（药理学专业论文）人ae2基因的cdna克隆及真核表达载体pcdna31wtae2的构建.pdf

摘要 摘要 目的：利用分子克隆技术克隆人野生型全长a e 2c d n a ，构建出 p c d n a 3 1 w t a e 2 重组表达质粒，进行测序鉴定，并检测该表达质粒对内皮细 胞系h u v e c sa e 2 基因表达的影响，为进一步研究a e 2 在疾病中的生物学功能 提供物质基础。 方法： 1 用d m e m + 1 0 f b s 培养基培养人h e l a 细胞，从h e l a 细胞中提取总 r n a ；自行设计上下游各带有n h ei 和h i n d i i i 限制性酶切位点的p c r 引物，采 用r t - p c r 技术，将总r n a 反转录成c d n a ，再扩增出a e 2 基因全长c d n a 片 段。 2 用限制性核酸内切酶n h ei 和h i n d l l l 分别双酶切p c d n a 3 1 质粒和a e 2 c d n a 片段，电泳分离后回收纯化两端带不同粘性末端的p c d n a 3 1 质粒和a e 2 c d n a 片段；用t 4 d n a 连接酶连接p c d n a 3 1 质粒和a e 2 片段，将连接产物转 化入感受态细胞t o p i o ，在含有终浓度为5 0 m m l a m p 的l b 固体培养基中筛 选培养2 4 h 后，挑取单个阳性菌落扩增，提取并纯化重组体质粒 p c d n a 3 1 - w t - a e 2 。 3 用三种方案的限制性核酸内切酶酶切鉴定所构建重组载体p c d n a 3 1 w t a e 2 ，得出肯定结果后通过d n a 测序进一步鉴定。 4 将绿色荧光蛋白质粒p e g f p n 2 转染h u v e c s ，观察2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 及 7 2 h 绿色荧光的表达量，确定转染效率的时效关系而推测重组质粒 p c d n a 3 1 w t a e 2 的最佳转染时间。 5 将重组质粒p c d n a 3 1 一w t a e 2 转染h u v e c s ，随机分为三个组：正常对 照( c o n t r 0 1 ) 组、转染空质粒p c d n a 3 1 组、转染重组质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 组。通过r t - p c r 和w e s t e r nb l o t t i n g 检测h u v e c s 中a e 2m r n a 和蛋白表达情 况。 结果： 1 r t - p c r 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在预期位置显示了清晰的亮带， 这一结果提示已成功扩增出了特异性的目的基因a e 2c d n a 。 2 将分别双酶切后的p c d n a 3 1 质粒和a e 2c d n a 片段用t 4 d n a 连接酶 进行连接反应后，转化感受态细胞t o p i o ，经a m p 筛选，在培养皿上可见阳性 u 摘要 菌落；挑取单个阳性菌落进行扩增并提取纯化出重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 。 3 分别经限制性核酸内切酶n h ei 单切，n h ei 和h i n d l i i 双切，s a ci 单切 后，酶切图谱结果显示与预期相符；进一步将重组体进行基因测序分析，证实 本实验克隆的人a e 2 基因c d n a 序列与g e n e b a n k n m 布的人 基_ 0 0 3 0 4 0 公 a e 2 因c d n a 序列一致，这一结果表明重组体p c d n a 3 1 一w t - a e 2 中插入的目的基因 a e 2 为正向、单倍插入。 4 将质粒p e g f p n 2 转染h u v e c s 内皮细胞后，在绿色荧光显微镜可见到 绿色荧光，且4 8 h 的转染效率高达4 0 。 5 a e 2m r n a 的表达：a e 2 各组样本均由对应的b a c t i n 条带的扫描值标 化。c o n t r o l 组、转染空质粒p c d n a 3 1 组、转染重组质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 组 a e 2m r n a 表达量分别为0 3 2 0 0 3 ，0 3 4 0 0 3 ，0 9 0 o 1 2 。a e 2m r n a 在j 下常 h u v e c s 中呈基础性表达；转染重组质粒p c d n a 3 1 w t - a e 2 组h u v e c s 较 c o n t r o l 组a e 2m r n a 转录显著上调( p o 0 5 ) 。 6 a e 2 蛋白的表达：a e 2 蛋白各组样本均由对应的1 3 a c t i n 蛋白条带的扫描 值标化。c o n t r o l 组、转染空质粒p c d n a 3 1 组、转染重组质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 组a e 2 蛋白表达量分别为0 2 5 _ + 0 0 4 ，0 2 8 _ + 0 0 4 ，1 8 9 _ + 0 0 5 。a e 2 蛋白在正常 h u v e c s 中呈基础性表达；转染重组质粒p c d n a 3 1 w t - a e 2 组内皮细胞较 c o n t r o l 组a e 2 蛋白表达显著增加( p o 0 5 ) 。 结论： 1 我们成功克隆了人a e 2 基因野生型全长c d n a 序列，并构建 p c d n a 3 1 w t a e 2 重组质粒真核表达载体。 2 重组质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 可明显升高h u v e c sa e 2 基因在m r n a 和 蛋白水平的表达。 关键词a e 2 基因；p c d n a 3 1 质粒：克隆；转染；内皮细胞 i i i a b s t r a c t a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t o c l o n eh u m a nw i l d - - t y p ef u l l - l e n g t ha e 2e d n aa n dc o n s t r u c t p c d n a 3 1e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r t oi d e n t i f y t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d n u c l e i ca c i ds e q u e n c eb ys e q u e n c i n go nt h es t a n d a r ds e q u e n c e r ，a n dt oe v a l u a t et h e p l a s m i di m p a c tt ot h ea e 2g e n ee x p r e s s i o ni nt r a n s f e c t e dh u v e c s c e l ll i n e t h e s e r e s u l t sl a yaf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho nt h ef u n c t i o no fa e 2 m e t h o d s ： 1 h u m a na e 2e d n aw a sa m p l i f i e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( r t - p c r ) f r o mt o t a lr n a i s o l a t e df r o mc u l t u r e dh e l ac e l l sm a i n t a i n e di n d m e m + 1 0 f b s 2 a e 2w a si n s e r t e di n t ot h en h e la n dh i n d i i is i t e so fam a m m a l i a ne x p r e s s i o n p l a s m i dp c d n a 3 1 ，w h i c hc o n t a i n sa m p a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e s ，t o c o n s t r u c t r e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 1 - w t - a e 2 。t h er e c o m b i n a n tp c d n a 3 1 一w t a e 2w a s t r a n s f o r m e di n t oc o m p e t e n tc e l le s c h e r i c h i ac o l it o p l 0f o rp o s i t i v es c r e e n i n ga n d p r o p a g a t i o nf o l l o w e db yp l a s m i dp r e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 3 t h er e c o m b i n a n tp c d n a 3 1 一w t - a e 2p e r f o r m e db yt h ea n a l y s i so fd i f f e r e n t r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n e da u t o m a t es e q u e n c i n g 。 4 t h ec o n f i r m e dr e c o m b i n a n tp e g f p n 2 ，p c d n a 3 1 ，p c d n a 3 1 - w t - a e 2w a s r e s p e c t i v e l yt r a n s f e c t e di n t oh u v e c s c e l ll i n eb yl i p o s o m em e t h o dt oo b s e r v i n gt h e e x p r e s s i o no fg f pu n d e ri m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，a e 2m r n a a sw e l la s p r o t e i nl e v e l sw e r e e x a m i n e db yr t - p c r a n dw e s t e r n b l o t t i n g r e s u l t ： 1 t h ea e 2e d n aw a sp a r t i c u l a r l ya m p l i f i e dw i t hp r i m e r sw ed e s i g n e da s e x p e c t e d 2 t h er e c o m b i n a n to fp c d n a 3 1 一w t a e 2w e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d 3 t h er e c o m b i n a n to fp c d n a 3 1 w t a e 2w a ss t r u c t u r a l l yc o n f i r m e db y a n a l y s i so fr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n g t h ei n s e r t e da e 2 e d n as e g m e n ti nt h ev e c t o rw a ss e n s eo r i e n t a t i o na saw i l dt y p ea e 2g e n ea n di t s s e q u e n c ew a ss t r u c t u r a l l yc o n f i r m e dt ob ec o n s i s t e n tw i t ht h a to ft h ep u b l i s h e dd a t a a b s t r a c t ( g e n b a n kn m _ 0 0 3 0 4 0 ) 4 t h ep e g f p n 2v e c t o rw a st r a n s f e c t e di n t oh u v e c sc e l l sb yl i p o f e c t a m i n e w ec o u l df i n dt h eg r e e nf l u o r e s c e n ti nh u v e c sc e l l su n d e rt h ef u o r e s c e n t m i c r o s c o p e 5 t h er e s u l t so fr t - p c ri n d i c a t e dt h a tp c d n a 3 1 - w t - a e 2c o u l dr e m a r k a b l y i n c r e a s et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fa e 2g e n em r n ai nt r a n s f e c t e dh u v e c sc e l l s ( p 共3 5 循环 l 引煳循环 9 第2 章材料与方法 d p c r 扩增产物琼脂糖凝胶电泳 用l x t a e 电泳缓冲液( t r i s4 8 4 9 ，e d t a 2 2 2 9 9 ，冰乙酸，p h 8 0 ) 制备1 o 琼脂糖凝胶( 含溴化乙锭5 z g m 1 ) 。每孔2 0 # 1 p c r 扩增产物电泳，以d n am a r k e r d l l k b 作为分子量参照，在紫外透射分析仪下观察结果。 e p c r 扩增产物a e 2 全长c d n a 片段的回收纯化 按w i z a r ds vg e la n dp c rc l e a n u ps y s t e mk i t 操作说明书进行： 称重一灭菌1 5 m l e p 管 在紫外光下，用干净超薄刀片迅速从琼脂糖凝胶中切割p c r 扩增的目的 片段，置无菌的已称重的1 5 m l e p 管内，再称重，计算凝胶重量 按l m g 凝胶1 t l 膜结合液比例加入膜结合液 6 0 c 水浴箱温育1 0 m i n ，直到凝胶完全溶解，每2 m i n 颠倒混匀一次 转移溶解液至c o l u m n 装置( 将s vm i c r o c o l u m n 插入c o l l e c t i o nt u b e 成为 c o l u m n 装置) ，每次最多转移7 0 0 p l ，室温1 r a i n 离心1 0 0 0 0 9 x l m i n ，弃离心液 加7 0 吮l 膜洗涤液，室温置l m i n ，离心1 0 0 0 0 9 x l m i n ，弃离心液 加5 0 0 d 膜洗涤液，离心1 0 0 0 0 9 x l m i n ，弃离心液，再离心一次 将m i c r o c o l u m n 转移至一干净灭菌的1 5 m l e p 管 加约5 0 # ln u c l e a s e f r e ew a t e r 至m i c r o c o l u m n ，室温置2 m i n ，离心 1 0 0 0 0 9 x 5 m i n ，将1 5 m l e p 管中回收的d n a 贮存于- - 2 0 。 f 纯化的a e 2c d n a 片段的浓度测定 取跏l 已纯化的a e 2c d n a 片段用n u c l e a s e f r e ew a t e r 稀释至l m l ，在紫 外分光光度计上读o d 6 0 0 值，计算a e 2c d n a 片段的浓度。 2 2 3 质粒p c d n a 3 1 的准备 2 2 3 1 质粒p c d n a 3 1 图谱 p c d n a 3 1 质粒从i n v t r i o g e n 公司购买。该质粒全长5 4 2 7 b p ，在8 9 4 b p 到 1 0 0 6 b p 为多克隆位点，其中8 9 4 b p 和9 9 5 b p 位置分别是限制性核酸内切酶n h e i 和h i n d l i i 的酶切位点，质粒2 1 3 6 b p 至2 9 3 0 b p 和4 4 3 2 b p 至5 4 2 8 b p 是分别a m p 和n e o 耐药基因。( f i 9 1 ) 1 0 第2 章材料与方法 ( 一) f i gl ：p c d n a 3 1v e c t o rm a p 2 2 3 2 质粒p c d n a 3 1 的提取纯化 按w i z a r d t mp u r e f e c t i o np l a s m i dd n ap u r i f i c a t i o ns y s t e m 说明书进行： 挑取少量质粒p c d n a 3 1 菌液加入2 5 m l 含a m p ( 5 0 1 s g m 1 ) 的l b 液体 培养基，置3 7 摇床( 2 5 0 r p m ) 孵育1 2 1 6 h 后，取出2 5 离心1 0 0 0 0 9 1 0 m i n ， 弃上清，倒置于滤纸上吸干残液。 加2 5 0 t d 细胞重悬液，涡旋后转移至一无菌l o m l 聚苯乙烯试管。 加2 5 0 肛1 细胞裂解液，轻柔颠倒试管充分混匀。 加1 0 山碱性裂解液，室温静置5 r a i n 。 加3 5 0 i t l 中和溶液，轻柔颠倒试管混匀，2 5 c 离心1 6 0 0 0 9 x l o m i n 。 转移上清液至吸附柱内，室温静置l m i n ，离心1 6 0 0 0 9 x l m i n 。 去除e p 管内液体，加7 5 0 i - t l 洗液至吸附柱，离心1 6 0 0 0 9 x l m i n 。 去除e p 管内液体，加2 5 0 t l 洗液至吸附柱，离心1 6 0 0 0 9 x 2 m i n 。 将吸附柱转移至新的e p 管，加1 0 0 1 d 无核酶水，静置l m i n ，离心1 6 0 0 0 9 第2 章材料与方法 x l m i n 。收集e p 管内液体。 2 2 4 基因重组技术 2 2 4 1 基因重组简易流程( f i 9 2 ) 5 上3 ， 3 ：i 5 m i n d i 工ii 3 7 k b 。 克隆出f f j k e 2 篁i 黄i d x a 片段 上下游各带酶切位点 i 双酶切 5 3 双酶切后的a x 2 基因d x k 3 5 5 3 n h e ，1 n d 。1 j 质饪双酶切 连接反应 双酶切后的质i i d k a n e o 重组质粒p c d n a 3 卜w t a e 2 插入的k e 2 眦 3 5 f i 9 2 g e n er e c o m b i n a t i o nf l o w s h e e t 2 2 4 2 限制性内切酶双酶切质粒p c d n a 3 1 和a e 2c d n a a n h ei 和h i n d h l 分别双酶切p c d n a 3 1 和a e 2c d n a 为了达到更理想的酶切效率，我们的双酶切方案为，先用n - h e1 分别单酶切 1 2 第2 章材料与方法 质粒p c d n a 3 1 和p c r 产物a e 2c d n a ，经琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段， 再用h i n d l l l 分别单酶切回收后的片段，接着再进行一次琼脂糖凝胶电泳，分别 回收两次酶切后的带两个不同粘性术端的p c d n a 3 1 和a e 2c d n a 片段。 单酶切反应体系： 取一灭菌0 5 m l e p 管依次加入 1 0 x b u f f e r ( h 或l )驰l d n a ( p c d n a 3 1 或a e 2c d n a 片段)= l t g n h e i 1 d n u c l e a s e f r e ew a t e r 补至2 0 1 l 3 7 水浴2 - 4 h b 双酶切质粒p c d n a 3 1 和a e 2c d n a 片段的回收纯化( 操作同前) c 酶切纯化后的质粒p c d n a 3 1 和a e 2c d n a 片段的浓度测定( 操作同前) 2 2 4 3 质粒p c d n a 3 1 和a e 2c d n a 片段的连接反应 采用p r o m e g a 公司的t 4d n a 连接酶将分别双酶切后的质粒p c d n a 3 1 和 a e 2c d n a 的连接。取原装t 4l i g a s e ( 3 u t i ) 靴l 加舡l 无核酶水稀释为浓度 1 u 似l 。分别以v e c t o r ：i n s e r t ( 总分子量) = 1 ：3 ，1 ：6 或1 ：1 的比例进行连接反应。 反应体系如下( t a b l e2 ) t a b l e2c o u p l e dr e a c t i o ns y s t e m 各反应管置46 c1 0 1 6 h 2 2 4 4 连接产物转化感受态细胞t o p l 0 1 0 0 a 冻存的感受态细胞与l o z 1 连接产物混匀，置冰上3 0 m i n ( 所用无菌e p 管需预冷) e p 管从冰上取出立刻置4 2 。c 水浴6 0 s e c ( 不摇动) 1 3 第2 章材料与方法 e p 管从水浴箱中取出，立即置冰上9 0 s e e 加入5 0 0 , u l l b 液体培养基 3 7 轻柔振摇4 5 m i n ( 可置摇床1 0 0 9 m i n ，4 5 m i n ) 将4 0 0 t l l b 液体培养基充分混匀后涂布于含5 0 m g 1 0 0 m l a m p 的l b 固体培养 基上，3 7 过夜培养。 2 2 4 5 重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 的提取纯化 挑取l b 固体培养基上的单个阳性菌落，放入装有2 5 m l 含终浓度为 5 0 m g 1 0 0 m ga m p 的l b 液体培养基的锥形瓶中，置3 7 4 c 恒温摇床 2 5 0 9 m i n ，1 2 1 6 h 后，根据p r o m e g a 公司w i z a r d t mp u r e f e c t i o np l a s m i dd n a p u r i f i c a t i o ns y s t e m 质粒提取试剂盒说明书提取重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 ( 操作同前) 。 2 2 4 6 重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 的鉴定 a 重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 的酶切鉴定 采用三种限制性内切酶n h ei 、h i n d i i i 和s a ci 酶切鉴定重组体质粒 p c d n a 3 1 w t a e 2 ，分别进行n h ei 单切，n h ei 和h i n d i i i 双切，以及s a ci 单 切。n h ei 和h i n d i i i 是我们重组a e 2 c d n a 和质粒p c d n a 3 1 所选用的酶，在 整个重组体质粒上各有一个酶切位点，s a ci 则在重组质粒的a e 2c d n a 段和 p c d n a 3 1 段分别有1 个酶切位点。 三种酶切反应体系如下( t a b l e3 ) ： t a b l e3 ：e n z y m er e a c t i o ns y s t e m 3 70 c 水浴4 h 后1 的琼脂糖凝胶电泳观察结果 1 4 第2 章材料与方法 b 重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 的测序鉴定 取l m l 重组体质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 菌液送上海英俊有限公司测序鉴定， 所用引物为p c d n a 3 1 通用引物。 2 2 5 绿色荧光蛋白质粒p e g f p - n 2 转染h u v e c s 按常规细胞培养方法培养h u v e c s 。按照i n v i t r o g e n 公司l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 t m 脂质体转染说明书进行重组质粒的转染。 脂质体转染前2 4 h ，胰酶消化收集细胞，以8 x 1 0 5 孔的密度将细胞转种到 六孔板中。加入3 m l1 0 f b sd m e m 培养基，5 c 0 2 ，3 7 。c 恒温培养箱孵育 2 0 2 4 h 。( 转染前细胞应铺满5 0 8 0 ) 分组：1 为空白，2 、3 、4 、5 组为转染质粒p e g f p n 2 。每组均设2 个复孔。 分别用1 0 0 9 l 无血清d m e m 培养基在e p 管中稀释0 8 1 鲰g 绿色荧光 蛋白质粒p e g f p n 2 ，轻微混匀。在另一个e p 管中用无血清培养基将5 “l 脂 溶液稀释至1 0 叽l ，轻微混匀，室温下孵育1 0 m i n 。 将脂溶液加入含质粒的e p 管中，吸管吹打混匀，室温下孵育1 5 4 5 m i n 。 孵育d n a 脂溶液的同时，用无血清培养基，将要转染的细胞洗涤三次， 然后于每孔中加入0 8 m l 无血清培养基，置5 c 0 2 ，3 7 恒温培养箱。 d n a 脂溶液孵育1 5 4 5 m i n 后，加入6 0 0 , d 无血清培养基，吸管吹打混 匀，室温下孵育1 0 m i n 。 转移各管d n a 脂溶液至六孔板中，各孔加入有血清生长培养基i m l ，置 5 c 0 2 ，3 7 恒温培养箱孵育5 2 4 h 。 取出六孔板，用无血清培养基洗涤3 次，加入含血清生长培养基1 6 m l ， 置5 c 0 2 ，3 7 恒温培养箱。 分别在2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、7 2 h 后取出六孔板，在荧光显微镜下观察绿色 荧光。 2 2 6 重组体质粒p c d n a 3 1 w t - a e 2 转染h u v e c s 按常规细胞培养方法培养h u v e c s 。按照i n v i t r o g e n 公司l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 t m 脂质体转染说明书进行重组质粒的转染。( 操作同前) 1 5 第2 章材料与方法 分组：1 为空白，2 为转染空质粒p c d n a 3 1 ，3 为转染重组质粒 p c d n a 3 1 w t a e 2 ，。每组均设5 个复孔，2 个用于检测m r n a ，3 个用于检测 蛋白。 4 8 h 后取出六孔板，分别提取r n a ( 操作同上) 和蛋白( 操作如下) 进行 r t - p c r ( 操作同上) 和w e s t e r nb l o t t i n g ( 操作如下) 检测a e 2 的表达情况。 2 2 7p c r 法检测h u v e c sa e 2 m r n a 的表达 ( 操作同前) 2 2 8 w e s t e r nb l o t t i n g 法检测h u v e c sa e 2 蛋白的表达 ( ) h u v e c s 裂解 ( 1 ) 用预冷的p b s 洗细胞3 遍。 ( 2 ) 加预冷的l y s i n gb u f f e r ，6 孔板：8 0 d w e l l ； 6 0m m 培养皿：3 0 0 a d i s k ， 4 孵育2 0 m i n 。 ( 3 ) 用细胞刮棒把细胞碎片连同l y s i n gb u f f e r 集中于一侧，4 孵育4 0r a i n 并 转移至预冷的e p p e n d o r f 管中。离心( 1 2 0 0 0g ，4 0 c ) 5m i n 。 ( 4 ) 将上清移入另一e p p e n d o r f 管中，除部分用来测蛋白浓度外，其余直接用 于实验或一7 0 。c 冷冻备用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e t r o p h o r e s i s ，s d s - p a g e ) ( 1 ) 制备8 分离胶：1 5m m i r i s h c i ( p h8 8 ) 1 3m l ，d d d h 2 02 3m l ，3 0 聚 丙烯酰胺1 3m l ，1 0 s d s5 毗l ，1 0 过硫酸胺5 毗l ，t e m e d 舡l ( 加入后混 匀，快速制胶) 。3m l 上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，随即以少量三蒸 水封胶面，室温聚合3 0m i n ，吸去上层三蒸水。 ( 2 ) 制备5 积层胶：1m m i r i s h c i ( p h6 8 ) 0 2 5m l ，d d h 2 01 4m l ，3 0 聚 丙烯酰胺0 3 3m l ，1 0 s d s2 0 # l ，1 0 过硫酸胺2 0 z l ，t e m e d 印l ( 加入后 混匀，快速制胶) 。1 4m l 上述混合液快速注入两层玻璃板间隙，迅速插入梳子， 聚合完全后小心取出梳子。 ( 3 ) 电泳：取含同等蛋白量的样本稀释至等体积，和5 x s a m p l eb u f f e r 按4 ：1 体积 混匀，1 0 0 c 水浴5 m i n ，趁热加样，每孔道3 吮l ，加样后凝胶放置于装有电泳缓 冲液的电泳槽进行电泳。电泳条件：积层胶内9 5v 1 5m i n ，分离胶内1 6 5v 1 6 第2 章材料与方法 5 0m i n ，待样品中的溴酚蓝迁移至胶的前沿时，结束电泳。 电转移 s d s p a g e 后，将聚丙烯酰胺胶卸下，取与凝胶相同大小的6 张滤纸和一张硝酸 纤维膜( n c ) ，在半干转移缓冲液中平衡1 5r a i n ，依次从下到上放好3 张滤纸、 凝胶、n c 膜、另3 张滤纸，然后夹于半干转膜装置中，膜朝正极，胶向负极， 根据膜面积大小，以1 2 5 枞m ? 的恒流，转膜1 8 0r a i n 。 检测n c 膜上的蛋白质 a 、将膜浸在丽春红染色液中染色，约3m i l l 可见红色蛋白质色带出现。 b 、将膜浸在蒸馏水中脱色，轻轻摇动数m i t t ，然后更换脱色液数次，直至 背景色很淡。 免疫学检测 ( 1 ) 封闭：转膜后，将硝纤膜置t t b s 中，缓摇1 0r a i n ，然后膜于封闭液中3 7 c 摇床缓慢平摇2h 。 ( 2 ) 结合一抗：封闭后将硝纤膜移入一抗反应液( 一抗按1 ：1 0 0 溶于封闭液) ， 4 1 2 过夜或室温平摇3h 。回收一抗，硝纤膜浸入t t b s2 0m l 中，急摇1 0m i l l ， 连续3 次，清洗膜上残余一抗。 ( 3 ) 结合二抗：将硝纤膜移入兔抗山羊i g g - h r p 二抗反应液( - - 抗按1 ：1 0 0 0 溶于封闭液) 中，室温平摇2h 后，硝纤膜浸入t t b s3 0m l 中，急摇1 5r a i n ， 连续3 次，清洗膜上残余二抗。 ( 4 ) 免疫复合物的检测：膜在e c l 中反应lm i n 后，用保鲜膜包裹，置于x 线 暗盒，暗室中剪大小合适x 线胶片，曝光3 0s ，显影、定影，直至做出满意结 果，每组样品进行三次电泳，用于重复验证结果。 质控 在同一凝胶上，取一蛋白电泳道作阴性对照，除不加一抗外，其余步骤同 前；根据蛋白分子量大小，对照蛋白标准，在3 0 k d 左右处对比阴性对照电泳条 带和测定电泳条带，识别特异性蛋白条带。 半定量分析 将x 光胶片扫描后，在医学图形分析系统上进行分析。将所得a e 2 蛋白带 的综合密度分别除以c o n t r o l 组相对应样本的综合密度。 1 7 第3 章结果 第三章结果 3 1r t p c r 扩增人a e 2c d n a 从h e l a 细胞提取的总r n a 经r t - p c r 后，扩增产物在l 的琼脂糖凝胶电 泳显示出一条约3 7 0 0 b p 的亮带，符合预期结果，提示我们已成功扩增出a e 2 e d n a 片段( f i g3 ) 。根据u v - 7 5 4 c 紫外分光光度计所测o d 2 6 0 数值，计算出纯 化后的a e 2e d n a 浓度为3 0 p g 5 0 i d 。 f i g3a g r 0 g e le l e c t r o p h o r e s i so fa e 2e d n af r a g m e n t 3 2 质粒p c d n a 3 1 的提取纯化 根据u v - 7 5 4 c 紫外分光光度计所测o d 2 6 0 数值，计算出纯化后的质粒 p c d n a 3 1 浓度为4 0 p g 5 0 m 。 3 3 双酶切后质粒p c d n a 3 1 和a e 2c d n a 片段的纯化 根据u v - 7 5 4 c 紫外分光光度计所测o d 2 6 0 数值，计算出双酶切后的质粒 p c d n a 3 1 和a e 2e d n a 浓度分别为2 5 0 熠m l 和0 7 p g 5 0 p j 。 3 4 重组质粒p o d n a 3 1 咄- a e 2 的酶切鉴定 我们选用的p c d n a 3 1 质粒长度为5 4 2 7 b p ，a e 2e d n a 的p c r 扩增产物约 为3 7 2 6 b p ，因此重组质粒经n h ei 单酶切后电泳应在约9 1 4 8 b p 位置有条带，经 n - h ei 和h i n d l l i s d 酶切后电泳应在5 4 2 7 b p 位置和约3 7 2 6 b p 位置各有一条带。此 外，限制性核酸内切酶s a ci 在p c d n a 3 1 纯质粒的8 1 9 b p 位置和a e 2 的1 1 2 8 b p 1 8 第3 章结果 位置各有一酶切位点，同时我们的a e 2 是在p c d n a 3 1 质粒的8 9 4 b p 和9 9 5 b p 之间以正义方向插入，所以重组质粒经s a ci 单酶切后电泳应包括1 2 0 3 b p 和 7 9 4 5 b p 的位置的两条带。结果完全符合预期( f i g4 ) 。 f i g4a g r o s eg e le l e e t r o p h o r e s i so fp r o d u c t so fi d e n t i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n tb yr e s t r i c t i o ne n z y m e s 1 ：r e c o m b i n a n tp e d n a 3 1 - w t - a e 2n h ei 和h i n d i l l ；2 ：r e c o m b i n a n tp c d n a 3 1 - w t - a e 2 d i g e s t e dw i t hs a ci 3 ：r e c o m b i n a n tp c d n a 3 1 - w t - a e 2d i g e s t e dw i t hn h ei 3 5重组质粒p c d n a 3 卜n 啦2 的测序鉴定 我们所构建的重组质粒p c d n a 3 1 - w t a e 2 经酶切初步鉴定后，送上海生物 工程有限公司做进一步的测序鉴定，以p c d n a 3 1 质粒通用引物为测序引物，共 测3 7 2 6 个碱基，经比对后证实与g e n b a n k 上公布的基本一致( f i g5 ) 。 3 6 重组质粒o c d n a 3 1 咄一a e 2 在h u v e o s 细胞中表达 3 6 1 转染质粒p e g f p - 观察绿色荧光 p e g f p - n 2 载体在其多克隆位点后带有绿色荧光蛋白基因。通过脂质体转染 方式将p e g f p - n 2 质粒转染入h u v e c s 细胞后，在荧光显微镜下观察到了带绿 色荧光的细胞，在4 8 h 的绿色荧光细胞含量最多。由此我们推断将重组质粒 p c d n a 3 1 w t a e 2 转染到h u v e c s 细胞，在4 8 h 转染效率应该最高。 1 9 第3 章结果 j j j ：= i ：嚣一一一i j j 五j i ；? ，“ 地础舭懒 出a 。1 n 撒勰 f i g5p a r to fr e c o m b i n a n tp c d n a 3 1 - w t - a e 2s e q u e n c i n g a t l a s f i g6 f l u o r e s c e n c ep h o t o m i c r o g r a p ho fh u v c e st r a n s f e c t e dp e g f p - n 2a f t e r4 8 h ( f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e x 2 0 0 ) 2 0 一-= i | ，j稚iiii，二ii 一汛一 i 强”h ii，ijji v i w 111 j二i_=7 -ii二i 1ii ， f 一”_=“i川1i f ijiiwuil_ihi 燃蚴 抛一 盥蹴虹强嘁 m心脚j 舳渺止协l 0 m挑她i 挑忆帅h ，一 i 舭嗡 。“。艄如盹 第3 章结果 一一 3 6 2 转染重组质粒p c d n a 3 1 n a e 2 上调h u 、e c sa e 2m r n a 的表达 a e 2 各组样本均由对应的p - a c t i n 条带的扫描值标化。a e 2m r n a 在正常 h u v e c s 中呈基础性表达；c o n t r o l 组、转染空质粒p c d n a 3 1 组、转染重组质 粒p c d n a 3 1 w t a e 2 组a e 2 m r n a 表达量分别为0 4 2 士0 0 3 ， 0 4 4 士0 0 3 0 9 0 士o 1 2 。转染重组质粒p c d n a 3 1 - w t - a e 2 组h u v e c s 较c o n t r o l 组a e 2m r n a 转录显著上调( 尸 o 0 5 ，f i g7 ) 。 j j7 0 0 b p 、- a ： l 6 0 0 b p 一一膏 4 0 0 b p 、i 3 0 0 b - ， 1 2 l 喜0 8 乓0 6 c 、j 葛0 4 0 2 0 - p a c t i m 0 2 1 b p a e 2 卜一3 4 i b p f i g7t h ee f f e c to f p c d n a 3 1 w t a e 2o nm r n a l e v e l so f a e 2i nh u v e c s ( n 2 8 ，x + s d ) as h o w sr e p r e s e n t a t i v ee l e c t r o p h o r e t i cd i a g r a mo fb ya g a r o s cg e l sf o ra e 2m r n a bs h o w sd e n s i t o m e t r i cf o l do fc o n t r 0 1 a p o 0 5v sc o n t r o lg r o u p ；砷0 1 粥c o n t r o l g r o u p 2 1 第3 章结果 3 6 3 转染重组质粒p c d n a 3 1 咄一a e 2 上调h u v e c aa e 2 蛋白的表达 a e 2 蛋白各组样本均由对应的i b - a c d n 蛋白条带的扫描值标化。a e 2 蛋白在 正常h u v e c s 中呈基础性表达；c o n t r o l 组、转染空质粒p c d n a 3 1 组、转染重 组质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 组a e 2 蛋白表达量分别为0 2 8 - 4 - 0 0 4 、0 2 6 - 土：0 0 4 、 1 8 9 士0 0 5 。转染重组质粒p c d n a 3 1 w t a e 2 组h u v e c s 较c o n t r o l 组a e 2 蛋白 表达显著增加( 尸 o 0 5