（微生物学专业论文）代谢木糖和葡萄糖产乙醇的重组酿酒酵母的构建.pdf

首都师范入学硕士学位论文 摘要 木质纤维素是地球上最充分的有机资源。将木质纤维素中的纤维素和半纤维素水解成 葡萄糖和木糖并发酵产生乙醇正在被广泛地研究。木糖发酵是植物纤维原料生物转化制取 乙醇商业化生产的基础和关键，但自然界存在的微生物菌株不能满足商业化生产的需要。 利用基因工程技术对酵母菌进行改造，以提高它们的木糖发酵能力成为目前研究和开发的 重点。 实验室前期已构建了带c a n d i d as h e h a t a e 木糖还原酶基因x y l l 的重组表达质粒 p a c t 2 - x y l l ，运用醋酸锂转化法，将该质粒导入实验室营养缺陷型菌株y s 5 8 中得到重组 茵y s 5 8 x l 。选菌落较大的两株重组菌y s 5 8 x l a 和y s 5 8 x l b 测定木糖还原酶的活性，结 果比活力分别为0 2 6 u m g 总蛋白和0 3 2 u m g 总蛋白，是宿主菌木糖还原酶比活力的1 6 2 5 倍和2 0 0 倍，说明cs h e h a t a e 的木糖还原酶基因x y l l 在c e r e v i s i a ey s 5 8 中得到活性 表达。选取y s 5 8 x l b 进行木糖醇发酵实验，结果显示重组菌y s 5 8 一x 1 经9 2 h 发酵后，消 耗木糖6 6 8 8 9 l ，比宿主菌y s 5 8 提高了3 8 7 倍：木糖醇产量为6 2 2g l ，比y s 5 8 增加了 1 0 5 倍。研究结果表明，菌株y s 5 8 一x l 可以在葡萄糖为辅助碳源时，转化木糖为木糖醇。这 一特点对生物质纤维材料的全利用极为有利，因为纤维材料的水解物中总是葡萄糖( 己糖) 与木糖( 戊糖) 相伴存在的。 从工业酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) t m b 3 0 0 0 中扩增得到木糖醇脱氢酶基因 x y l 2 ；将x y l 2 与带强启动子p m a l 的表达载体p d r l 9 5 连接得到p d r l 9 5 - x y l 2 。将重组表达 质粒p d r l 9 5 x y l 2 导入y s 5 8 中，得到重组菌y s 5 8 x 2 。选两株重组菌y s 5 8 x 2 a 和y s 5 8 x 2 b 进行木糖醇脱氢酶活性测定，比活力分别为：0 0 6 5 6 u m g 总蛋白和0 0 7 u m g 总蛋白，分 别为宿主菌的1 6 4 倍和1 7 5 倍。说明s c e r e v i s i a et m b 3 0 0 0 的x y l 2 基因超表达成功。 将p a c t 2 - x y h 导入y s 5 8 x 2 b 中，用同时缺亮氨酸( 1 e u ) 和尿嘧啶( u r a ) 的平板 筛选得到重组菌y s 5 8 一x l x 2 。带有不相容性质粒p a c t 2 - x y 和p d r l 9 5 - x y l 2 的共转化子 转接培养8 d 后，后代菌8 5 以上仍能在缺l e u 和u r a 的平板上生长，即同时含有两种重 组质粒。说明在有合适选择压力的情况下，可以保证两种不兼容质粒在共转化子中稳定传 代。重组菌子中的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活力与分别表达时的活力相当。重组菌 y s 5 8 - x 1 - x 2 葡萄糖与木糖共底物发酵结果显示，重组菌sc e r e v i s i a e y s 5 8 - x l - x 2 对木糖 的利用和乙醇的产率较宿主菌& c e r e v i s i a ey s 5 8 都有提高。y s 5 8 一x 卜x 2 对木糖的利用最 首都师范人学硕l ：学位论文 高可达7 9 8 3 9 几，较宿主菌提高了4 8 倍，乙醇产量最高可达1 4 4 8 6g l ，较宿主菌提 高2 3 5 。说明木糖代谢相关基因在宿主体内得到成功表达，y s 5 8 - x l x 2 已经能利用木糖 产酒精；同时还说明两种不相容性质粒不仅能在曼c e r e v i s i a e 中共存，而且还可以实现 不同蛋白质的在& c e r e v i s i a e 中的共表达。 本实验构建的重组酿酒酵母为后续重组菌的改良奠定了一定的基础。 关键词：酿酒酵母木糖发酵乙醇 首都师范大学硕：i ：学位论文 a b s t r a c t l i g n o c e l l u l o s ei s t h em o s ta b u n d a n tr e n e w a b l eo r g a n i cr e s o u r c eo nt h ee a r t h x y l o s e f e r m e n t a t i o ni st h ef o u n d a t i o na n dt h ek e ys t e pf o rt h es u c c e s s f u lb i o l o g i c a lc o n v e r s i o no f l i g n o c e l l u l o s i cb i o m a s st oe t h a n o l ，b u tt h e r ei sn on a t u r a lm i c r o o r g a n i s m ss t r a i ns u i t a b l eo ft h e b u s i n e s sp r o d u c t i o n i tw a sc r i t i c a lt oe n h a n c et h ec a p a b i l i t yo fy e a s t sx y l o s e f e r m e n t a t i o nb y g e n ee n g i n e e r i n g t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp a c t 2 - x y l lw i t ht h ex y l o s er e d u c t a s eg e n ex y l lf r o m c a n d i d as h e h a t a eh a sb e e ne s t a b l i s h e di no u rl a b o r a t o r y t h ev e c t o rp a c t 2 - x y l lw a st h e n t r a n s f o r m e di n t os a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ey s 58b yl i a ct op r o d u c et h er e c o m b i n a n ty e a s t y s 5 8 - x l ，a n dp o s i t i v et r a n s f o r m a n t sw e r ei s o l a t e do ns e l e c t i v ep l a t ew i t h o u tl e u t h es p e c i f i c x y l o s er e d u c t a s ea c t i v i t yo ft w ot r a n s f o r m a n t ss c e r e v i s i a ey s 5 8 一x l aa n dy s 5 8 一x l bw e r e 0 2 6 u r a ga n do 3 2 u m g t o t a lp r o t e i nr e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r e16 2 5 - f o l da n d2 0 0 一f o l dh i g h e r t h a nt h a to fg e n ed o n o ry s 5 8 t h i sr e s u ki n d i c a t e dt h a tt h ex y l lg e n ef r o mcs h e h a t a eh a sb e e n a c t i v e l ye x p r e s s e di nl a b o r a t o r ys c e r e v i s i a e y s 5 8 s c e r e v i s i a ey s 5 8 一x l bw a su s e dt o c o f e r m e n t e dg l u c o s ea n dx y l o s et op r o d u c ex y l i t 0 1 y s 5 8 一x lc o n s u m e d6 6 8 8 9 lx y l o s ew h i c h w a s3 8 7 一f o l dm o r et h a nt h a to ft h ep a r e n ts t r a i ny s 5 8 ，a n dp r o d u c e d6 2 2e g l x y l i t o lw h i c hw a s 1 0 5 一f o l dm o r et h a nt h a to f y s 5 8 t h er e s u l ti n d i c a t e st h a ty s 5 8 - x lc a l lf e n m e n tx y l o s et ox y l i t o l w i t hg l u c o s ea st h ea s s i s t a n tc a r b o ns o u r c ee f f e c t i v e l y t h ex y 2g e n ef r o ms c e r e v i s i a et m b 3 0 0 0e n c o d i n gt h ex y l i t o ld e h y d r o g e n a s ew a s a m p l i f i e db yp c r , a n d i n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp d r l 9 5 , r e s u l t i n gi nt h er e c o m b i n a n t v e c t o rp d r l 9 5 - x y l 2 t h e nt h ep l a s m i dp d r l 9 5 - x y l 2w a st r a n s f o r m e di n t os c e r e v i s i a ey s 5 8 t oy i e l dt h er e c o m b i n a n ty e a s ty s 5 8 - x 2 ，a n dp o s i t i v et r a n s f o r m a n t sw e r ei s o l a t e do ns e l e c t i v e p l a t el a c k i n go fu r a t h es p e c i f i cx y l i t o ld e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y o ft w ot r a n s f o r r n a n t s s c e r e v i s i a ey s 5 8 x 2 aa n dy s 5 8 - x 2 bw e r e0 0 6 5 6 u r a ga n d 0 0 7 u m g t o t a l p r o t e i n r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r e16 4 - f o l da n d17 5 - f o l dh i g h e rt h a nt h a to fg e n ed o n o ry s 5 8 t h i sr e s u l t i n d i c a t et h a tt h ex y 2g e n ef r o ms c e r e v i s i a et m b 3 0 0 0h a sb e e no v e r e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi n 首都师范人学领土学位论文 l a b o r a t o r ys c e r e v i s i a ey $ 5 8 u n d e rs c r e e n i n gp r e s s u r eb yl a c k i n gl e ua n du r ai nt h ep l a t es i m u l t a n e o u s l y , r e c o m b i n a n t v e c t o r sp a c t 2 - x y l la n dp d r l9 5 - x y l 2w e r eb o t ht r a n s f o r m e dt os c e r e v i s i a ey s 5 8t op r o d u c e r e c o m b i n a n t sy s 5 8 一x l x 2 t h es t a b i l i t yo f t w oi n c o m p a t i b l ep l a s m i d se x s i s t i n gi nt h es a m eh o s t s t r a i nw a sa l s os t u d i e d ，i tw a sf o u n dt h a t8 5 u n b o mr e c o m b i n a n t sw e r es t i l la l i v ei nt h ep l a t e w i t h o u tl e ua n du r aa f t e r8 d a y s ，w h i c hm e a n tt h a tt h er e c o m b i n a n t sw i t ht w oi n c o m p a t i b l e p l a s m i d sw e r er e a l l ys t e a d yw i t h t h es e l e c t i n gp r e s s u r e t h ex ra n dx d h a c t i v i t yi ny s 5 8 - x l x 2 w e r ee q u a lt ot h a to ft h e i re x p r e s s i n gr e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r e ，y s 5 8 x l x 2c o u l dc o n s u m e 7 9 8 3 9 lx y l o s e w h i c hw a s4 8 一f o l dh i g h e rt h a nt h a to f y s 5 8 ，a n de t h a n o lp r o d u c t i o nw a su p t o14 4 8 6g lw h i c hi n c r e a s e db y2 3 5 t h a nt h a to ft h eh o s t t h i si m p l i e dt h a tt w o i n c o m p a t i b l ep l a s m i d sc o u l de x s i s ti nt h es a m es c e r e v i s i a ew i t hs c r e e n i n gs t r e s s ，a n dc o u l d e v e ne x p r e s st w od i f f e r e n tk i n d so fp r o t e i n s t h er e c o m b i n a n ty e a s tc r e a t e di nt h i se x p e r i m e n t c o u l db et h ef o u n d a t i o no ft h ef u r t h e ri m p r o v e m e n to fr e c o m b i n a n t & c e r e v i s i a e k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，x y l o s e ，f e r m e n t ，e t h a n o l i v 首都师范大学硕：l j 学位论文 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈芟的学位论文，是本人在导帅的指导卜，独立进仃研冗2 1 2 作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果f h 本人承担。 学位论文作者签名：拼函坞 日舢庐弘渝 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名：三臣碧菇亏 日期：瑚赂j 月 首都师范人学硕： j 学位论文 1 能源现状 第一章绪论 1 1 世界及中国能源消费现状和趋势 根据美国能源部能源情报署国际能源展望2 0 0 4 ) 基准状态预测，全球能源消费总量将 从2 0 0 1 年的1 0 2 4 亿吨油当量增加到2 0 2 5 年1 6 2 亿吨油当量，世界能源消费在2 0 0 1 - 2 0 2 5 年将增加5 4 。日本、欧盟等能源机构预计，全球能源消费峰值将出现在2 0 2 0 2 0 3 0 年。 全球化石能源的枯竭是不可避免的，将在本世纪内基本开采殆尽。 b p 世界能源统计 2 0 0 6 ) 的数据表明，全球石油探明储量可供生产4 0 多年，天然气和煤炭则分别可以供应 6 5 年和1 5 5 年。国际能源署2 0 0 5 年分析认为，到2 0 3 0 年世界能源需求将增长6 0 ，届时 仍将有“足够 的资源可满足需求。同时指出，c 0 。排放也将增多，减排温室气体是一个严 峻的挑战。替代能源尤其是可再生能源，不仅将成为不可或缺的重要能源，而且将成为降 低温室气体排放的重要举措。 作为全球能源市场日趋重要的一个组成部分，目前中国的能源消费已占世界能源消费总 量的1 3 6 ，世界能源消费将越来越向中国和亚太地区聚集。据预测，目前中国主要能源 煤炭、石油和天然气的储采比分别为约8 0 、1 5 和近5 0 ，大致为全球平均水平的5 0 、4 0 和7 0 左右，均早于全球化石能源枯竭速度。未来5 - 1 0 年，中国煤炭国内生产量基本能够 满足国内消费量，原油和天然气的生产则不能满足需求，特别是原油的缺口最大。注重能 源资源的节约，提高能源利用效率，加快可再生能源的开发利用，对于中国来说既重要又 迫切。 1 2 世界可再生能源发展趋势 世界大部分国家能源供应不足，各国努力寻求稳定充足的能源供应，都对发展能源的 战略决策给予极大的重视，其中可再生能源的开发与利用尤为引人注目。化石能源的利用 会产生温室效应，污染环境等，这一系列问题都使可再生能源在全球范围内升温。从目前 世界各国既定能源战略来看，大规模的开发利用可再生能源，已成为未来各国能源战略的 i 首都师范人学硕1 ：学位论文 重要组成部分。 自上个世纪9 0 年代以来可再生能源发展很快，世界上许多国家都把可再生能源作为 能源政策的基础。从世界可再生能源的利用与发展趋势看，风能、太阳能和生物质能发展 最快，产业前景最好，其开发利用增长率远高于常规能源。国际能源署的研究资料表明， 在大力鼓励可再生能源进入能源市场的条件下，到2 0 2 0 年新的可再生能源( 不包括传统生 物质能和大水电) 将占全球能源消费的2 0 ，可再生能源在能源消费中总的比例将达3 0 ， 无论从能源安全还是环境要求来看，可再生能源将成为新能源的战略选择。 2 利用木质纤维素发酵生产乙醇的研究背景及意义 近年来国际油价屡创新高，各国对替代能源开发更加重视，乙醇燃料被视为最有可能 替代汽油的可再生能源之一，被纳入许多国家的发展战略规划。 乙醇作为一种生物能源，有望部分替代日益减少的化石燃料( 石油) ，以减缓石油的消耗， 而且乙醇燃烧污染少，具有显著的环境友好性。更为重要的是，乙醇生产工艺大都使用农 业原料，这一过程有利于推动太阳光能的转化利用，同时促进大气中二氧化碳的去除与循 环。 国际环境保护组织已向全球发出呼吁，从长远环境保护利益出发，建议全球采用“乙 醇一汽油 或乙醇作为未来的汽车燃料。世界上很多国家都通过立法积极推广燃料酒精的 应用，其中美国和巴西在发展燃料酒精工业方面走在了世界的前列。巴西的“酒精汽油计 划”和美国的“汽油醇计划”，对8 0 年代中期持续到9 0 年代末世界酒精产量的迅速增长 起到了决定性的推动作用。美国和巴西的酒精产量加起来占世界总产量的6 3 7 。 世界上大部分的乙醇都是以淀粉或蔗糖为原料生产的。目前在巴西、美国、加拿大等 国家主要用糖类和淀粉以生物技术法生产乙醇。到2 0 0 0 年巴西的燃料乙醇总产量达7 9 3 万吨，约占该国汽油消耗量的1 3 ，美国的燃料乙醇销售量达5 5 9 万吨，年均增长率为2 0 9 6 。 美国主要以玉米为原料生产燃料乙醇，所耗玉米占全美玉米总产量的7 8 ( g o n g e t a l 1 9 9 9 ) 。中国作为人口大国，粮食原料的供应将受到很大限制而且成本过高。 2 0 0 0 年我国粮食产量达o 9 2 万亿斤，而人口却高达1 3 亿，人均粮食占有量还不到8 0 0 斤， 低于1 9 8 4 年8 5 0 斤的水平，每年缺少粮食约2 0 0 0 亿斤 世界粮食市场很难填平这一缺口， 因此，未来的中国粮食生产形式将十分严峻。同时，在我国年产的1 5 0 - 一2 0 0 万吨酒精中( 不 包括饮料酒) ，7 0 是以大米、玉米、薯干等粮食为原料进行生产的。近年来，随着改革开 2 首都师范人学硕：j 学位论文 放的不断深入，粮食价格不断放开，使得大多数以粮食为原料的酒精生产企业难以为继， 经济效益下降甚至出现负效益。因此，随着世界人口增加，耕地减少，用粮食换燃料的方 法在国际上也不可能广泛和持久地采用。而我国纤维素类可再生资源丰富，农作物的秸杆 6 亿多吨。除部分用于造纸、建筑、纺织等行业外，大部分未能被有效利用，有些还造成 环境污染。若能采用适宜的技术将这些废物加以转化利用，不仅能够节粮、代粮，缓解能 源紧缺，还可以处理废物、消除公害、保护环境，对我国经济的可持续发展将产生深远的 影响。 因此开发廉价的燃料酒精生产原材料是此能源领域研究的主要方向之一。木质纤维素 作为光合作用的产物是地球上最丰富的可再生资源，充分将其中可利用的成分转化为燃料 酒精，不仅能为人类提供数量可观的新型能源，而且可以在很大程度上减轻对生态环境造 成污染。在国际能源组织( i n t e r n a t i o n a le n e r g ya g e n c y ) 和各国政府的帮助下，1 4 个国 家和欧洲共同体的科学家们联合签定了生物能协议( b i o e n e r g ya g r e e m e n t ) ，共同致力于 利用植物纤维资源制取燃料酒精的研究和开发工作。近二十年来在原料预处理、菌种筛选 与选育、纤维素酶制备和酶水解技术、酒精发酵技术上取得了令人瞩目的进展。 纤维素乙醇在具有清洁、可再生等诸多优点的同时，与利用玉米等农作物提取乙醇的 传统方法相比，它来源于农作物秸秆，而不是农业食品。一旦实现产业化，不仅可以解决 与人争粮的问题，更可以变废为宝。在燃烧时产生的能量要大大高于生产所耗费的能量。 纤维乙醇燃料燃烧时排放的温室气体不仅比汽油减少9 0 ，而且远低于谷物类乙醇燃料。 实验结果表明，所有汽车不用作任何改装，即可使用添加1 0 乙醇燃料的汽油 张宇 昊，2 0 0 4 。 3 木质纤维素 3 1 木质纤维素类物质的分布和组成 木质纤维素类物质主要由纤维素，半纤维素、木质素组成。不同来源的木质纤维素物 含有这三种物质的比例不尽相同( 表1 ) 3 首都师范人学顾i j 学位论文 表1 木质纤维素的组成 3 1 1 纤维素 纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，是p d - 葡萄糖的无支链聚合物 s j s t r l i me ，1 9 9 3 1 ， 根据纤维素的来源和测定方法不同，纤维素的聚合度( d p ) 在2 0 0 0 2 7 0 0 0 葡聚糖单元 【m o r o h o s h in ，1 9 9 1 之间。其最基本的结构单元是纤维二糖 k a t z e nr , 1 9 9 5 。葡萄糖单元彼此以 b 一1 , 4 糖苷键相连。同时，葡萄糖单元之间还彼此以两个氢键相连构成链，每条链上的 葡萄糖单元还以一个氢键和另一条链上的葡萄糖单元相连，构成网络层状结构。层和层之 间再以范德华力堆积起来；这样形成了非常稳定的晶体结构，使得其对水解的抵抗能力很 强。 3 1 2 半纤维素 半纤维素是一种异源多聚糖，生物合成途径与纤维素不同。其单体组分包括葡萄糖、甘 露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯搪，和少量的鼠李搪、葡萄糖醛酸、甲基葡萄糖醛酸和半乳 糖醛酸 s j s t r l i me ，1 9 9 3 1 。大多数半纤维素的聚合度为2 0 0 左右。与纤维素不同，半纤维素的 水解相对容易些，不同来源的木质纤维素类物质的各种组份不尽相同( 表1 4 ) ，所以其水解 液中糖分组成和形成的抑制物也各不相同。但总的来说，木糖是半纤维素组成中含量最多 的糖分。 表2 不同木质纤维素类物质的组成 l e e j ，1 9 9 7 j 3 1 3 木质素 木质素是由苯基丙烷以三维结构方式连接而成的高度复合物，其化学结构藉性的许多 方面还不清楚。从生物合成上说，木质素是由葡萄糖生成的三种前体醇类构成的 4 首都帅范人学顾。l ：学位论文 a r g y r o p o u l o s ds , m ，1 9 9 7 ，l e e j ，1 9 9 7 j ，木质素通过酯键、醚键和糖苷键与纤维素和半纤维 素相连。木质素对化学和酶降解的抗性非常强，不能被微生物发酵转化生成乙醇，但是可 以被白腐菌等真菌降解。 3 2 木质纤维素类物质水解方法 木质纤维素有几种可能的水解方法，最常用的方法可分为化学水解和酶法水解两种。另 外，还有一些不加任何化学试剂和酶的方法，如y 一射线水解方法、电子束照射水解方法 【k a e t s ui , 1 9 8 7 ，h a n yw , 1 9 8 0 、微波照射水解方法 m a g a r ak , 1 9 8 9 。但是这些方法都没有应 用价值。 3 2 1 酶法水解 酶法水解是通过纤维素水解酶类完成的。根据酶的作用方式不同，通常采用混合酶来 水解纤维素。通常的酶混合液包括葡聚糖内切酶、葡聚搪外切酶、p 一葡萄糖苷酶和纤维 二糖水解酶 i n g r a i nl o ，1 9 9 5 葡聚糖内切酶对纤维素链进行随机水解生成短链的多糖，葡 聚糖外切酶附着于短链多搪的非还原性一端切下纤维二搪，p 一葡萄糖苷酶将纤维二糖和其 它的寡糖水解成葡萄糖【p h i l l i p i d i sg p ，1 9 9 5 。 木质纤维素的许多结构特点使得其j 酶作用的抗性很高 d a l eb e ，1 9 8 7 ，要提高其水 解效率就必须使木质纤维素易于受酶的攻击 p h i l l i p i d i sg p ，1 9 9 5 。因此在酶法水解之前 对其进行化学方法的预处理是非常必要的。预处理和酶水解占木质纤维素生物转化生产乙 醇总成本的一大部分 n g u y e nq a ，1 9 9 1 。尽管有些方法可以尽量减少成本 g r e g g d j ，1 9 9 6 ，但现在费用还是比相应的化学水解法高。 3 2 2 化学水解和预处理 如前面提到的，酶法水解和化学法水解都需要预处理来增加纤维物质的感受性。在化 学水解法中，预处理和水解可以一步进行。有许多预处理方法可供尝试，这些方法在破坏 木质纤维素结构中不同结构单元时有不同的效果 f a nl t ，1 9 8 2 】 3 2 2 1 浓酸水解 用浓硫酸和浓盐酸水解木质纤维素是一个古老的工艺。浓酸水解一般比稀酸水解得到 的糖浓度和乙醇浓度高但浓酸的腐蚀性非常高对设备要求较高。高投资和高维持消耗及高 5 首都师范人学颐，l ：学位论义 环境污染 k a t z e n r m ，19 9 5 极大的降低了其应用潜力。 3 2 2 2 稀酸水解 无论是酶法水解预处理，还是直接将木质纤维素转化生成糖，稀酸水解都是较受欢迎 的力式 q u r e s h in ，1 9 9 5 1 。最早出现的稀酸水解工艺是s c h o l l e r 工艺 f a i t hw l ，1 9 4 5 ，使用 这种工艺能从1 9 干木材产生0 1 7 9 乙醇。一阶段稀酸水解尽管可以将半纤维素中的甘露聚 糖和本聚糖大部分水解完全，但是当水解温度低于2 0 0 得到的葡萄糖还不到1 5 ，因此 可以考虑用两阶段水解法。 两阶段稀酸水解是种改进工艺。第一阶段先在较温和地条件下将半纤维转化生成糖 单体。然后将固体残渣从液体中分离出来，再在较剧烈的条件下将葡萄糖从纤维素中水解 出来 h a r i s jf , 1 9 8 4 1 。其它强酸如盐酸和氢氛酸也被用于稀酸水解工艺f k a t z e n r m ，1 9 9 5 1 。 但由于价格和环境方面的因素，商业应用价值较小。 3 2 2 3 酶法水解的预处理方法 稀酸水解是木质纤维素类物质酶法水解前处理的常用方法。与单纯的稀酸水解相比条 件温和些，通常是1 2 0 1 7 0 之间一步完成，或者在温度低于1 2 0 。c 时分两阶段完成 f l e e j ，1 9 8 7 j 。 其他的预处理方法包括自动水解工艺 w a l c h e z , 1 9 9 2 】蒸汽热爆法f g r e g gd j ，1 9 9 5 ， g r e g g dj ，1 9 9 6 、s 0 2 水解lw a y m a n m ，1 9 8 8 ；w e i l j ，1 9 9 4 、臭氧预处理 t o r t o s aj f , 1 9 9 4 ； t i p p e h ，1 9 9 8 1 、氨循环浸透工艺( a r p ) w e i l j ，1 9 9 4 1 、氨冷冻爆解( a f f x ) h o l t z a p p l em t ， 1 9 9 1 ) 和湿氧化法 s c h m i d t as ，1 9 9 8 1 等。 3 3 水解副产物的生成 除了糖类外，在水解过程中还形成或释放一些副产物。最主要的副产品是呋喃、羧酸 和酚类化合物 c l a r k ta ，1 9 8 4 ；p a l m q v i s t e ，1 9 9 8 1 。糠醛和5 - n 甲基糠醛( h m f ) 是最主要 的呋喃类物质，它们分别是五碳糖和六碳糖降解产生的 m e l a m e dt s e ，1 9 8 3 。水解过程中 形成的羧酸包括乙酰丙酸，甲酸和乙酸等。硬木与软木水解液中一个主要的不同点是硬木 水解液的乙酸浓度比软木水解液中高很多。在水解过程中会由木质素降解形成多种芳香和 多芳香化合物c l a r k t a ，1 9 8 4 ；l a r s s o n s ，1 9 9 9 1 ，如苯酚、香草醛、香草酸、香草醇、4 一羟基苯甲酸、香豆酸、丁香醛、丁香酸、肉桂酸、对苯二酚、儿茶酚、黎芦醚等。 6 首都师范人学顾 ：学位论文 4 利用木糖微生物 4 1 微生物发酵木糖生产酒精的代谢机理 木糖的异构化是微生物木糖代谢的最初的生化反应。在大多数细菌( 如e c o l i 和b a c i l l u s 等) 中，木糖首先在木糖异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ) 作用下，转化为木酮糖。该酶不需要辅 酶的参与，然后以5 磷酸木酮糖的形式进入p p p 途径，与p p p 途径偶联的是e d 途径，通 过e d 途径产生乙醇 w a l f r i d s s o n , 1 9 9 6 。细菌的木糖代谢途径总结于图l 。 戊符代谢途径 z 蚋p 途径 图1 细菌中的木糖代谢途径 在酵母菌中，需经过两步氧化还原反应将木糖转化为木酮糖。首先在依赖于n a d ( p ) h 的木糖还原酶( x y l o s er e d u c t a s e ，x r ，e cl 。1 1 2 1 ) 的作用下将木糖转化为木糖醇；然后 依赖于n a d + 的木糖醇脱氢( x y l i t o ld e h y d r o g e n a s e ，x d h ，e c1 1 1 9 ) 的作用将木糖醇转 t 化为木酮糖。木酮糖经木酮糖激酶( x y l u l o k i n a s e ，e c2 7 1 1 7 ) 作用磷酸化后进入磷酸戊 糖循环( t h ep e n t o s ep h o s p h a t ep a t h w a y ，p p p 途径) ，经过一系列的生物化学反应生成乙醇 【4 】。整个代谢过程见图l 。大量研究表明，利用木糖的酵母菌发酵木糖产生乙醇时需要氧 7 首都师范人学硕上学位论文 气，在厌氧环境中没有检测到乙醇( w a t s o ne ta l1 9 8 4 ；l i g t h e l m e t a l 1 9 8 8 ；s k o o ge t a l 1 9 8 8 ， 1 9 9 0 ) 。 图2 冥函中的木糖代谢途径 酵母的戊糖发酵是在兼性厌氧条件下进行，其总反应式为 a n i ll a c h k e ，2 0 0 2 】： 3 c 5 h 1 0 0 5 _ 5 c 2 h s o h + 5 c 0 2 酵母木糖代谢的途径比葡萄糖代谢的途径复杂得多。在代谢过程中部分木糖转化为其 他副产物。因此，酵母木糖代谢产生酒精的理论得率为o 4 6 克酒精克木糖 c h a nec ，1 9 8 6 】， 低于葡萄糖酒精发酵的理论得率0 5 1 克酒精克葡萄糖。 4 2 可以发酵木糖产乙醇的微生物 要得到较好的发酵木糖产生乙醇的微生物，有两个策略，一是从自然界中筛选天然利 用木糖的微生物( p a r e l ( 1 l et a l 1 9 8 6 ，1 9 8 8 ；l i n d e n et a l 1 9 9 2 ) ；二埠通过代谢工程手段改造微生 物，使其利用并发酵木糖( h a l l b o m et a l 1 9 9 1 ；w a l f r i d s s o ne ta 1 1 9 9 5 ，1 9 9 6 ；o h t ae ta 1 1 9 9 0 ， 1 9 9 1 a , 1 9 9 1 b ；k o t t e re ta 1 1 9 9 3 ；t a n t i r u n g k i je ta 1 1 9 9 3 ；z h a n ge ta 1 1 9 9 5 ) 首都师范人学硕士学位论文 5 发酵木糖产乙醇的重组酿酒酵母菌的构建工程 5 1 木糖的转运 酿酒酵母不利用木糖生长，也不发酵木糖产乙醇，但可以以极低的速度代谢木糖( v a n z y l ，1 9 8 9 ) 。在酿酒酵母中，木糖被认为是通过一些葡萄糖转运因子的介导进入细胞的( v a n z y l 1 9 9 3 ，k o t t e r l 9 9 3 ) 。h a m a c h e r 等研究了1 8 种单糖转运因子完全缺失的酿酒酵母 t m b 3 2 0 1 ( w e i e r s t a l lt1 9 9 9 ) ，虽然该菌株有利用木糖的完整途径( h a m a c h e rt2 0 0 2 ) ， 但仍不能吸收和利用木糖生长，说明木糖在酿酒酵母中的运输依赖于葡萄糖运输系统。但 z y l 等在研究木糖转运时指出，木糖利用率在利用棉籽糖作为共底物时，比利用葡萄糖作 共底物时要高，由此可知葡萄糖对木糖的转运和利用有阻遏作用。因此异源表达专门转运 木糖的运输因子基因将是非常有用的。 近期，l e a n d r o 等( l e a n d r o2 0 0 6 ) 从中间假丝酵母( c a n d i d ai n t e r m e d i a ) 中分离 出第一个编码葡萄糖木糖同向转移因子的基因，并且在酿酒酵母中得到了成功表达，结 果转运木糖的l ( i l l 值是0 2m m ，但是对葡萄糖的l ( i i l 值却比此低1 0 倍。a n us a l o h e i m o ( a n u 9 首都师范人学硕i j 学位论文 s a l o h e i m o2 0 0 7 ) 等利用已经删除了七个己糖转运因子基因的酵母菌株对能高效代谢戊糖 的丝状真菌t r i c h o d e r m ar e e s e i 的c d n a 进行筛选，得到一个与真菌的糖类运输因子高度同 源的c d n a 克隆。带有该克隆的重组酵母菌株开始并没有表现出明显的利用木糖生长的趋 势，但经过长期的液体培养后，产生了利用木糖生长而不利用葡萄糖生长的突变，得到的 新转运蛋白因子t r x l t l j 以乎编码一个专门转运木糖的特殊蛋白。这为木糖转运因子的克隆 表达提供了一个新的来源。 关于木糖转运是否是酿酒酵母进行木糖发酵的限制因素，也存在着一些相对立的观 点。h a m a c h e r 等研究酿酒酵母时指出，去除所有1 8 种戊糖转运相关基因后，细胞丧失了 吸收和利用木糖生长的能力，但是超表达木糖转运蛋白基因并没有得到预计的在厌氧条件 下利用木糖生长加快或者木糖发酵速率提高等结果，因而认为木糖的吸收对木糖代谢流量 的影响是有限的。g d r d o n y i ( 2 0 0 2 ，2 0 0 3 ) 等在研究中指出，木糖转运对于带有x r x d h ) ( 1 ( 的重组菌株的木糖利用率的影响很小，除非木糖代谢途径得到很大改善。但是当木糖还原 酶的活性很高而木糖浓度很低时，木糖转运就会在很大程度上影响木糖的利用率。 关于木糖运输，国内外的研究均相对较少，相信对此深入研究将有利于提高目前酿酒 酵母木糖代谢工程菌对木糖的高效利用，有望成为新的研究热点，并取得新的突破。 5 2 引入木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的代谢途径 酵母菌木糖代谢的第一步是由木糖还原酶( x r ) 催化木糖转变为木糖醇，编码x r 的基 因为叫j 。p s t i p i t i s 中的x y l l 已有3 个小组独立克隆出来。近来，从k l u y v e r o m y c e s l a c t i s ，p a c h y s o l e nt a n n o p h i l u s ，t r i c h o d e r m ar e e s e i 至s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中 也克隆到与此相当的基因。木糖代谢的第二步是由木糖醇脱氢酶( x d h ) 催化木糖醇转变 为木酮糖，编码x d h 的基因为x y l 2 ，该基因已经从p i c h i as t i p i t i s ，c a n d i d at r o p i c a l i s ， t r i c h o d e r m ar e e s e i 中克隆到，近来p e t e rr i c h a r d 发现s c e r e v i s i a e 中也存在x d h ，只 是该酶有葡萄糖抑制效应，在培养基中只有木糖时才表达。 早期人们尝试在s c e r e v i s i a e 中表达来自p s t i p i t i s 的x y l l 和x y l 2 ( j i n y s 2 0 0 0 ， k o t t e r ，1 9 9 3 ，w a l f r i d s s o n ，1 9 9 7 ) ，得到的重组菌株能利用木糖生长，但由于相当一部分 木糖转变成了木糖醇，故由木糖产生的乙醇量并不明显( j i n ，y s 2 0 0 0 ，k o t t e r l 9 9 3 ) 。 推测在重组酿酒酵母中表达的x r 和x d h 所需辅助因子不平衡是酒精产生受到限制的原因 之一。x r 和x d h 的辅酶分别倾向于n a d p h 和n a d + ，一方面这两个辅酶在酿酒酵母中不能直接 l o 首都师范人学硕l ：学位论文 转化，其再生过程彼此独立，造成了细胞内辅酶氧化还原的不平衡，另一方面，在乙醇发酵 的氧限制条件下，酵母细胞内n a d h 积累，不能及时还原成x d h 所需的辅酶n a d + ，使得中间产 物木糖醇积累，影响乙醇得率的提高。 因此，通过改变p s t i p i t i s 的x r 、x d h 的辅酶偏好，使二者利用的辅酶能够相互偶联， 是解决酿酒酵母木糖代谢工程菌辅酶不平衡问题的一项探索性研究。m e t z g e r 等 1 9 9 5 将从t h e r m o a n a e r o b i u mb r o c k i i 的乙醇脱氢酶基因中得到的n a d p 识别序列引入x y l 2 ，得到 的酶可以利用n a d 和n a d p ，并且两者的表观