m e n t t h eh i g h e s t m o r t a l i t yo fcp i p m n sp a l l e n sw a s1 0 0 ( g i m 3 4 2 8 ) a n dt h el o w e s tw a s5 0 ( g i m 3 4 3 6 ) ( 2 ) c o n t r o le f f e c to fb e a u v e r i ab a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i no nc p i p i e n s p a l l e n s bb a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m ih a ss h o w nd i f f e r e n tl e v e lo fp a t h o g e n i c i t yo n 1s ti n s t a r , 2 n di n s t a r , 3 n di n s t a r ，4 n di n s t a r t h eh i g h e s tm o r t a l i t yo f1s ti n s t a rl a r v a e w a s10 0 a f t e rt r e a t e ds e v e nd a y s ，s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nm o r t a l i t yo f2 n di n s t a r , 3 n di n s t a ra n d4 r i di n s t a r h o w e v e r t h em o r t a l i t yo fa l ll a r v a ei n c r e a s e dl i n e a r l y 、 ，i t l l t h ec o n c e n t r a t i o no fc o n i d i a ls u s p e n s i o na n dt h et i m ea f t e rt r e a t m e n t 3 山东省医学科学院硕士学位论文 ( 3 ) p a t h o g e n i c i t y o fn o r m a ls t r a i na n df r e e z e ds t r a i no nl a r v a e p a t h o g e n i c i t yo fn o r m a ls t r a i no i ll a r v a em o r eh i g h e r t h a nf r e e z e ds t r a i n a f t e rf r e e z e d t r e a t m e n t ，s p o r e sw e r ea l m o s td i e da n dp a t h o g e n i c i t yo fs t r a i nw a so p e r a t e do n l yb y e x c r e t e dt o x i n ( 4 ) s t u d yo nt h eh o r i z o n t a lt r a n s m i s s i o no fg i m 3 4 2 8w i t h i nc o l o n i e so fc p i p i e n sp a l l e n s 12h o u r sa f t e rcp i p i e n sp a l l e n sw e r et r e a t e dw i t hlxl0 8c o n i d i a m l o fg i m 3 4 2 8 ，d i f f e r e n tp e r c e n t a g eo ft r e a t e dl a r v aw e r em i x e d 谢t hu n t r e a t e dl a r v a e t ot e s tt h ep o s s i b i l i t yo fh o r i z o n t a lt r a n s m i s s i o no fg i m 3 4 2 8w i t h i nc o l o n i e so fc p i p i e n sp a l l e n s i tw a ss h o w e dt h a tt h es u r v i v a lr a t eo fl a r v ad e c r e a s e dw i t l lt h e i n c r e a s eo ft r e a t e dl a r v a e ，b u tt h et r a n s m i s s i o nr a t eo fg i m 3 4 2 8i n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s eo ft r e a t e dl a r v a e w h e np e r c e n t a g eo ft r e a t e dl a r v a ew a s10 ，2 4 ，5 0 ， 7 2 a n d9 0 ，t h et r a n s m i s s i o nr a t eo fg i m 3 4 2 8w a s2 8 8 9 ，4 4 7 3 ，7 2 ，8 5 7 a n d10 0 ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：c u l e x p i p i e n s p a l l e n se n t o m o p a t h o g e n i cf u n g i s t r a i n p a t h o g e n i c i t y 4 乙型脑炎的主要传播媒介，是我国中北部地区主要的家栖性蚊种，主要孳生于人 居附近污染的积水中，城市里的污水池、臭水沟、化粪池、雨水井积水、下水道 积水、浇花用的肥水缸、建筑工地坑洼积水是淡色库蚊的重要孳生场所。淡色库 蚊除传播多种蚊媒传染病外，还通过叮吸骚扰影响人们的生活。因此，开展卫生 害虫的防治对维护人们的健康具有重要意义。目前对淡色库蚊的防治主要采用化 学方法，化学方法防治害虫，其优点是操作方便，迅速有效，因此在媒介昆虫防 治中占有主导地位，曾为媒介昆虫和虫媒传染病的控制做出过巨大贡献。但由于 化学杀虫剂的长期大量使用，导致害虫抗药性【1 , 2 1 的出现和扩散，严重污染环境， 破坏生态平衡和伤害非靶标生物【3 4 】，造成的“三r 问题，即高残留、抗药性 和再猖獗，已经受到人们的日益重视。调查发现，淡色库蚊对多种杀虫剂表现出 了不同程度的抗药性【5 6 】。因此，开发研制对害虫高效而对非靶标生物和人类安 全、易分解、对环境无害的环保型杀虫剂【7 8 j 势在必行。研究发现，一些真菌可 侵入害虫体内，掠夺营养物质、分泌毒素致害虫死亡。这类真菌对人类和其他非 靶标生物安全 9 - 1 3 】，不污染环境，不易引起抗药性，是理想的害虫防治制剂。真 菌性制剂最近几年发展较快，在微生物杀虫剂中占有重要地位，已广泛应用于农、 林、卫生害虫的防治 1 4 - 1 9 】。 真菌是一类真核生物，产生多种孢子，行有性或无性繁殖。已知真菌约有 1 0 万余种，土壤、水域、空气以及动物、植物和腐败有机物上都有存在，遍布 全球。虫生真菌指寄生在昆虫、蜘蛛等幼虫或成虫虫体上的真菌，它们主要通过 吸收寄主血淋巴中的养分，分解寄主组织或产生有毒代谢产物而杀死寄主【2 0 2 1 1 。 虫生真菌感染机制与其他微生物不同，除可通过消化道侵入虫体以外，还可通过 孢子产生芽管穿透害虫体壁或气孔进行感染，这种机制大大增加了蚊虫等卫生害 虫的感染机会，直接穿透寄主外壳的真菌往往有分泌壳质酶水解昆虫外壳壳质的 能力，真菌制剂在微生物制剂防治中具有明显优势。真菌芽管到达宿主体内后， 摄取宿主血腔内的营养或分泌毒素，导致害虫因营养衰竭或毒血症而死亡【2 2 ，2 3 1 。 感染致死的害虫仍能够作为分生孢子的来源，在自然环境中继续分生孢子，增殖 5 山东省医学科学院硕士学位论文 后的孢子可造成其他害虫感染死亡。此外，真菌孢子抗逆性强，有的在自然环境 中可存活数年，有的在缺乏昆虫寄主时可营腐生生活，有利于建立种群并延续下 去。利用真菌控制害虫，可在害虫种群中造成病害流行，容易达到一次施药长期 控制的目的，其社会生态效益显著。 虫生真菌种类多，代谢类型复杂，以其安全有效，易引起病害流行等优点， 在害虫的生物防治中占有越来越重要的地位 2 4 , 2 5 1 。真菌性杀虫剂充分利用真菌的 以上特点，通过多种作用方式对害虫加以控制，即可以直接利用寄生在害虫虫体 的真菌，也可以利用真菌代谢产生的有机物作用和杀死害虫。已有的研究还发现， 真菌感染可降低蚊虫的嗜血习性【2 6 j ，并能够影响疟原虫在蚊体内的正常发育 2 7 1 。 可见，真菌性杀虫剂在卫生害虫防治中具有良好的前景。 可用于生物防治的的真菌资源有： k i n g d o mp h y l u m c l a s so r d e r f a m i l y g e n u s c h r o m i s t a o o m y c o t a o o m y c e t e s s a p r o l e g n i a l e s s a p r o l e g n i a c e a e 一 l e p t o l e g n i a p h t l l i a l e s p h t h i a c e a e p y t h i u m l a g e n i d i u m m y z o c y t i o p s i d a l e s c r y p t i c o l a c e a e c r y p t i c o l a f u n g i c h y t r i d i o m y c o t a c h y t r i d i o m y c e t e s b l a s t o c l a d i a l e s 6 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 c o e l o m o m y c e t a c e a e c o e l o m o m y c e s z y g o m y e o t a z y g o m y c e t e s e n t o m o p h t h o r a l e s a n c y l i s t a c e a e c o n i d i o b o l u s e n t o m o p h t h o r a c e a e e n t o m o p h t h o r a e r y n i a t r i c h o m y c e t e s h a r p e l l a l e s l e g e r i o m y c e t a c e a e s m i t t i u m d e u t e r o m y c e t e s c u l i c i n o m y c e s b e a u v e r i a m e t a r h i z i u m t o l y p o c l a d i u m ( 引自s c h o l t e ，2 0 0 4 文献【2 8 】) 对蚊虫有作用效果的真菌种类也很多，目前研究发现的灭蚊真菌【2 9 3 2 1 主要 分布于卵菌门o o m y c o t a 、半知菌门d e u t e r o m y e e t e s 、和壶菌门c h y t r i d i o m y e o t a 。 目前用于蚊虫生物防治的虫生真菌主要有：雕蚀菌属c o e l o m o m y c e s 、链壶菌属 3 3 1 l a g e n i d i u m 、棒孢霉属c u l i c i n o m y c e s 、绿僵菌属m e t a r r h i z i u m 、白僵菌属 3 4 】眈口z 鹏砌、t c l y p o c l a d i u m 属、l e p t o l e g n i a 属、f u n i c u l a r i u s 属以及虫霉属 e n t o m o p h t h o r a 和虫疫霉属矽”砌。其中，卡地腐霉p y t h i u mc a r o l i n i a n u m 主要用 于致倦库蚊和白纹伊蚊的防治；雕蚀菌c o e l o m o m y c e s 是分布最广泛的菌种之一， 目前已知寄生于各种蚊幼虫体内的雕蚀菌有7 0 多种，其生活史复杂，完成发育 过程需在中间宿主剑水蚤体内行配子生殖和在蚊体内行孢子生殖的世代交替；大 7 山东省医学科学院硕士学位论文 链壶菌l a g e n i d i u mg i g a n t e u 是一种兼性寄生真菌，既可在水环境中营腐生生长， 又可寄生于蚊幼虫体内，是目前研究最多的菌种之一，也是重要的杀蚊真菌，低 用量的大链壶菌即可引起很高的蚊幼虫死亡率，有望作为生物灭蚊剂推广使用。 白僵菌、绿僵菌均属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目。它们的地理分布广泛， 昆虫寄主范围广，是重要的昆虫病原真菌，在昆虫防治中起着重要作用 3 5 】。绿僵 菌属真菌是常见的昆虫病原真菌，宿主范围广泛，可寄生于多种昆虫的幼虫和成 虫体内。分生孢子为本属真菌的感染阶段。金龟予绿僵菌为该属真菌中研究最多 的杀蚊真菌，主要感染成蚊。白僵菌属真菌也是常见的昆虫病原真菌，寄生于多 科昆虫的幼虫、蛹及成虫。球孢白僵菌为白僵菌属中最重要的蚊虫病原真菌，主 要感染成蚊。目前已广泛用于农、林多种作物害虫的防治中，主要防治小菜蛾、 蚜虫及桑天牛等农林、业害虫。淡紫拟青霉是一种在土壤和感病虫体中广泛存在 的致病真菌，其对害虫的致病性高、杀虫谱广，对多个目的昆虫具有致病性，是 害虫致病真菌研究的热点之一，有望成为新型、高效的虫生真菌资源。白僵菌、 绿僵菌中的部分菌株已经产业化生产，制成不同的真菌杀虫剂剂型，真菌杀虫剂 的生产和应用在害虫生物防治史上是一个革命性的进步。由这类真菌制成的杀虫 剂不仅能快速、有效地控制害虫，又不伤害天敌和有益生物【3 6 - 3 8 1 ，还可以与其他 杀虫因子协同作用，维持物种的多样性，因此，利用虫生真菌防治卫生害虫是i p m 中较有前途的生物措施。由于虫生真菌制剂易于培养，便于储运，使用成本较低， 适于商业化生产【3 9 1 ，而且不污染环境，在自然环境中可不断增殖，长期控制害虫 且不易产生抗药性，因此在害虫控制方面有巨大的潜力3 1 。目前，国内外已对 杀虫真菌的生物学性质以及影响真菌防治效果的因素做了大量研究7 】，为真菌 杀虫剂的研究提供了重要的理论依据。本文选用绿僵菌、白僵菌作为供试菌株的 另一个重要原因是：白僵菌、绿僵菌 4 8 - 5 0 】已经工业化生产，目前在杀虫剂剂型的 研制上已经取得重要进膨5 1 , 5 2 ，其在农林业害虫上应用广泛，研究技术相对成熟。 研究其对淡色库蚊致病性以及影响致病力的因素，可以将高致病力菌株引入卫生 害虫的防治中，并对施药方法和用药环境进行指导，将药效发挥到最佳水平。同 一生境中使用真菌制剂，既可以防治农林害虫，也可以达到控制卫生害虫的目的， 一次施药，多种收益。 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 第一部分菌株生物学特性 l 材料与方法 1 1 菌种来源 试验用菌种有： 球孢白僵菌b e a u v e r i ab a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n 编号：g i m 3 4 2 8 白僵菌b e a u v e r i ab a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n 编号：g i m 3 4 5 金龟子绿僵菌m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ( m e t s c h n i k o f f ) s o m l d n 编号：g i m 3 4 3 6 金龟子绿僵菌小孢变种m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a ev a r a n i s o p l i a e 编号：g i m 3 4 3 1 淡紫色拟青霉p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s 编号：g i m 3 9 5 以上五株菌株均购自广东省微生物研究所菌种保藏中心。 1 2 培养基 p d a 培养基：去皮马铃薯2 0 0g ，切成小块，加水1 l ，煮沸2 0 分钟，双层 纱布过滤，加入葡萄糖2 0g ，琼脂2 0g ，加热使其融化，加水补足至1 0 0 0 m l 。 查氏培养基( c z a p e k - - d o x ) - n a n 0 3 2g ，k 2 h p 0 4 1g ，k c l0 5g ，m g s 0 40 5 g ，f e s 0 4 0 0 1g ，蔗糖3 0 g ，琼脂2 0g ，水1 0 0 0m l 。 选择性培养基【5 3 】：将p d a 培养基1 0 0 0m l 冷却至5 0 。c 时，加入放线菌酮 o 2g ，氯霉素0 2g ，孟加拉红0 0 1 3 3g 。 配置好的培养基经高温高压灭菌( 1 2 1 ，3 0 m i n ) ，倒平板大量培养，斜面 保藏菌种。 1 3 仪器与试剂 高压灭菌锅：t o m ys e i k oc o l t dt o m ys x5 0 0 高压蒸汽灭菌锅：山东安得医疗科技有限公司y x q g 0 2 型手提式电热压 力蒸汽消毒器 电子分析天平：梅特勒一托得多仪器设备( 上海) 有限公司 精密天平：梅特勒一托得多仪器设备( 上海) 有限公司 j b 3 型定时恒温磁力搅拌器：上海雷磁新泾仪器有限公司 光照培养箱m g c 4 0 0 b ：上海一恒科技有限公司 光照培养箱：广东省医疗器械厂l r h 2 5 0 g h g 3 0 3 - 4 k 电热恒温培养箱：南京实验仪器厂 9 山东省医学科学院硕士学位论文 s w - c j 2 f 型双人双面超净工作台：苏州净化设备有限公司 h a i e r 冷藏柜：青岛海尔集团 荧光倒置显微镜：奥林巴斯( 北京) 销售服务有限公司 m o t i cb 1 系列显微镜 血球计数板：上海求精生化试剂仪器有限公司 各种玻璃培养皿、试管、玻璃棒、烧杯、酒精灯、电炉、石棉网、胶头吸管、 移液管、量筒、三角瓶、剪刀、镊子、接种针、接种环、透明胶带、纱布等，均 为国产产品 葡萄糖：天津市凯通化学试剂有限公司( 原四通化工厂) 琼脂：m b c h e m 广州威佳科技有限公司进口分装 蔗糖：广东光华化学厂有限公司 麦芽糖：菏泽中食肽好生物制品厂 k h 2 p 0 4 - 天津市永大化学试剂开发公司 k 2 h p 0 4 - 天津市永大化学试剂开发公司 m g s 0 4 7 h 2 0 ：莱阳经济技术开发区精细化工厂 维生素( v i t a m i n ) b 1 ：s o l a r b i o 琼脂a g a r ：北京东胜泰博科技有限公司 蛋白胨：广东环凯微生物科技公司 酵母浸出汁：冠生园集团上海冠生园添加剂制品有限公司 放线菌酮：s i g a m a 广州威佳科技有限公司进口分装 氯霉素：北京索莱宝科技有限公司 孟加拉红：青岛海博生物技术有限公司 k c h 天津市永大化学试剂开发公司 f e s 0 4 ：天津市永大化学试剂开发公司 n a n 0 3 ：分析纯，成都市联合化工试剂研究所 棉兰：武汉远城科技发展有限公司 1 4 操作条件 无菌操作条件：试验中所有使用的器皿和用具均经高温高压灭菌( 1 2 1 ，3 0 m i n ) ， 菌株的接种、培养、分离等操作均在超净工作台内进行。 1 0 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 培养条件：置于2 5 光照恒温培养箱中培养，待菌落形成后，转移至p d a 斜面， 再转入4 c 冰箱贮存；制备孢子悬浮液可通过p d a 平板大量培养获得。 1 5 菌株形态描述 鉴定方法：用接种针挑取少量孢子点植于平板中央，用封口膜封住平板边缘， 2 6 下倒置培养1 4 天。7 天、1 4 天各测量一次菌落直径大小，并记录相应的菌 落形态特征。就菌落而言，形态特征包括：大小，形态，隆起状态，表面状态( 光 滑、皱褶、粗糙等) ，边缘情况，表面光泽，透明程度，颜色等方面。平板观察 和记载的项目主要是： 菌落质地 菌落形成是凸起的或者有成簇的菌丝体 形成成堆的孢子是干的或粘性的 各种子实体和休眠结构( 厚垣孢子、菌核等) 的形成和所需时间 菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入到培养基中 有无特殊气味 菌落中有没有部分呈扇状 生长速率的快慢，如菌落生长到一定直径所需的时间 标本的制作：选取质地细腻的透明胶带，剪取适当大小的小块，用镊子夹住， 从菌落的边缘向中央轻轻粘贴，9 5 酒精固定，棉兰染色，将透明胶带粘有产孢 结构的一面朝上放，轻轻放下盖玻片，避免产生气泡。在低倍镜下观察找到视野， 然后滴加香柏油，在油镜下观察产孢结构特征。 显微摄影【蚓：观察并选取具有典型性状特征的视野拍照，并测量相关数据并 记载其特征。 2 结果与分析 2 1g i m 3 4 2 8 在p d a 培养基上，2 5 ，菌落白色、粉状、1 0d 直径3 2 2 8m m ，菌落薄而 平，表面有放射状沟纹，孢子层略突起，背面中央浅棕色。分生孢子为椭圆形、 无色、光滑、孢子大多为2 2 5 x 5 6 岬；菌丝粗1 5 2 岬；产孢细胞( 瓶梗) 浓 密簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的泡囊( 柄细胞) 上，球形至瓶形，颈部明显 延长成粗l 岬，长达2 0 的产孢轴，轴上具小齿突，成“之”字形弯曲。产孢细胞 山东省医学科学院硕士学位论文 和泡囊常增生，在分生孢子梗或菌丝上大多具成球形的密实孢子头，在低倍镜下 即可看到。见附录图1 1 2 2g i m 3 4 5 在p d a 培养基上，2 5 ，菌落白色、絮状到粉状，直径1 6 3 8m i l l ，表面有 同心环纹，中间有无色分泌物；背面无色素，中间有浅褐色圆点；分生孢子球形、 无色、光滑、孢子直径大多2 5 3l a m ：菌丝粗1 2g m ；产孢细胞( 瓶梗) 浓密簇 生于菌丝、分生孢子梗或膨大的泡囊( 柄细胞) 上，球形至瓶形，颈部明显延长 成粗1l a i n ，长达2 0 的产孢轴，轴上具小齿突，成“之”字形弯曲。产孢细胞和 泡囊常增生，在分生孢子梗或菌丝上大多具成球形的密实孢子头，在低倍镜下即 可看到。见附录图1 2 2 3g i m 3 4 3 6 在p d a 平板上培养时，菌落绒毛状边缘白色，中央产生暗绿色分生孢子层， 背面淡黄色。菌丝有隔，无色光滑，分分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2 5 个柱形的瓶梗，其上产生向基式的分生孢子链；单个分生孢子无色，柱形两端钝 圆。 在查氏培养基上，2 5 ，7 天，茵落绒毛状或粉状，起初白色，产孢时军绿 色，边缘为白色丝状，直径1 5 2 81 1 1 1 1 1 ，剖面中央有点状突起，背面为深褐色或 黄色，有褶皱；分生孢子直径1 5 - 2l a i n ，菌丝粗2l a i n 。菌丝有分支或分隔，透 明，分生孢子梗很难与菌丝区别，从瓶梗末端连续产生成串的分生孢子，形成长 链，排列整齐，孢子长椭圆形或圆柱形，两端钝圆。见附录图1 3 2 4g i m 3 4 3 l 在p d a 琼脂培养基或查氏培养基上得菌落绒毛状至棉絮状，最初白色，产 孢子时橄榄绿色。在老的培养基上分生孢子链常粘聚成壳状铺在菌落表面。分生 孢子单个是亮色，成堆是橄榄绿色，脱落的孢子常聚成菱形孢子团块或壳状结构； 在麦芽汁琼脂培养基上，2 5 ( 2 ，5 天长得比在查氏上快，产孢出现橄榄绿色要早， 其他形态相似。见附录图1 4 2 5g i m 3 9 5 淡紫拟青霉p a e c i l o m y c e sl i l a c i n u s ，属半知菌亚门，丝孢目h y p h o m y c e t a l e s ， 丝孢科h y p h o m y c e t a c e a e 。在p d a 培养基上，菌落初期为白色，后渐变为淡紫 1 2 病原真菌对淡色库蚊致病力的研究 色，绒毛状，菌丝淡色；分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，有几级轮状分枝，瓶 梗基部柱状膨大，向上变成一细长颈部，2 - 6 个轮生于分生孢子梗上；分生孢子 单孢，卵形，1 5 - 2 5 x l 1 5p a n ，形成分生孢子链。在扫描电镜下观察茵丝、产孢 结构及孢子的形态。 在查氏培养基上，2 5 c ，1 4 天，菌落直径4 8m m ，菌落直径达5 4m m ，菌 丝宽1 3 5p a n ，分隔、透明、光滑。见附录图1 5 山东省医学科学院硕士学位论文 第二部分五种致病真菌对淡色库蚊幼虫的致病性研究 昆虫病原真菌是指那些在寄主正常生理条件下能直接侵入体内、增殖和迅速 引起死亡的类群。它们以吸收血淋巴中的养分、分解寄主组织或产生有毒代谢物 质而杀死昆虫，是自然界控制害虫群体的主要因素。有真菌致死的昆虫约占全部 病原微生物致病死亡的6 0 ，昆虫病原真菌种类繁多，对虫口密度起着重要的调 节作用。多年的研究和生产应用实践表明，昆虫病原真菌具有很多优点：l 、多 数种类专化性不强，寄主范围较广，能防治多种害虫；2 、不需要非得从消化道 侵入虫体，体壁、气孔均可入侵，增加了感染害虫的机会；3 、真菌孢子具有较 强的抗逆性，有的可在环境中存活几年，有的在缺乏寄主时可营腐生生活，有利 于种群的建立和延续；4 、很多种类容易人工培养，可进行大量生产乃至工厂化 生产；5 、大多数真菌对人及天敌无害，商品化生产和注册的种类均已通过了安 全性检验，不污染环境；6 、在自然环境中可不断增殖，能长期控制虫害且不易 使其产生抗性。此外，昆虫病原真菌还是昆虫病原物中唯一的能通过表皮感染昆 虫的微生物，在害虫生物防治中占有特殊地位。基于上述优点，昆虫病原菌具有 广阔的开发利用前景。 试验用五株菌株：球孢白僵菌b b a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n 、金龟子绿僵 菌小孢变种m a n i s o p l i a ev a r a n i s o p l i a e 、金龟子绿僵菌m a n i s o p l i a e ( m e t s c h n i k o f f ) s o r o k i n 、白僵菌b b a s s i a n a ( b a l s a m o ) v u i l l e m i n 、淡紫色拟青霉p a e c i l o m y c e s l i l a c i n u s 可寄生多种昆虫，在生产中已得到广泛的应用。此类病原菌致病力强、 效果好，对人、畜和农作物无毒副作用，是当前世界上研究应用最多的虫生真菌 资源。据不完全统计，仅绿僵菌感染寄生的昆虫约2 0 0 多种。世界各国对病原 真菌的研究历史久远，但直到最近几年才形成规模化生产，自1 9 8 8 年，用于澳 洲甘蔗和牧草害虫防治真菌制剂的出现，标志着应用病原真菌防治害虫的突破性 发展。目前世界各国研制出了不同的真菌剂型，主要用于防治草原蝗虫和地下害 虫以及林业害虫中的鳞翅目幼虫。利用真菌防治卫生害虫的研究，国内外研究的 相对较少，如果这种高效、安全的真菌性制剂能够对卫生害虫产生良好的防治效 果，则可利用卫生害虫的生活史特点，与其他防治方法相结合