（光学专业论文）线性偏振光激发Ⅰ型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论.pdf

华南师范大学硕士学位论文 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 摘要 专业名称：光学 申请者姓名：常颖 导师姓名：邓小元 本文建立模型来探究i 型胶原蛋白在线性偏振入射光照射下，所激发出二次 谐波( s h g ) 的显微成像理论。我们重点讨论了以下几个参量对激发s h g 的影响， 其中主要包括入射光偏振方向 ) ，数值孔径( m ) ，超极化率比率( p = 氏) 和胶原倾斜角( 驴) 。我们的模拟结果显示，以上各个参量对s h g 的激发能量大小、 分布、传播方向等情况都有着不同程度的影响。 我们的模拟结果显示入射光的线性偏振方向 ) 是影响s h g 能量大小的很重 要因素，s h g 发射能量随着a 呈现了周期性的变化。偏振方向 ) 同时也是影响 s h g 最大强度偏转方向的重要因素。为了可以更好的说明a 对s h g 强度的作用， 我们特殊地对比了在线性偏振准直光和聚焦光下激发出s h g 的差别。我们探究了 s h g 沿着f 轴的分量厶州o = x ，y ，z ) 、s h g 发射偏离角y 和利用旋转偏振片的偏 振角九( f - x ，x ，y ，歹= y ，z ，z ) 在扩平面内所收集到的s h g 信号强度厶。， 。结果显 示，在砂平面内，准直光和聚焦光激发s h g 随着偏振角a 的改变没有出现明显 的差别，包括，2 ，2 ，y 叫和，2 。删。 数值孔径直接影响聚焦光的聚集程度，在激发光在通过聚焦点后有一定的相 i d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e eo fs o u t hc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y 位延迟，直接导致s h g 发射沿着两叶方向传播。我们的模拟结果显示低n a 使s h g 发射的模式呈现相对靠近的两叶，但是高n a 使得s h g 发射沿着相对远离的两叶。 超极化率比率( p = 肛) 很大程度上反应了胶原的结构特性。s h g 激发 随着p 的变化呈现出复杂的形式，具体表现在a 影响s h g 的发射能量大小的同 时，在偏振角a 0 。的情况下，p 在3 之间的变化使得s h g 能量呈现出不对称 的激发模式。这说明偏振方向仅和超极化率比率p 对于s h g 的影响同样明显。除 此之外i 胶原纤维极性反转( p = 2 6 ) 也作用于s h g 强度，如，：蚶，y 叫和厶刀。 准直光和聚焦光下，：j 和y 砂模拟结果很相似，但是在偏振角a = 3 0 。的时候， ，2 刀还是表现出些许的不同。在聚焦光偏振方向a 的变化下，极性反转对s h g 强度信号厶浑、厶，弦的收集以及最大强度偏振角y 露，y 弦影响很大，尤其在偏振 角a = 6 0 。的时候。 最后我们讨论了胶原位于旋转轴情况下，在偏振角a 和胶原倾斜角共同作 用下的s h g 电场强度和发射能量沿着直角坐标系的分布情况。当咖超过7 r 4 的时 候，s h g 信号几乎探测不到。s h g 电场强度( 易。，易”，易叩) 和能量分布 ( 最，e 2 c o , p 罡叩) 受到倾斜角的影响非常明显。在a = o 和a = 9 0 。情况下，倾斜 角妒作用于易唧，易，昱 和昱叩表现出了相同的激发模式。可是当 a = 4 5 。易邮和最 出现了较大差异的模式，垦 和昱唧与a = o 。和a = 9 0 。的时 候很相似。但背向与前向的s h g 激发模式不沿着三方向对称。s h g 总电场强度 易。和能量分布最国的激发模式基本相同，当妒= 2 7 。，二者达到峰值。我们的理论 模拟为线性偏振光下胶原中产生的s h g 显微成像实验提供了有力的线索。 关键词：s h g ，偏振方向( a ) ，数值孔径( m ) ，超极化率比率( p ) 和倾斜角 ) l i 华南师范大学硕士学位论文 t h e o r e tlc a lsim u l a t 10 ns t u d yo fkin e a r l y p o l a riz e dkig h t0 n c r o s c o pics e c o n dh a r m o nic a b s t r a c t g e n e r a tio n ( s h g ) inc o l l a g e ni m a j o r , o p t i c s n a m e ，y m gc h a n g s u p e r v i s o r , x i a o y u a nd e n g i nt h i s p a p e r , t w ot h e o r e t i c a l m o d e l sa r ee s t a b l i s h e df o r d e a l i n g 、析t h s e c o n d - h a r m o n i cg e n e r a t i o n ( s h g ) i nt y p eic o l l a g e ne x c i t e db yl i n e a r l yp o l a r i z e d l i g h tf o c u s e db yam i c r o s c o p e w i t ht h i sm o d e l ，t h ee f f e c t so ft h ep o l a r i z a t i o na n g l ea ， n u m e r i c a la p e r t u r e ( n a ) a sw e l la st h er a t i oo fh y p e r p o l a r i z a b i l i t y ( p = 9 嗽| 9oa n d t h ei n c l i n e da n g l e ( 驴) o ns h ge m i s s i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d o u rr e s u l ts h o w st h a t a l lo ft h ee f f e c t sc o n t r i b u t et ot h ea m p l i t u d eo fe m i s s i o ns h gp o w e r , p r o p a g a t e d i r e c t i o na n dp o w e rd i s t r i b u t i o nr e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so ft h el i n e a rp o l a r i z a t i o na n g l e ) a r ev e r yo b v i o u s s i m u l a t i o n r e s u l t sr e v e a lt h a ts h ge m i s s i o np o w e rc h a n g e sp e r i o d i c a l l ya sa s h ge m i s s i o nh a s b e e nc o m p a r e du n d e rc o l l i m a t e da n df o c u s e db e a me x c i t a t i o n r e s p e c t i v e l y i n i i i d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e eo fs o u t hc h i n an o r m a lu n i v e r s i t y p a r t i c u l a r , s h ge m i s s i o nc o m p o n e n t sa l o n g i a x i s ( ，2 j ) ( f = x , y ，z ) ，t h ei n d u c e d s h ge m i s s i o nd e v i a t i o na n g l e y f a sw e l l 鹊d e t e c t e ds h gs i g n a l s ( 1 2 l ，) i n 驴 p l a n eb yr o t a t i n g t h e a p p l i e dp o l a r i z e r a n g l e 九h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d ( i = x , x ，y ，j = y ，z ，z ) r e s u l t ss h o wt h a tu n d e ro u rs i m u l a t i o nm o d e l ，s h ge m i s s i o n i nx yp l a n e ，s u c ha s1 2 j ，2 。y ，y 叫a n d 厶m v a r y i n g 嬲p o l a r i z a t i o na n g l e ( a ) u n d e rc o l l i m a t e da n df o c u s e dl i g h tp r e s e n t sr i os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e n u m e r i c a la p e r t u r ee f f e c t so nt h el e v e lo ff o c u sb e a ma p p a r e n t l y t h i si n t e r e s t i n g p h e n o m e n o nw a se x p l a i n e d 嬲b e i n gar e s u l to ft h eg o u yp h a s es h i f ta c r o s st h ef o c u s o ft h ee x c i t a t i o n t 1 1 eu s eo fl o w e rn al c a d st ow e a k e rs h ge m i s s i o nb u tm o r e c o n c e n t r a t e di nt w oc l o s e rl o b e s ，w h e r e a sm o r ed i s t r i b u t e de m i s s i o ni nt w od e t a c h e d a st h ei n t r o d u c t i o no fp o l a r i z a t i o nd i r e c t i o nw h i c hi sn o ta l o n gw i t l lt h ef i b e ra x i s ( 口0 。) ，o n em o r ee l e m e n t 卢，时i sv a l i di no u rc a s et h a n 卢。a l o n e ，w h i l et h e i r r a t i opp l a y sv e r yi m p o r t a n tr o l ef o rc o l l a g e nf e a t u r e sc h a r a c t e r i z a t i o n s h ge m i s s i o n 、析mps h o w sc o m p l i c a t e dm o d a l i t yt h a ts h ge m i s s i o ni sd i f f e r e n ta td i f f e r e n t 口 a n dn o ts y m m e t r i ca t pe x c e p ta ta = 0 。，s u g g e s t i n gt h ei m p o r t a n ti m p a c to f p o l a r i z a t i o nw o r k i n go npf o rs h g e m i s s i o n t h er e v e r s eo ft h ef i b r i l sp o l a r i t yh a s i n d u c e dg r e a ti m p a c to n l 旺芦，7qa n di2 m 郦i nb o t hc o l l i m a t e da n df o c u s e dl i g h t ，2 j a n dbs h o wt h es i m i l a r i t y b u t ，2 刀a t a = 3 0 。d e m o n s t r a t e sas l i g h t d i f f e r e n c ei nf o c u s e dl i g h tt ot h a ti nc o l l i m a t e dl i g h t u n d e rf o c u s e dl i g h t ，t h er e v e r s e o ff i b r i l sp o l a r i t yc a u s e so b v i o u sc h a n g e so ft h ec o l l e c t e ds h gi n t e n s i t y1 2 m 皿a n d 1 2 m 沪a ts p e c i a lp o l a r i z a t i o na n g l es = 6 0 。嬲w e l l 鹤y 。，y 弦a l o n g a i v 华南师范大学硕士学位论文 f i n a l l y ，t h ee f f e c t so fp o l a r i z a t i o na n g l ea sw e l la st h et i l ta n g l e 咖o ns h g e m i s s i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d o u rr e s u l t ss h o wt h a ts h gs i g n a l s ，l i k et h et o t a l ， p a r a l l e la n dp e r p e n d i c u l a rc o m p o n e n t so fe l e c t r i c a lf i e l dr a d i a t i o n ( 易，岛 ，岛 ) a n de m i s s i o np o w e r ( 罡。，罡。，p ，罡，) ，h a v es i g n i f i c a n td i v e r s i t yd e p e n d e n to nt h e e f f e c t sf r o mt i l ta n g l e 妒w h e n e x c e e d s t 4 ，t h es t r e n g t ho fs h ge l e c t r i cf i e l d i sa l m o s tu n d e t e c t a b l e i ng e n e r a l ，t h ee f f e c to f 妒o ne 乞，e 二，咒a n d 圪 p r e s e n t ss i m i l a rp a t t e r n su n d e ra = 0 。a n da = 9 0 。，h o w e v e r , t h e yd i s p l a yd i f f e r e n t f e a t u r e sw h e na = 4 5 。t h ed i s t i n c td i f f e r e n c e sa r et h a tt h ep a t t e r n so fe 2 la n d 艺 a t 口= 4 5 。a r ed i f f e r e n tf r o mt h o s eu n d e ra = 0 。o r a = 9 0 。，w h i l et h ep a t t e r n so f e 乞a n d 咒a r es i m i l a r , b u tt h eb a c k w a r d ( b - s h g ) a n df o r w a r d ( f - s h g ) r a d i a t i o n 蠡l 它 a r en o ts y m m e t r i c a la l o n g + 三w h e nt i l ta n g l e # = 2 7 。，t h ee m i s s i o ns h g s i g n a lr e a c h t h em a xa m p l i t u d e o u rt h e o r e t i c a ls i m u l a t i o nr e s u l t s p r o v i d eu s e f u lc l u e sf o r e x p e r i m e n t a ls t u d yo fm i c r o s c o p i cs h ge m i s s i o ni nc o l l a g e ne x c i t e db yl i n e a r l y p o l a r i z e db e a m k e yw o r d s ：s e c o n d - h a r m o n i cg e n e r a t i o n ( s h g ) ，p o l a r i z a t i o nd i r e c t i o n ( a ) ，n u m e r i c a l a p e r t u r e ( n a ) ，h y p e r p o l a r i z a b i l i t i e s ( 卢) ，t i l ta n g l e ) v 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 目录 摘要 a b s t r a c t 第一章前言 1 1 课题背景 1 2s h g 显微成像技术的发展状况 i i i 川 1 3s h g 显微成像技术的应用。 1 3 1s h g 成像技术应用于细胞膜 1 3 2s h g 成像技术应用于胶原纤维。 1 4 第二章 2 1 2 2 2 3 2 4 本课题研究的目的及意义 s h g 原理及条件 非线性光学的二阶效应。 非中心对称结构 相位匹配 1 2 3 4 4 5 8 8 9 9 l l l l 二阶非线性极化率 2 4 1k l e i n m a n 对称 2 4 2 圆柱对称。 第三章入射光激发s h g 发射传播理论 3 1 模型建立。 3 1 1 胶原纤维平行放置下的模型建立 3 1 2 胶原纤维倾斜放置下的模型建立 3 2 聚焦入射光场强 1 4 1 4 1 4 3 3s h g 偶极矩。 3 3 1 胶原纤维平行放置下的s h g 偶极矩 3 3 2 胶原纤维倾斜放置下的s h g 偶极矩 3 4s h g 电场强度。 3 4 1 胶原纤维平行放置下的s h g 电场强度 1 6 1 7 1 8 3 4 2 胶原纤维倾斜放置下的s h g 电场强度。 2 1 3 5s h g 发射方向2 2 3 5 1 胶原纤维平行放置下的s h g 发射方向2 2 3 5 2 胶原纤维倾斜放置下的s h g 发射方向2 3 3 6s h g 发射能量2 3 3 6 1 胶原纤维平行放置下的s h g 发射能量。 3 6 2 胶原纤维倾斜放置下的s h g 发射能量分布 3 7s h g 的发射强度 3 8s h g 的发射偏振方向。 2 3 2 6 2 7 第四章讨论s h g 发射信号的影响因素。 2 8 2 9 4 1 入射光偏振方向 4 1 1 入射光偏振方向对s h g 能量的影响 2 9 2 9 4 1 2 入射光偏振方向对s h g 强度的影响3 l 4 2 数值孔径3 5 4 3 超极化率比率3 7 4 3 1 超极化率比率对s h g 能量的影响3 7 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 4 3 2 超极化率比率对s h g 强度的影响3 9 4 4 倾斜角和偏振方向4 2 4 4 1 倾斜角和偏振方向对s h g 电场强度的影响。4 2 4 4 2 倾斜角和偏振方向对s h g 能量的影响。4 5 第五章结论”5 1 第六章结束语5 6 参考文献5 7 致谢6 3 在读期间所发表的论文一6 4 v i i 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 1 1 课题背景 第一章前言 1 9 6 1 年，f r a n k e n 等人发现利用红宝石激光器输出波长为6 9 4 n m 的激光穿过石 英晶体时可以产生波长为3 4 7 n m 的紫外光。这就是光学二次谐波( s e c o n d h a r m o n i cg e n e r a t i o n ，s h g ) 现象首次被观察到的实验。从此，s h g 被用于倍频 激光器以得到短波长激光，这标志着非线性光学的诞生【l 】o 非线性光学是非线性 物理学的一个分支，它是描述强光与物质发生相互作用产生非线性效应的科学， 非线性光学属于现代光学范畴，是光子技术的基础。 在激光出现之前，光学基本上研究的是线性光学，例如弱光束在介质中的传 播、干涉、衍射、偏振现象等，这些现象的光波满足线性叠加原理。而介质的非 线性效应只有在类似激光这种强光光源下才体现得出来，如谐波的产生、光学参 量放大与振荡效应、光的受激散射、光束自聚焦、多光子吸收、光致透明和光子 回波等。在这里光波的线性叠加原理不再成立，所以称这些在强光作用下介质中 引起的新现象为非线性光学2 1 。非线性光学效应的出现，并不是光束线性效应的 一个小小的补充，而是一些很明显而且很重要的效应，它反映了介质与强激光束 相互作用的基本规律。 激光出现以后，非线性光学发展十分迅速。人们之所以对非线性光学感兴趣， 究其原因，第一，人们可能利用非线性光学效应做成某种器件。例如变频器，从 而有可能提供从远红外到亚毫米波、从真空紫外到x 射线的各种波段的相干光 源。第二，由于某些非线性光学效应，例如双光子吸收、受激拉曼散射、受激布 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 里渊散射等，会引起入射到介质中的光束的衰减，这就限制了通过介质的光通量； 又如自聚焦现象会引起入射光束的畸变，强度太强时，甚至会导致介质的不可逆 损伤，这就从实际中向人们提出了急需解决的问题。第三，由于非线性光学效应 是通过强光与组成非线性介质的原子或分子的相互作用体现的，因而非线性光学 现象是获得这些原子或分子的微观性质信息的一种手段。 1 2s h g 显微成像技术的发展状况 虽然s h g 现象较早被人们所观测，但其应用于生物领域还是近些年来发展 起来的。早期，研究非线性光学现象所使用的非线性介质大多是光学晶体。这是 因为晶体的双折射效应虽然可以用来补偿材料的色散效应，而且利用相位匹配可 使谐波转换效率达到8 0 ，但是，要达到这种理想的结果，这就要求晶体具有较 大的极化率和足够大的双折射效应。由于上述原因，就促成人们对具有这些特性 介质的非线性效应进行研究。1 9 7 1 年，f i n e 和h a n s e n 等人在近透明的生物组织 中发现s h g 3 1 。1 9 8 6 年，f r e u n d 等人首次在以胶原纤维为样品的老鼠尾腱中获 得分辨率大约为5 0 m m 的s h g 显微成像，标志着s h g 成像技术开始应用于生物 成像领域 4 1 。利用s h g 对生物组织非线性光学特性进行探测，在生物医学诊断 中可以发挥重要作用，因此吸引了众多的研究者从事这方面的研究。早在1 9 7 8 年，g a n n a w a y 和s h e p p a r d 就提出了s h g 成像方法1 5 1 。1 9 9 7 年，g u oy c 等提出 了用超短激光脉冲( 1 0 0 f s ) 可对生物组织进行s h g 层析成像，并做了相应的实 验研究【6 一。1 9 9 8 年，g a u d e r o n 等用超短激光脉冲( 9 0 f s ) 对生物组织进行s h g 三维成像的研究，并对嵌有硼酸锂( l b o ) 晶体的琼脂样品进行了实验【钔。1 9 9 9 年，k i mb m 等发表了生物组织超短激光脉冲( 1 p s ) s h g 的理论研究，给出了 2 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 一个简单的关于探测深度的一维模型，同时对一些样品进行了实验【9 】。l e w i s 等 利用s h g 对生物膜上指定区域进行功能成像，并研究了膜电势1 0 1 。 1 3s h g 显微成像技术的应用 相对于传统的成像技术，非线性光学显微技术凭借其可以对活体生物组织成 像的明显优势，已经在生物学成像研究领域占据了主导地位。二次谐波显微成像 技术作为早期应用于生物成像的技术之一，更是以其高分辨率等优点在非线性多 光子成像范畴内得到更多的认可。 随着激光技术、检测技术和计算机技术的快速发展，利用s h g 对活体生物组 织三维成像进行动态测量，为生物医学成像领域提供了一种新方法，有望成为组_ 织形态学和生理学研究的一个强大工具【3 小l 。s h g 激光扫描非线性光学显微术具 有之前成像技术所不具有的优点。第一，它利用超快激光脉冲与焦点附近的生物 ，一一 组织相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源，激发效率与入射光强成正 比，这种强局域性减少了成像时非焦点处发光产生的背景干扰，提高了信噪比和 三维空间分辨率、对比度；第二，对于非焦平面上的生物细胞，可避免双光子荧 光成像中的荧光漂白效应，是一种理想的非侵入生物活体成像方法，因此能长时 间对样品进行成像而不影响其活性；第三，s h g 映样品本身的非线性光学性质， 可以不需要染料标记，成像过程中没有能量吸收，从根本上消除了对样品的光致 毒和光损伤；第四，s h g 显微成像使用的激发光为近红外波段，对生物样品的杀 伤作用小，在高散射体中的穿透能力强，因此可以深入组织内部进行深层次的成 像；第五，s h g 对组织结构的对称性变化高度敏感，对某些疾病的早期诊断或术 后治疗检测起到指示作用【4 ，11 五1 1 。 3 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 针对处于非中心对称环境中的分子功能研究，s h g 显微成像技术尤其适用， 如标记后的细胞膜结构和蛋白结构等【6 7 ，1o 2 2 之蜘。除了动物组织外，一些有特殊 分子结构的植物组织也能产生s h g l 2 9 。 1 3 1s h g 成像技术应用于细胞膜 对于中心对称性的生物结构，也可以由基频入射光照射具有s h g 特性。细胞 膜就属于这类界面。在细胞内，每个分子都有各自的方向，有的方向近乎是完全 相反的，从而导致极化相位相反，极化强度互相抵消，因此在细胞内部几乎没有 激发出来s h g 信号。而界面的分子与体内的分子不同，它们对非中心对称有贡献。 细胞之间或细胞与外界环境之间的分界依靠着细胞膜，并且其维持着细胞内外环 境的差别。当局部界面由于不同物态分子的相互作用使其所在的局部场特性发生 突变，导致局部区域的表面微粒子形成可以符合产生s h g 场的非中心对称结构界 面。如果将对细胞无损伤的特定染色标记分子吸附在具有中心对称性的细胞膜介 质上面，这时界面的分子与在体内的分子不同，它们也可以形成非中心对称结构， 从而对表面产生s h g 信号有贡献【3 2 1 。针对于一些自身激发s h g 信号比较弱的细 胞膜，在研究过程中通过使用一些无毒或低毒害的染料对细胞膜进行标记【3 3 。3 5 1 ， 通过这种方式不仅能进行细胞的s h g 成像，而且s h g 的强度能很好的反映膜电压 的大小3 6 。3 9 1 。应用s h g 技术对活细胞进行成像尤其适用于研究发生在细胞膜的生 理活动，甚至可以用来对病变细胞进行诊断4 2 1 。 1 3 2s h g 成像技术应用于胶原纤维 除了染色细胞膜这种非中心对称结构可以产生s h g ，对于未染色的、排列紧 4 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 密、整齐有序的非中心对称的蛋白质，如胶原、肌肉、微管等生物组织也可以产 生很强的s h g 信号。继f e u n d 等人在非中心对称结构的鼠尾胶原纤维中发现了 s h g 信号，并成功利用该信号获得了s h g 成像后，在多种生物组织中都发现了 s h g ，如角膜【4 3 】、鼠尾肌腱m 1 、牛的i 型a c h i l l e s 腱4 5 1 、人的皮肤【4 6 1 等。研究发 现，胶原体是生物组织所产生的s h g 中最主要的转换源m 7 l 。大多数胶原体，包 括胶原体i 、i i 、i i i 、v 和x i 可以组成胶原纤维。正常人皮肤中8 0 为i 型胶原，其 余大部分为i i i 型胶原，i 型胶原排列有序，纵横交错，构成网状结构的真皮层。i 型胶原纤维通常为柱状结构，因而具有非中心对称性，是生物组织中能够产生 s h g 信号的一种物质【4 8 - - 4 1 。它们广泛分布于骨骼、肌腱、皮肤、角膜、韧带和内 脏器官中。由于s h g 的相干特性，受激产生的s h g 强度与胶原纤维的取向有强烈 玉 的依赖关系，在利用s h g 显微术探测胶原纤维分布时，可以通过分析s h g 强度的 变化规律获取有关胶原纤维取向的信息【5 5 ，5 6 1 。值得注意的是，胶原体不能组 成胶原纤维，因此不具备非中心对称结构，不能产生s h g 信号【5 7 1 。此外，组织 中的另一种结构微管也能产生强s h g 信号，比如细胞分裂过程中的纺锤体【1 4 1 4 本课题研究的目的及意义 随着激光技术的广泛应用，各种以s h g 为核心的生物成像实验层出不穷， 对s h g 的成像理论也引入了很多方法，如使用蒙特卡洛( m o n t ec a r l o ) 模拟 5 8 - 6 2 】， 对生物组织的s h g 三维成像进行模拟分析；利用量子力学方法分析激光与生物 组织的相互作用，考虑激光在生物组织中的传输特性。作为非线性光学中的二阶 效应，在光学器件中得到s h g 信号的理论体系已经较为完善，但结合生物组织 5 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 成像的理论还有待继续探讨。基于大量的实验研究，研究人员发现在非中心对称 的生物组织中激发明显的二次谐波信号，从而达到显微成像的目的。虽然二次谐 波在实验上取得了很大的成果，但是目前为止对二次谐波的成像理论研究还尚未 建立完善，例如对i 型胶原纤维组织的理论研究。 以胶原纤维为样品所激发的s h g 显微成像，无论在实验还是理论上近年来 都激发了广大科研工作者的浓厚兴趣。至今为止，大量的实验工作已经证明了利 用s h g 原理对i 型胶原纤维进行显微成像的可行性、有效性、直观性。但是在 线性偏振聚焦光照射下，i 型胶原纤维激发s h g 的原理还远未达到人们期望的结 果，很多s h g 发射现象还没有得到理论的合理解释。人们也同时关注可以激发 s h g 较高效率的因素，如入射光偏振方向，数值孔径，超极化率比率和胶原倾 斜角等等。 生物组织的s h g 信号强度与组织状态和散射效率有关，即不能单纯的根据 s h g 强度来确定样品结构特点【6 3 1 。i 型胶原纤维可以看成由无数个偶极子( 散射 粒子) 构成的集合，其排列的方向直接影响s h g 的极化方向。这样我们就可以 通过改变入射光的偏振方向来推断胶原纤维的结构信息，如根据偏振测量找出纤 维的方向性；有关s h g 的非线性电极化率信息；通过一定的偏振方向确定二阶 电极化率张量中的各个元素；得到样品中所有胶原纤维的排列情况和分子偶极子 的组织化程度；固定入射光的偏振方向，用偏振片来选择s h g 信号的偏振方向， 找出s h g 最大强度偏转角度等等。目前，线性偏振聚焦光下激发s h g 的理论仅 限于染色细胞膜的均匀分布散射粒子的模型【3 7 6 4 1 。而在胶原模型中，类似这样 的理论也主要集中在准直光作为入射光的情况，聚焦光的情况则很少提及【4 6 5 1 。 以胶原纤维为散射粒子的模型仅仅有讨论聚焦光的偏振方向平行于胶原轴的特 6 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 殊情况，涉及到每个偏振方向影响的一般情况也并未深入讨论 6 6 , 6 7 1 。另外，s h g 作为一种非线性光学现象涉及到相干光子散射问题。因为s h g 的本质即为相干 的，s h g 的发射具有高度方向性的同时很大程度上受到激发源的特性影响，如 空间范围，激发光的偏振方向等等。同时，我们也注意到相对于均匀分布在生物 样品表面的偶极子，胶原纤维具有自身的物理特性。实际上，激发光的相对于胶 原轴的方向是不能决定的，这是因为样品的放置位置不能确定。因此，在理论上 深入研究线性偏振聚焦光下s h g 的发射值得我们继续讨论。 本课题在建立的i 型胶原模型上，结合s h g 技术的成像原理，讨论了入射 光偏振方向、数值孔径、胶原超极化率比率以及胶原倾斜角等影响因素，对激发 s h g 的强度大小，发射方向，分布情况进行理论模拟，为s h g 的实验建立合理矗 ” 的理论支持。 7 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 第二章s h g 原理及条件 2 1 非线性光学的二阶效应 在线性光学范围内，电磁波辐射在介质中传播规律满足线性波动方程。不同 的光波在介质中相遇彼此不产生耦合，它们遵从波的独立传播原理。当不同频率 的几种单色光同时入射到介质时，它们彼此之间不会受到其他频率光波电场的影 响，同时也不可能产生新的频率光波。这是激光问世以前普通光学现象所描述的 规律。但是介质在强激光作用下，入射光频率远离共振区时，电偶极矩( 电极化 强度) 展开为光电场为或的幂级数，考虑到高阶项的作用，其与激发光场强间 的关系可以表示成 2 7 , 6 8 1 ： 口= 风+ a 己+ 五1 卢或+ 夏1y 或+ ( 2 1 ) 其中面。永久偶极矩，a 是一阶极化率( 又叫线性极化率) ，它是二阶张量；卢是 二阶极化率，它是三阶张量；y 是三阶极化率，它是四阶张量。s h g 属于二阶非 线性效应，( 2 1 ) 式中第三项、第四项等高阶项为二阶、三阶等高阶非线性极化 项，非线性光学现象正是与高阶极化有关的现象。其中第三项可以解释一切非线 性二阶现象，代表频率等于入射光频率二倍的电偶极矩，作为二阶非线性光学倍 频效应的根源辐射s h g 、和频和差频等。 s h g 产生过程可以看作是不同频率光子的交换过程。在电偶极子近似下， 非中心对称分子在频率为q 的入射光场作用下，辐射光除有线性的频率成分q 外，还包含了频率为0 和2 的非线性成分，其中2 q - - - - c 0 2 。由于这些偶极矩的存 在，相应地产生了基频极化波和倍频极化波，而又产生相应的基频次波辐射和倍 频次波辐射，这就是倍频光产生的机理。当散射介质中分子群产生的以c o ：为频 8 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 率的非线性散射成分相干，就称为s h g 。用量子力学理论来解释，两个频率为c o 。 的光子在谐波产生过程中湮灭，同时形成一个新的频率为：的光子谐波，产生 过程中没有正式的能级跃迁，发射光子的能量恰好等于吸收光子的能量。 2 2 非中心对称结构 s h g 产生的主要条件是介质的非中心对称性。二阶非线性过程仅发生在非 中心对称的介质。但是，对于具有中心对称性结构的介质，在发生坐标反演变换 时， x ，y ，z ) 专 一x ，- y ，一z ) ，偶极矩( 极化强度) 和电场强度都要变成反方向， 根据公式( 2 1 ) ，一阶和三阶效应表达式不变，但二阶表达式的偶极矩要变号， 按照对称性要求卢必须为零，此时没有二阶非线性效应，所以对于中心对称结构 的介质只有三阶非线性效应。 2 3 相位匹配 相位匹配是能够持续产生s h g 的另一个需要满足的必要条件，传播中的倍 频光和不断产生的倍频极化波之间保持相位一致，相互干涉，这样s h g 输出最 大。相位匹配在经典物理学范畴来解释就是满足能量守恒和动量守恒，二阶非线 性过程中，任何一个物理过程都应该满足此要求，生物组织对作用光束不产生任 何共振作用。也可以利用量子化的观点来简化能量守恒和动量守恒条件。 从能量守恒的观点看，被激发样品不需要吸收能量，并且s h g 光子频率 2 q = 吐，正好是入射光频率的二倍，在此过程的能量守恒要求下式成立： 壳q + 壳q = h c 0 2( 2 2 ) 另一方面，动量守恒要求： 9 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 壳吒+ 壳k o = 壳哎。 ( 2 3 ) 其中丸，k ：分别为入射光子与s h g 光子在介质中的波矢，若要用折射率 来表示则可以写成 乞= 2 l r n o , 丸，如= 2 a n 2 m 如 ( 2 4 ) 其中丸是基频光子在真空中的波长，如是s h g 的波长。刀，刀：分别为 生物组织对入射基频和所产生倍频光波的折射率。由上式可得 = n 2 ( 2 5 ) 此式意味着，为了满足倍频过程产生的动量守恒条件，要求生物组织对入射 基频和产生的倍频具有相同的折射率。 如果满足完全相位匹配条件，传播中的倍频光波和不断产生的倍频极化波间 保持了相位的一致性，相互干涉，产生的二次谐波振幅由零开始，至基波的功率 全转变为二次谐波的功率，最终二次谐波的输出最大。如果相位匹配不满足时， 倍频次波辐射就因为干涉相消而使倍频光为零。 二次谐波的相干性使二次谐波信号的角度分布高度结构化，且与激发光的空 间分布和介质空间结构密切相关【1 2 】。当介质中散射粒子均匀分布，激发光为准 直光束时，二次谐波的分布为前向。实际上，s h g 现象就是将两入射光子转换成 一个出射光子，其频率为二次谐波频率，从而保证了轴向的动量守恒。当两倍入 射光子动量等于二次谐波光子动量时，其方向须与入射光子前进方向一致。但现 在的高分辨率二次谐波显微成像使用的都是聚焦的激光光束，聚焦光束的相位不 再沿着行进轴均匀分布。当光束通过焦点时，存在一个相对准直光束的轴向相位 滞后g o u ys h i f t ，相当于有效轴向动量也相应的减少，入射光子的动量可以写成 纨，毒是一个小于l 的因子。根据必须满足轴向上动量守恒，可推f l s h g 只可能 1 0 线性偏振光激发i 型胶原纤维产生二次谐波的显微成像理论 分成两叶，并沿着偏离轴的一定角度0 + a r c c o s ( 考) 的方向传播。 2 4 二阶非线性极化率 从( 2 1 ) 式还可以看出，介质与激光电场相互作用产生的二次谐波不仅与光 电场强度有关，而且与介质的二阶极化率相联系。二阶极化率越大的介质，越能 有效产生s h g 。在物理学上，极化率表征了介质的微观特性，反映了介质的电 子态、分子的对称性、旋向及排列等，因此可以通过对介质非线性光学现象的探 测来了解介质的微观结构信息。利用k l e i n m a n 对称和圆柱对称假说可以将i 型 胶原纤维二阶极化率张量进行简化。 2 4 1k l e i n m a n 对称 k l e i n m a n 对称假说应用于无损耗介质，当激发光频率远远大于介质的固有频 率时有效【6 9 7 3 1 。我们建立的模型中利用近红外光波进行照射，波长大约在8 0 0 n m ， 其远离胶原纤维的第一电子跃迁层( 3 1 0 n m ) ，符合k l e i n m a n 对称假设的使用条 件删。 s h g 激发偶极矩面：。( x ，y ，z ) ：f i x ，y ，z 三个方向上的分量， 面2 0 7 , i ( x ，y ，z ) = i 1 - 2 ( x ，j ，z ) 乞文 ( 2 6 ) - ，膏 其中下标i 表示三个方向，根据三阶张量的定义，超极化率p 有2 7 项： p wp 研 p 盟 d 够9 斜 p 。p 睨p 埘 p 啊 p 娜9 岍p 瞄p 婀9 哪p 瞄p 嘴9 哪p 孵 q p 蕊 p 啊 p 况 p