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文档简介
利用16SrDNA鉴定细菌的种属,1,1.什么是16SrDNA?,16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基,16SrDNA就是编码该亚基的基因。原核生物的rRNA含有3种类型:23S、16S、5SrRNA,它们分别含有2900、1540和120个核苷酸。2.用16SrDNA进行细菌鉴定的原因16SrDNA在原核生物中普遍存在。16SrDNA的相对分子量大小适中,约1500bp,便于序列分析。在16SrRNA分子中,既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。bp=basepair,2,图16SrDNA基因组成(灰色为保守区,绿色为可变区),16SrDNA基因全长1542bp,由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反映了生物物种间的亲缘关系,而可变区则表明物种间的差异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。,3,4,DNA的提取,挑取单菌落,然后置于装有100LPrepManUltra的离心管中,涡旋震荡混匀30s左右,然后100水浴10min后,以离心机最大转速离心3min,取10L上清液与490LddH2O(即稀释50倍),混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于-20保存。检测:核酸蛋白仪/琼脂糖凝胶电泳,5,1525R5AAGGAGGTGWTCCARCC3,6,PCR反应条件,试剂使用量(20L体系)模板DNA(10ng100ng)2LTaq酶(5U/L)0.2L10TaqBuffer(Mg2+)2LdNTPs(2.5mM)1L引物F(10M)0.5L引物R(10M)0.5LddH2O13.8L,1min30s,7,判断16SrDNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500bp附近出现条带,说明16srDNA已经扩增成功。,8,9,/,10,11,12,13,14,15,16
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