细胞基本培养技术常规培养ppt课件

八、常规组织培养法,消化培养法组织块培养法,1,1消化培养法【用品】取自人或动物体的新鲜组织15cm3Hanks液100ml胰蛋白酶(O.025)50100ml培养液(含血清1020)50ml吸管(直头)和胶帽各10个平皿(直径6厘米)4套培养瓶若干,2,烧杯(50m1)2个电磁搅拌器1个三角烧瓶(100m1)1个不锈钢筛(20m、100m、200m)各1个眼科剪2把眼科镊2个计数板1块,3,【步骤】(1)准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟；注意：组织块、胰蛋白酶、培养液等易受紫外线伤害的物品，最好在培养时再携入操作野；如预先置入，需用纸张覆盖，以免受射线影响；开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部；(2)布局：点燃酒精灯(或煤气灯)，安装吸管帽(应通过火焰)；,4,(3)处理组织：把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗23次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3060分钟；(4)剪切：用眼科剪把组织块切成23毫米大小的块(用手术刀切割亦可)，以便于消化；加入比组织块总量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；,5,(5)消化：或用恒温水浴，或置)37C温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好(消化前瓶中需置一无菌搅棒)；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。,6,(6)分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块(必要时可继续进行消化)；低速(5001000转分)离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液)；,7,(7)计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH要求在7274范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整；,8,(8)培养：置入37C温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。评价：胰蛋白酶消化培养法，能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快地长成单层。本法尤适用于培养大量组织，细胞产量高；但用于经常性小量培养工作稍显繁琐，无菌操作不良时且易污染。,9,10,组织块培养法,【用品】取自人或动物体的新鲜组织15cm3Hanks液100mlNaHC032ml胰蛋白酶(O.025%)50100ml培养液(含血清1020)50ml吸管(弯头和直头)和胶帽各10个培养瓶若干烧杯(20m1)或青霉素小瓶各1个眼科剪2把眼科镊2把,11,【程序】(1)剪切：把组织小块(1cm3)置入小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗23次以去掉表面血污，吸净Hanks液，用眼科剪反复剪切成lmm3块为止；(2)摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置入培养瓶中；用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底上，小块相互距离为0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布2030块；,12,(3)轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上；注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞，置37温箱2小时左右(勿超过4小时)，使小块微干涸,13,(4)培养：从温箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块(组织小块附着尚不牢，注意不要把组织块冲走)；置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后，再补加培养液。,14,评价：翻转培养瓶的目的是为使组织块微干涸，以利贴附和免从瓶壁流失，但时间不宜过长，超过三四小时以上可能对组织有不利影响。组织块培养法操作简便，顺利情况下，组织小块贴壁培养后24小时，细胞即可从小块边缘向四周游出，通过生长增殖，最终亦可连接成片；原组织小块可完全散成细胞而消失。,15,如组织块过大，残留小块换液时弃掉或再置另瓶中继续培养。组织块通过反复剪切可能受一定损伤，并非每块组织都有生长能力，但只要有一部分能生长往往即可形成单层。,16,17,3初代培养意义的讨论：组织初代培养是后续培养的关键阶段。初代培养成功与组织污染与否、供体年龄、培养操作技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关初代培养是各种培养必经阶段；总的看，对某一组织进行初代培养时，在未掌握规律和找到适宜培养条件之前，一是比较困难的。一旦成功和能进行传代培养成为细胞系后，细胞则较易生存。但传代后的细胞也并非总是一帆风顺，有时生长一段时间，未达终极期便衰退死亡，说明培养环境仍不理想。初代培养细胞刚离开机体，生物学性状与生物学性状与原体内细胞比较接近，适用于做药物检测等实验。,18,九、特殊培养法,（一）、二倍体细胞培养法(DiploidCellCulture)所谓二倍体细胞培养，是培养的细胞始终维持二倍体生物学性状的培养方法。因其与体内细胞相似性大，在实验中有很大应用价值。二倍体细胞来源体内二倍体细胞，也即正常细胞的初代培养。初代培养细胞成功后能始终保持二倍体细胞性状，便成为二倍体细胞培养。,19,要点二倍体细胞虽不难培养，但欲求长期呈旺盛地增殖生长、并保持二倍体细胞性状，亦非易事。为此必须采取一些有效的措施，一是低温冻存，二是妥善的培养方法。用反复传代的方法以求获得大量细胞和维持细胞长期生存的办法是不妥的。因为在反复传代中，难免由于培养条件的变化和其它不利影响，使细胞生物学性状发生变化。随时间延长不仅能导致细胞停止生长，并可失掉二倍体性状或发生转化,20,采取以下措施可能利于二倍体细胞培养：严格控制pH值，最好在5CO2温箱中培养；换液时间不要间隔太长，且不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液，以弃掉1/2或2/3为妥；传代期不能过长，不能让细胞长得过于密集，一旦细胞接近或刚刚连接成片，即进行传代；,21,要选用高质量的培养基和血清，并尽量维持不变，每次传代都按一分为二的原则(细胞数量、营养液量、培养瓶的空间和面积都一样)进行培养；传代后如细胞不用于实验，立即低温冻存来源于胚胎的二倍体成纤维细胞平均分裂50次左右即进入衰退期。,22,不同种类和来源的二倍体细胞生存期都不一样，但生存期皆有限。虽然二倍体细胞具有限的生存期，却完全能满足反复使用的要求。而在实际应用上，初代接种的细胞都几十万以上，因此一个二倍体细胞系最终提供的细胞数量近于无限的。,23,方法二倍体细胞培养方法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：(1)吸除旧培养液注入另瓶中；(2)用温BSS冲洗1次；(3)用O.25温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可；作用15分钟；,24,(4)待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液(新旧培养液按2:1新旧混合)；(5)轻轻反复吹打制成单个细胞悬液(消化不足或吹打不充分，易形成细胞团，不利于生长，应注意避免)；(6)按一分为二比例接种培养。,25,讨论：如何能保留有大量可利用的二倍体细胞?首先在初代二倍体细胞培养时，要接种多量细胞；生长成功后立即冻存做为种细胞(Stock)。用于实验时，解冻1分Stock，传13代，二倍体细胞是可长期应用的。,26,27,注意：传代是细胞培养中经常性操作，有三点注意事项：把握好传代时机，已如前述，在80%90%汇合阶段最好，过早传代细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳。二是消化时间要适度，过短细胞不易从瓶壁脱落，过长细胞可脱落流失。,28,三是消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。另外各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可从瓶壁直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。,29,消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长增殖速度一致，实验结果可靠性大。,30,（二）、加支持物培养法,加支持物培养法是预先向培养容器中加入各种可使细胞贴附的支持物，进行培养的方法。待细胞贴附于支持物生长增殖后，可进行各种实验和观察。观察时可把支持物从瓶中抽出，能做各种技术处理，是研究工作中常用的方法之一。各种对细胞无毒性的如玻璃、塑料、鸡卵壳膜、胶原、硅橡胶、袋泡茶包装纸等，均可做支持物用。,31,1支持物制备特制有机玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等：其中以玻璃片和特氟隆薄膜最为多用。前者便于做各种固定、染色处理和观察；后者最适做电镜技术，允许做包埋和切片。,32,加支持物培养法程序与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。特氟隆薄膜为定型无菌包装产品，用时无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可。通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡24小时96酒精3060分钟蒸馏水浸泡3060分钟用干净软布擦拭干净(擦时应戴白手套工作)装入培养器皿中高压或干热灭菌备用。,33,2培养法：初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。支持物培养法中最重要的是支持物一定要处理干净，不残留任何对细胞有害成分，以免不利细胞贴附和生长增殖。,34,（三）、单细胞分离(克隆)培养,单细胞分离培养又称细胞克隆(Cellcloning)，即把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。初代培养细胞或其它未经细胞克隆化的细胞系都具有异质性，细胞经过克隆以后，后裔细胞群来源于一个共同的祖细胞，即形成所谓纯系，称细胞株(CellStrain)。细胞株的细胞遗传性状差异减少，生物性质均一，利于实验研究。,35,1原理：从理论上说各种培养细胞都可用以进行克隆培养。但实际上，初代培养细胞和有限细胞系(二倍体细胞)比较困难。无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞等则比较容易。其原因是，当体内任何细胞被置于体外培养后，对培养环境都有一个适应过程，期间细胞对营养液具有同化作用，即从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物，也有促细胞生长物质。,36,有人称之为化学信使，具有促克隆细胞生长作用，实则为生长因子类物质。单细胞同化营养液能力不如群体细胞强；初代培养细胞、有限细胞系不如无限细胞系、转化细胞和肿瘤细胞强。转化细胞和肿瘤细胞强的原因，可能与它们有自泌(Autocrine)和内泌(Endocrine)，即自己合成生长因子能力有关。,37,凡对培养环境有较大适应性和具有较强独立生存能力的细胞，均易做细胞克隆。克隆细胞时，要把细胞先制备成单细胞悬液，再接种培养在底物上，让细胞单独生长。适应性较大和活力好的细胞能增殖形成细胞小群(Colony)克隆。细胞群单个细胞形成克隆的百分数称克隆形成率或克隆率(CloningEfficiency)，也称接种率(SeedingEfficiency)。两词都可用于表示细胞生活力和独立生长能力，但克隆形成率含义比接种率更为确切。,38,2提高克隆形成率的措施细胞经过稀释后，在低密度状态下培养时，克隆形成率明显下降，即克隆形成率与细胞的密度成正比。对无限细胞系克隆形成率一般很少降到10%以下,但初代培养细胞和有限细胞系的克隆形成率则很低，仅有0.5%5%，甚至为零。因此必须提高细胞克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施：【培养基】：为提高细胞克隆形成率，选择适当的培养基是非常重要的环节，现知以下一些培养基用作克隆时效果可能较好。,39,常用细胞克隆培养基,40,以上培养基都是个别研究者选用的，难免有一定的局限性。事实上分散于各实验室的同一种细胞，经过长期培养后，难免发生一些适应性变化。因此同一种培养基也不一定能适用于不同条件下的同类细胞。在克隆细胞中，最简易和行之有效的方法是使用适应性培养基或条件培养基(ConditionalMedium)，它是一种不含有细胞而已经被细胞生活过或同化过的培养基。,41,其制备方法是：(1)培养同源细胞(未克隆前时的同一细胞)至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养2448小时后，吸出所有培养液；(2)离心：30004000/分离心10分钟后，吸取上清液；(3)滤过：再经直径O.22m滤孔的滤膜过滤。低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。,42,注意：分离适应性培养基时一定要利用处于指数增生期时的细胞。因此时的细胞生长最旺盛，机能活跃，向周围环境释放促生长的物质最多，培养液中营养成分又未被耗尽，是分离制备的最好时刻。刚分离后的适应性培养基中可能含有少量细胞，一定要通过离心和滤过排除干净，以免形成假克隆。【血清】以胎牛血清为上，小牛血清和马血清次之；用时应先做克隆形成率试验，选最佳者用之；血清需做灭活处理。,43,【饲细胞】饲细胞(FeederCells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞受射线照射或丝裂霉素C作用后，便失去分裂能力但仍然生存并有同化营养液的能力。当被用作克隆的细胞散落在饲细胞上层与之接触后，饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成；克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。制备过程如下：,44,(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按103细胞/毫升重新接种培养；(2)在细胞半汇合时，准备0.25g/ml的丝裂霉素C(MitomycineC)，按2ug/105细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量3050戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5104/ml(104细胞/cm2)接种入新培养基中；(4)48小时后，即可用于细胞克隆之用。,45,讨论：(3)项可略去，即细胞受照射后，再培养2448小时，便可作饲细胞之用。饲细胞制备后三周内即死亡应及时应用(做饲细胞时避免用同源细胞)。因饲细胞制备繁锁，在应用多孔培养板克隆细胞后，已少有人再用饲细胞进行克隆细胞；但作为底物，用以培养其它难培养的细胞尚有其应用价值。,46,【激素】110u(国际单位)/ml营养液的胰岛素能促进很多细胞克隆的形成。地塞米松也有能提高人正常胶质细胞、胶质瘤细胞、成纤维细胞、黑色素瘤细胞等的克隆形成率。【CO2】CO2对绝大多数细胞克隆形成率都有提高作用，常用5%浓度。对有的细胞，如人的成纤维细胞和胶质细胞克隆时，2%的CO2效果可能更好。HEPES(20mM)与2%CO2并用能保护细胞免受pH值波动的影响。如无CO2温箱，需用NaHCO3调节pH维持在7.27.4。,47,【底物特殊处理】有人证明，用多聚右旋赖氨酸处理培养瓶、培养皿底物后，能提高用低血清培养人成纤维细胞的克隆形成率，其方法如下：(1)制备浓度为lmg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底；(2)倒出多聚赖氨酸液，用5mlPBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用亦可。有报道，用培养液配制的浓度为5ug/ml的纤粘连素处理底物后亦有类似效应。,48,【适应性底物】不同细胞喜欢贴附在不同性质的底物上，使用适应性底物利于细胞形成克隆。无限细胞系易贴附于塑料底物上。初代培养细胞易贴附于胶原层或血浆纤维蛋白层底物上。血浆纤维蛋白层制备法如下：先制备出含有0.12单位凝血酶的培养液100毫升；配方为：(1)纤维蛋白原液：纤维蛋白原250mgNaCl800mg枸橼酸钠25mg,玻璃三蒸馏水1000ml滤过法灭菌,49,(2)向培养皿中先加lml纤维蛋白原液，然后再续加4ml含有凝血酶原的培养液，迅速用吸管头充分混合，数分钟后便凝集形成一层清晰的胶状膜；(3)再把细胞接种于此膜之上；也可先把细胞加入到含有凝血酶原的培养液中，在加入纤维蛋白原液后，再让细胞附在胶膜上生长。,50,另一个简单的底物层是琼脂层，常用浓度为2%；琼脂层制备后，可把细胞接种在琼脂层上。琼脂中含有酸性硫酸粘多糖，对大多数细胞生长有一定抑制作用，但对一些病毒转化的细胞和恶性细胞却无大影响。琼脂的这种选择性作用，一是很多细胞难以贴附，二是其中含有抑制的多聚阴离子，不利正常细胞生长。琼脂经降低毒性处理，特别是减少多聚阴离子后的产物即为琼脂糖(Agarose)。琼脂糖可用作克隆不能在琼脂中生长(因毒性)的贴附依赖性细胞。,51,实验证明，恶变细胞或恶性转化细胞在软琼脂(1.2%)的生长与在裸鼠体上的致瘤性有很大一致性。因此测试细胞能否在软琼脂中生长，已成为测试转化细胞恶性性的重要指标，不同的底物适应于不同细胞的要求。,52,3多孔塑料培养板单细胞克隆法Saford的毛细管克隆细胞法是最早的单细胞分离培养技术。其基本过程是：在显微镜窥视下，直接用毛细玻璃管从细胞悬液中吸取单个细胞，再进一步分离培养形成克隆。本法虽比较精确，但过程较繁琐，成功率低，已少采用。除毛细管法外也还有很多其它方法，但自从多孔塑料培养板问世并用于克隆细胞后，其它法已很少应用。,53,多孔塑料培养板克隆细胞法已成为当前克隆细胞的主要技术，可极大提高细胞克隆的成功率并且简而易行。多孔塑料培养板克隆细胞的主要过程是：先制备出12细胞毫升低密度的细胞悬液，然后向多孔塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液0.5lml，则每孔平均含1个细胞。镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞的孔，置温箱培养，数日后凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞。其法如下：,54,【材料】健康状态良好的对数增生期细胞克隆培养基(适应性培养基或F12等；含10%血清)100.0ml胰蛋白酶(O.25%)10.0mlHanks液100.0ml,55,刻度吸管2支粗试管5个吸管5个计数器1个多孔塑料培养板(96孔)1块微量加液器(O.1ml1ml)1个细胞悬液制备,56,57,【程序】(1)消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液；(2)低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液：然后稀释细胞，使之成为12细胞毫升悬液；最适宜细胞密度为12细胞ml培养液；,58,(3)接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加O.5毫升；接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养；,59,(4)标记：培养612小时后，待细胞下沉并贴附于培养板孔底后；从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含单个细胞的孔，置CO2温箱培养；CO2箱内含有水槽，以保持箱内湿度。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液。待孔内细胞增500600个时，可进行分离培养；,60,(5)分离扩大培养：培养8696小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗12次，继加胰蛋白酶少许，加入量以能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入O.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体后，即转用常规培养法培养。,61,注意：观察并挑选孔内确实仅含有一个细胞后，才可进行标记。观察时要特别注意孔底边缘部位，如细胞落于该处，可能由于直角部折光而观察不清。凡不能确认含一个细胞的孔者，不进行标记，以免发生假克隆。标记时要挑选含有缝康细胞的孔(细胞体积适宜，轮廓清晰完整)。亦可接种到其它底物如碟皿中进行细胞克隆，但细胞易流动和克隆形成后不易分离。如仅为测定细胞克隆形成率，而不做单细胞分离，仍可用培养皿中培养法。,62,四、球体细胞培养各种细胞培养法都有一定的局限性，最多用的单层细胞培养也有不足之处，一是传代时要做消化处理，对细胞有一定的损伤；体内各种组织细胞获得营养的条件是不一样的，而体外培养的单层细胞与培养液接触机会却是相同的。也是影响分化因素之一。进行球体培养时，能使培养细胞长成球体形，球体中心部细胞吸收营养和排出代谢产物要通过外围细胞，周边部细胞却是直接的，两者生存条件不同，与肿瘤组织和体内上皮组织情况相似，对研究细胞分化很有应用价值。,63,1原理：大多数培养细胞都具有贴附在底物上生长成单县细胞的性质，如细胞长成片之后细胞片与底物脱离，更换到使细胞不易贴附的底物上继续生长时，则细胞片能卷聚成球体形，成为球体培养。,64,2培养方法【用品】细胞：能贴壁生长的细胞都可用于球体培养试剂和用品：2%的琼脂培养基30.0mlO.25%胰蛋白酶液10.0ml吸管5支Hanks液100.0m1,65,培养液：A液：合成培养液(199或1640等)20.Oml，小牛血清10ml，10%NaHCO3O.5ml。以上液充分混合后，水浴加温到60。B液：4%的Bacto琼脂20ml，煮沸后冷却到60与A液相混成琼脂培养液。,66,【程序】(1)琼脂铺底的培养瓶：30ml无菌培养瓶，每瓶中加5ml2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用；(2)取生长状态良好已联接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞层纵横割划成若干小区后，倒出培养液；(3)加入O.25%的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次(不洗亦可)，加入新培养液35ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来；分装入13个含2琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体；,67,(4)换液：培养12日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。注意：消化细胞方法是影响细胞能否集聚成团，形成球的一个重要因素，如用0.25%的胰蛋白酶加O.2%的EDTA消化细胞，虽能把细胞消化成分散的细胞悬液，但接种在任何底物上都不易形成球体，可能与EDTA作用有关。又当细胞尚未连接成片时，消化后也容易形成分散的细胞悬液，同样难以形成球体；从而细胞片是形成球体生长的一个重要条件。,68,69,球体细胞也可和单层细胞混合培养，便于研究两种不同细胞的相互影响。方法是：先做单层培养，待细胞长成单层细胞后，把2%琼脂培养液注入瓶内，令其在单层细胞上面形成琼脂层。注意在加琼脂时，要使琼脂冷却到快要凝固前再注入瓶内，以避免过热损伤细胞。当琼脂凝固后，再把已准备好的另一种细胞球体培养液接种在上面，便形成琼脂层下为单层细胞，上层为球体细胞的混合培养。,70,下层细胞生活在琼脂培养液中，既能从琼脂培养液中也能从上层培养液中获取营养；因琼脂的限制