（水产养殖专业论文）裸体方格星虫sipunculus+nudus+linnaeus胚胎发育及原始生殖细胞发生和迁移的研究.pdf

裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) 胚胎发育及原始生殖细胞的发生和迁移的研究摘要裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) 隶属于星虫动物门方格星虫属( s i p u n c u l u s ) ，作为我国常见的经济价值较大的星虫之一，人工育苗工作一直未有较大突破，为了保护和更好的利用这种资源以及解决其是否有固定生殖腺的学术争议，本文对其胚胎发育和原始生殖细胞( p g c s ) 的发生和迁移在显微水平上进行了研究。通过人工受精获得裸体方格星虫的受精卵。详细观察其胚胎发育的过程，根据外部形态以及胚胎发育的特点，将其胚胎发育划分为8 个主要时期：受精卵、卵裂及囊胚期、原肠胚期、单轮幼虫、前期海球幼体、后期海球幼体、幼虫和稚虫。在水温2 4 2 8 的条件下从受精卵到孵化出膜历时2 d ，一个月后长成稚虫。裸体方格星虫的身体结构较为简单，主要包括体壁、头、肾管、收吻肌、消化系统和神经系统。体壁是裸体方格星虫身体最主要的组成部分，来自外胚层体细胞板的发育，同样来自外胚层体细胞板的还有腹部神经索，但腹部神经索的发育要晚的多。裸体方格星虫的卵膜不参与表皮的形成，而是在发育成海球幼体时脱落。在卵膜脱落之前，来自外胚层的脑和来自中胚层的收吻肌、口、食道以及来自内胚层的消化系统已经基本形成。前期和后期海球幼体是这些器官发育的最主要阶段，随着消化肠和肛门的形成幼体的消化系统逐渐完善，而脑神经节和环食道神经网也在这时候由脑板细胞发育出来。到幼虫时期的身体结构与成虫已基本无异，只是体壁较薄胃还没有消失。裸体方格星虫p g c s 起源于中胚层。最初观察到的是2 同龄刚孵化出膜的海球幼体时期，位于食道末端，明显大于周围的其他细胞，细胞直径随着生长和迁移会有所减小，大约在1 2 2 0 1 t m 范围内( 发生变形的除外) 。h e 染色后着色较淡，细胞质呈弱嗜酸性，细胞核圆形或卵圆形，但也不尽相同，核膜明显，核内有突出的核仁，一般1 2 个。a l p 染色呈阳性。在海球幼体时期p g c s 由腹膜包裹呈泡状位于食道两边，随着消化肠的生长和食道的相对缩短，p g c s 顺着食道被动迁移到达头部。在后期海球幼体时期，这两团p g c s 到达头部口下，与腹部收吻肌以及腹部神经索相邻。胚胎发育1 5 天后到达幼虫，这个时候的p g c s 位于收吻肌体壁端下面，这里p g c s a l p 染色弱阳性，但数量大幅增加，并逐渐分化成成体裸体方格星虫的生殖腺。裸体方格星虫的卵巢位于两条腹部收吻肌基部，肉眼和解剖镜下难以看到。组织切片显示，腹膜覆盖在生殖腺上，中央有一段连续的结缔组织作为中问线条，中央线的一端悬挂在收吻肌的底部或者悬挂在与收吻肌相连的内侧体壁上，这一端为近端，对向一端为远端。卵巢顺着体壁和收吻肌之间的空l 、日】从近端向远端发育，形成一条窄的带状组织。这个带状组织由一些大小约0 1 n o 5 m m 指状突起构成，这些指状突起会在非繁殖季节增厚加长，而在繁殖季节里，这些突起消失或者明显减小，这时候的卵巢形似一串葡萄。卵巢中的第一次减数分裂期的卵原细胞和双线期卵母细胞由近端到远端连续分布，细胞的核呈现一系列连续的变化，发育到远端的双线期卵母细胞即从卵巢边界脱落进入体腔中进行卵黄生成和生长。关键词：裸体方格星虫，胚胎发育，器官发生，原始生殖细胞，l it h es t u d yo ft h ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n to fs i p u n c u l u ：n u d u sl i na n d t sp g c s o r i g ndbiounculusn n t l n si n n a e u sa n di t spr i e i na n d，m i g r a t i o na b s t r a c ts i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u sw i t h i ns i p u n c u l a ，s i p u n c u l u sn u d u sf a m i l yi sak i n do fn o r m a le c o n o m i c a ls i p u n c u l ai no u rc o u n t r y b u tt h ea r t i f i c i a lb r e e d i n gt e c h n i q u e sh a sn o tm a d eab r e a k t h r o u g h i nt h i sp a p e r , t h ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n to fs i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u sa n di t sp g c s o r i g i na n dm i g r a t i o nw e r es t u d i e da tm i c r o s c o p i cl e v e l s ，i no r d e rt op r o t e c ta n du t i l i z et h i sr e s o u r c e sa n dr e s o l v et h ed i s p u t eo fw h e t h e ri th a sf i x e dg o n a do rn o t t h ef e r t i l i z e de g g so fs i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u sw e r eo b t m n e db ya r t i f i c i a li n s e m i n a t i o n b a s e do nt h em o r p h o l o g i c a lf e a t u r e sa n dd e v e l o p m e n t a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ee m b r y o ，t h ep r o c e s so fe m b r y o n i cd e v e l o p m e n tc o u l db ed i v i d e di n t o8e m b r y o n i cp e r i o d s ：f e r t i l i z e de g g ，c l e a v a g ea n db l a s t u l a , g a s t r u l a t e ，t r o c h o s p h e r e ，e a r l i e rp e l a g o s p h e r a , l a t e rp e l a g o s p h e r a ，ju v e n i l en a i a da n dn a i a d b e t w e e nt h ew a t e rt e m p e r a t u r eo f2 5 2 8 。c ，t h et i m eo ft h ef e r t i l i z e de g gd e v e l o p p e dt op e l a g o s p h e r aw a s4 h o u ra n dt on a i a dw a sam o n t h t h es t r u c t u r eo fs i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u si sv e r ys i m p l e ，i n c l u d i n gb o d yw a l l ，h e a d ，n e p h r i d i u m s ，r e t r a c t o rm u s c l e s ，d i g e s t i v ea n dn e r v o u ss y s t e m b o d yw a l lw a st h em a i np a r to fb o d y , i td e v e l o p p e df r o mt h ee c t o d e r mb o d y - p l a t e ，s ow a st h ev e n t r a ln e r v o u sc o r d ，b u tt h ed e v e l o p m e n to fv e n t r a ln e r v o u sc o r di sm u c hl a t e rt h a nb o d yw a l l t h ee n v e l o pw i l ld r o po f fa n di th a sn or e l a t i o nt of o r mt h ec u t i c l e b r a i ni sd e v e l o p p e df r o me c t o d e r m ，a n df o r m e db e f o r ee n v e l o pd r o po f f , n o to n l yd i g e s t i v es y s t e mw h i c hd e v e l o p p e df r o me n d o d e r m ，b u ta l s or e t r a c t o rm u s c l e s ，m o u t ha n de s o p h a g u sw h i c hd e v e l o p p e df r o mm e s o d e r m t h es t a g e so fe a r l i e ra n dl a t e rp e l a g o s p h e r aa r em a i nd e v e l o p m e n tp e r i o d so ft h e s eo r g a n s d i g e s t i v es y s t e mg r a d u a l l yc o m p l e t ea f t e ri n t e s t i n ea n da n u sf o r m e d c e r e b r a lg a n g l i o na n dc i r c u m e s o p h a g e a lc o n n e c t i v e sa r ef o r m e da tt h i st i m e t h es t r u c t u r eo fe a r l i e rn a i a di st h es a n l ea sa d u l te x c e p tt h i nb o d yw a l la n ds u r v i v i n gs t o m a c h t h ep g c so fs i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u so r i g i n e df r o mm e s o d e r m t h ef i r s tt i m ei l iw ec a no b s e r v e do fp g c sw a si t se n v e l o pd r o po f fam o m e n ta g o i t sd i a m e t e ri sa b o u t12 2 0 i - t ma n dw i l lr e d u c ea sg r o w i n go fl a r v a i nc o m p a r i s o nw i t hs o m a t i cc e l l s ，p g c sw e r el a r g e rt h a ns u r r o u n d i n gc e l l s t h en u c l e u sw h i c hc o n t a i n e do n eo rt w op r o m i n e n tn u c l e o l ih a dad i s t i n c tn u c l e a rm e m b r a n e t h ec y t o p l a s mo fp g c sw a sw e a k a c i d o p h i l i c t h es h a p eo fn u c l e o l ii sr o u n da n dw i l lc h a n g ei nd i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e t h e ya p p e a r e dp o s i t i v er e a c t i v i t yt oa l ps t a i n p g c se n c l o s e db yp e n t o n e u ma n dm i g r a t et oh e a dp a s s i v e l yf r o mb o t hs i d eo fe s o p h a g u sa st h ei n t e s t i n ee l o n g a t e da n de s o p h a g u sd e c u r t a t e d p g c sm i g r a t et ob e n e a t ho fm o u t h ，n e x tt ot h ev e n t r a lr e t r a c t o rm u s c l ea n dv e n t r a ln e r v ec o r dd u r i n gt h el a t e rp e l a g o s p h e r as t a g e t h el a r v ad e v e l o p p e dt oe a r l i e rn a i a da f t e r15 d a y a tt h i ss t a g e ，p g c sw h i c hl o c a t e da tb a s eo fv e n t r a lr e t r a c t o r o rm u s c l ea p p e a r e dw e e kp o s i t i v er e a c t i v i t yw h e ne x a m i n e dw i t ha l p , i t sn u m b e ri n c r e a s e da n dd if f e r e n t i a t et og o n a dg r a d u a l l y t h eg o n a do fs i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u si sl o c a t e da tt h eb a s e o fv e n t r a lr e t r a c t o rm u s c l e i tc a n tb es e e nb ye y e so rd i s s e c t i n gm i c r o s c o p e s e c t i o n e ds a m p l e ss h o w e dt h a tt h eg o n a da n dt h ec o n n e c t i v et i s s u es h e a t ho ft h em u s c l ep r o t r a c t e dd o w nm t ot h eg o n a da sac e n t r a lc o r e i ts u s p e n d e da l o n gi t sw i d t hb yc e n t r a lc o r ea t t a c ht ot h eb a s eo ft h er e t r a c t o rm u s c l e so rt h ei n t e r n a lb o d yw a l la sp r o x i m a lp o r t i o n t h eg o n a dl i k ean a r r o wb a n da n di sg r o w i n gf r o mp r o x i m a lr e g i o nt od i s t a lb o r d e r i tw a sc o m p o s e do fn u m e r o u sf i n ed i g i t a t i o n s t h ed i g i t a t i o n sw e r ev a r yi nl e n g t hf r o mo 1t o0 51 1 2 n 。t h ef i n ed i g i t a t i o n sw i l lg r o wt h i c ka n dl o n gi nn o n b r e e d i n gs e a s o n s ，b u tw i l ld i s a p p e a ro rr e d u c ei nb r e e d i n gs e a s o n s ，t h eo v a r yl o o k sl i k eac l u s t e ro fg r a p e d i f f e r e n t i a t i o no fo o c y t e sw i t h i nt h eo v a r yp r o g r e s s e sf r o mt h em i t o t i c a l l yd i v i d i n go o g o n i ai nt h ep r o x i m a lr e g i o nt h r o u g has e r i e so fn u c l e a rc h a n g e so ft h ef i r s tm e i o t i cp r o p h a s et ot h ed i p l o t e n es t a g ea tt h ed i s t a lb o r d e r ，a tw h i c ht i m et h e ya r er e l e a s di n t oc o e l o mw h e r et h e yu n d e r g ov i t e l l o g e n e s i sa n dg r o w t h k e y w o r d s ：s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ，e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ，o r g a n o g e n e s i s ，p r i m o r d i a lg e r mc e l l si v附图清单图l 裸体方格星虫解剖示意图2图2 裸体方格星虫的胚胎发育过程模式图2 4图版1 裸体方格星虫前期胚胎发育4 0图版2 孵化出膜后的幼虫4 1图版3 前期胚胎的组织切片4 2图版4 出膜后的胚胎切片4 3图版5 裸体方格星虫幼体组织的观察4 4图版6 裸体方格星虫幼体组织的观察4 5图版7 裸体方格星虫幼体组织的观察4 6图版8 裸体方格星虫幼体组织的观察4 7图版9 裸体方格星虫海球幼体结构图4 8图版1 0 裸体方格星虫早期胚胎发育的a l p 染色4 9图版1 1 初期海球幼体a l p 染色5 0图版1 2 后期海球幼体纵切a l p 染色5 1图版1 31 5 同龄的海球幼体a l p 染色5 2图版1 4 收吻肌下体壁切片5 3图版1 5 生殖腺切片5 4学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：才陬2 。7 年6 月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。2 、不保密团。( 请在以上相应方框内打“4 ”)2 0d9 年，2 00 ，年6 月日么月日口广东海洋大学硕士学位论文1 1 裸体方格星虫概述第一章前言弟一早月i j 百裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) 又称光裸星虫，隶属于星虫动物门( s i p u n c u l i d a ) 方格星虫属( s i p u n c u l u s ) ，体呈长筒形、蠕虫状，具有真体腔，体壁上纵肌束和横肌束交叉排列，形成方格状花纹故称裸体方格星虫，主要分布自沿岸至3 0 米深的水域，一般潜入海底泥沙营穴居生活，以有机颗粒和藻类为食，涨潮时钻出，退潮时潜伏在沙泥中，故俗称沙虫f l 捌。裸体方格星虫不仅味道鲜美，而且营养价值高，含有丰富的蛋白质和氨基酸，不饱和脂肪酸及各种维生素和矿物质等。除了供人类食用外，还是亲虾、亲蟹最好、最理想的饲料i6 ，7 1 。自上世纪8 0 年代末以来，由于市场价格的刺激，裸体方格星虫遭到掠夺式采掘，以及环境变迁和环境污染等，种质明显衰退、资源量急速下降。有关专家称，裸体方格星虫人工繁殖关键技术的突破，对海洋资源的保护、增加沿海农民的收入、推动当地经济发展将起到重要作用。裸体方格星虫作为我国常见的两种经济价值较大的星虫之一，受到过度采捕、环境变迁和污染，资源明显减退。虽然北海和泉州开展人工育苗工作已近十年，但是人工育苗技术还未得到正真突破。尤其是幼虫从海球幼体变态到幼虫时期的高死亡率至今仍是人工育苗存在的最大的障碍。因此对继续深入开展星虫的繁殖生物学研究及人工育苗技术研究的需要是迫切的。对于裸体方格星虫早期胚胎发育和原始生殖细胞迁移位置的跟踪研究，有利于解决人们对裸体方格星虫生殖腺存在的学术争议，也希望在理论上能为星虫等低等动物的原始生殖细胞发生和迁移提供一些参考；另一方面以期在实践上为裸体方格星虫人工繁殖提供一些指导。1 2 裸体方格星虫的形态结构裸体方格星虫身体分成前部可收缩的吻部和后部体壁加厚的躯干部，前部吻的末端是头，头的腹侧有触手包围的口，背侧是脑。有四条收吻肌，分别从头部伸出穿过体腔，其中两条到达腹部肾管下方神经索两侧，称为腹部收吻肌，另外两条到达背部肛门两侧称为背部收吻肌，四条收吻肌处于同一水平线上，均在肛门上方；收吻肌用于拉伸吻进出体腔。体腔不分节，体腔液中有大量游离的血细胞和发育中的配子细胞。螺旋的消化肠分上行肠和下行肠两部分，体壁上发出大量丝状的固肠肌使肠道稳定，肠的前部连接着食道，后面连接着直肠和背部的肛门，肛门位于接近吻和体壁接口处裸体方格星虫( s l p u n c u l u sh “d 时l i n n a e l l s ) 胚胎发育及原始生殖细胞的发生和迁移的研究的背部体壁上。神经系统包括腹部一条紧贴体壁的神经索、环食道的神经网和食管上部的脑神经。有肾管一对，位于腹部收吻肌前神经索两侧，肾管两端开口，一端连接体壁向体外开e l ，另端向体腔延伸开口到体腔内口】。配子在体腔发育成熟后由肾管收集，并通过肾孔排出体外。裸体方格星虫结构示意图如图1 所示。掺囊馘v图l 裸体方格星虫解剖示意图a ：肛fj ：m ：上行肠：d l ：f 行肠：d 加：背部收吻肌：e ：食道：丘n ：固肠肌；h e ：头：眈吻：n e ：肾管；r ：盲肠；m ：直肠盲囊；t 触手：v r m ：腹部收吻肌f i g ln ks 廿l l c n eo f d i g e s t i v es y s t e mo f s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u sa ：a l l l l 。宴；a i ：a s c e n d i n g i n t e s t i n e ：d i ：d e s c e n d i n g i n t e s t i n e ：d u n ：d o r s o r a lr e t r a c t o r m u s c l e ：e ：e s o p h a g u s ；h e ：h e a d ；n e ：n e p h f i d u e ；f a n ：f i x i n g m u s c l e ；i n ：i n t r o v e r t ：r ：r e c t i l m ：r c ：r e c t a lc a l m ：t ：t e n t a c l e ：v r m ：v e n t r a lr e t r a c t o r m u s c l e1 3 星虫胚胎发育的研究13 i 星虫动物早期胚胎学星虫动物大部分雌雄异体，发育成熟的配子经肾管围食膜从体腔进入肾管中，在肾管内停留一段时间后，产到海水里，进行体外受精i ”1 4 i 。当然，星虫动物中也有少数雌雄同体和营孤雌生殖的种类0 5 , 1 6 。星虫的受精卵发育形式为螺旋卵裂，其胚胎以内陷方式或外包方式发育成原肠胚，此后有的种类可直接发育成幼星虫，如p h a s c o l i o nc r y p t u s 等，而大部分种类须经历营卵黄营养的自由游动的担轮幼虫( t r o e h o p h o r el a r v a e ) 阶段。晟早的星虫动物胚胎学的研究应追朔到1 9 0 7 年g e r o u l d 对g v u l g u f i s 受精卵卵裂的细胞谱系进行的研究他指出g v u l g a r i s 的受精卵从第三次卵裂开始即表现为螺，一麓鼗广东海洋大学硕士学位论文旋式分裂，而且发现在4 8 细胞期出现环节动物式交叉，即动物极有4 个细胞形成玫瑰花形，另有4 个交叉细胞( c r o s sc e l l ) 与其形成间辅式排列。每个玫瑰细胞( r o s e t t ec e l l ) 各有两个中间细胞( i n t e r m e d i a t ec e l l ) 与其相接排列成一线，而其余3 2 个细胞以2 圈形成一环带，是未来顶极及前担轮的基细胞。星虫卵裂的螺旋现象，是从第四次分裂才开始出现的1 7 1 。其后r i c e 的研究也有与此一致的报道【1 8 】。l - 3 2 星虫后期幼体发育及组织学星虫发育经过原肠胚期之后再经历第二个幼体阶段，一般称为漂浮幼体( p e l a g o s p h a e r al a r v a e ) 。漂浮幼体由担轮幼虫发育而来，通常以浮游生物为食物，一般个体较大( 几百微米长) ，历时较长，能够远距离地漂浮生活。漂浮幼体以发达的后纤毛环取代了前期担轮幼体的前纤毛环，进行漂浮和摄食。漂浮幼体的头部和后纤毛环能够缩回躯干内，此时星虫幼体的体形为球状，因此有的学者也将漂浮幼体称为海球幼体( p e l a g o s p h a e r a ) 。 1 9 - 2 1j曾经，漂浮幼体被认为是自由游动的成体星虫，直到2 0 世纪6 0 年代之后，关于星虫动物早期幼体发育的研究才开始有了较大进展。纠正了过去不少分类学的谬误，并对漂浮幼体的形态、发育过程与生态习性才有了准确的描述和解释【2 2 。2 4 1 。7 0 年代，美国学者r i c e 在星虫动物胚胎学、幼体形态学、行为、组织学及发生学等方面做了大量的研究工作，先后报道了1 5 种星虫的研究成果，并比较总结得出星虫的早期幼体发生的4 种模式：( 1 ) 直接发生，不经过具纤毛的幼虫阶段；( 2 ) 间接发生，营卵黄营养的担轮幼虫直接发育为蠕虫状星虫( v e r m i f o r ms t a g e ) ；( 3 ) 间接发生，营卵黄营养的担轮幼虫变态为营卵黄营养的漂浮幼体，后者再发育为蠕虫状星虫；( 4 ) 间接发生，营卵黄营养的担轮幼虫变态为营浮游生物营养的漂浮幼体，后者经过较长时间的浮游生活后，身体长大，经过第二次变态成为幼星虫( j u v e n i l ef o r m ) 。蠕虫状星虫还需经过一段时间的发育，才成为幼星虫。 2 5 - 3 2 1不同星虫种类的担轮幼虫具有不同的形态和生活习性。如p g o u l d i ，g o l f i n g i ae l o n g a t a ，g v u l g a r i s 等发育到单轮幼虫时期，会在幼虫的某一部位形成担轮带，环绕幼虫一圈【1 阳3 1 。对于裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) ，由于其发育成为前担轮的基细胞沿卵黄膜内面极度扩张的结果，形成了裸体方格星虫担轮幼虫的独特结构，即前担轮纤毛布满整个幼体表耐3 4 】。一些星虫动物的被膜( 卵黄膜) 在胚胎发育及担轮幼虫生长的过程中起着重要作用，它作为营养膜几乎完全被吸收，剩余的少部分参与了漂浮幼体腹沟的形成【3 。但有些星虫种类在发育过程中由于营养物质过剩，被膜消失。如p h a s c o l i o nc r y p t u s 的被膜后部形成幼体的部分表皮，前部则消失，p g o u l d i 和g v u l g a r i s 的被膜在担轮幼虫变态时消失【2 8 】，而p a g a s s i z i i 的被膜则完全变成漂浮幼体的表皮【3 6 1 。裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) 的卵膜会在变态时期靠后部躯干的撑力撑破从而脱落，由裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) 胚胎发育及原始生殖细胞的发，和迁移的研究于裸体方格星虫的卵膜比较厚，当担轮幼体发育全海球幼体即将变态时期，体腔扩大，躯干伸长使得后部躯干形成撑力将卵膜撑破，因此变态时是躯干部先出膜，头部仍被卵膜罩住，头部的卵膜会在幼体游动中脱落。此后稚星虫转为底栖生活【3 。虽然吴斌【38 】和兰国宝【37 】分别对裸体方格星虫的胚胎发育的部分过程进行了光镜观察，并讨论了不同温度下裸体方格星虫胚胎发育所需的时间，吴洪喜 3 9 研究了发育中的可口革囊星虫幼体形态特征的变化，但是他们都只是在形态学水平进行了描述。对裸体方格星虫胚胎发育的组织学观察一直是未见报道。1 4 星虫生殖腺的研究g r u b e ( 1 8 3 7 ) 第一次描述了星虫动物的卵出现在体腔中【9 4 j 。l u d w i g ( 1 8 7 4 ) 认为星虫动物生殖腺组织存在于收吻肌基部1 9 5 】。1 8 8 9 年a n d e r e w 第一次描述了g o l f i n g i av u l g a r i s 的生殖腺组织，他解释这个组织是一个折叠的腹膜，里面包裹着大量的生殖细胞，这些细胞由纤维组织相互连接固定。到了1 9 5 6 年，g o n e s 对g o l f i n g i av u l g a r i s的生殖腺进行了详细的描述，他将生殖腺种细胞从近端到远端核的变化做了解释，并把根据生殖细胞的核形态将生殖腺分成7 个区域，g o n e s 还发现生殖腺在一年中不同时期都是持续活动的，虽然在冬季会在有所减小【3 5 l 。然而t o w l e ( 1 9 6 7 ) 和g i e s e 在对p h a s c o l o s o m aa g a s s i z i l 进行研究发现，这种星虫的生殖腺发育是暂时存在的，只是在排卵之后才开始发育【9 6 , 9 7 】。r i c e 对p h a s c o l o s o m aa g a s s f z i 的性腺进行了研究，并描述星虫的生殖腺是一条窄的带状组织，从一条腹部收缩机内侧穿过腹部神经索到达另一条收缩机内侧边缘。顺着收吻肌底部的宽横向如葡萄挂状由肠系膜悬挂着，腹膜包裹，由多个指状突起组成，在性成熟季节这些指状突起会变厚变长，长度大约1 0 0 到5 0 0 微米【8 】。竺俊全研究了可口革囊星虫的精子发生，并发现其生殖腺形态与r i c e 描述的相似，为一曲折的带状组织，由腹膜包被，一端与体壁相连。精巢与体壁连接端或靠近体壁端为近端，伸向体腔一端为远端，精巢从近端向远端发割9 8 】。国内也有学者对裸体方格星虫配子发生进行了研究【3 4 , 3 7 , 3 8 , 9 9 】，但均未发现肉眼可见的生殖腺，部分学者推测方格星虫为比较特殊的物种，原生殖细胞在胚胎发育早期即游离于体腔液中增殖、发育；或者方格星虫性腺较小，即使借助解剖镜，肉眼也难以分辨。应利用组织切片技术，对收吻肌基部进行连续切片，h e 染色，可能可以观察到性腺。1 5 原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 的研究除单细胞动物外，动物体由两部分细胞组成：体细胞和生殖细胞，亲代的基因型4广东海洋大学硕士学位论文通过生殖细胞传递给子代。生殖细胞是由原始生殖细胞p g c s 发育而来，但原始生殖细胞( p g c s ) 并非在生殖腺中产生的，而是随着胚胎发育进行与体细胞分开通过不同的途径逐渐迁入正在发育着的生殖腺中，随后与其共同分化成为精巢或卵剿4 0 1 。1 5 1 原始生殖细胞的鉴定原始生殖细胞可采用组织学和细胞学、组织化学及分子标记等手段加以鉴定。某些动物p g c s 具有其独特的区别于体细胞的组织学特性，因此一些学者最初通常使用传统的组织学和细胞学方法鉴定其产生和迁移。该手段操作简便、结果直观可见。但在生殖细胞发生早期并非所有细胞中都能产生有形的特征性结构，因此该手段在许多物种中很难精确定位早期生殖细胞的发生部位及时间，有其局限性。随着现代分子生物学的发展，人们发现生殖细胞发育过程中存在特异性表达的基因，可以通过检测这些基因的表达变化来间接鉴定p g c s 的分化命运。因此结合使用生殖细胞的组织学和分子生物学特性，往往在早期发育过程中就可将其同体细胞区分开来，从而确定p g c s形成的发育时间和位置【4 。1 5 1 1 组织学鉴定p g c s 有h e 染色较深的细胞核大而圆、细胞质内的细胞器比较清楚等组织学特性【3 8 4 0 4 2 1 。然而不同的物种，其p g c s 大小和形态差异很大。如鱼类和哺乳动物的p g c s的共同特征是比周围的细胞大，呈圆形、卵圆形或梨形，细胞界线明显，细胞核很大且明亮，呈圆形、卵圆形，核膜清晰 4 5 , 4 6 ，而鸟类p g c s 细胞直径因其形状、发育期和种属的不同而异，核常位于细胞一侧，1 2 个明显的核仁【4 卜5 0 j 。但哺乳动物的p g c s有细胞周缘不整齐的特征，并且体外培养易形成典型的鸟巢状干细胞集落，集落内p g c s 细胞之间界限不清楚。马的p g c s 细胞质含有许多深染的圆形区域，袋鼠的p g c s含有特征性的椭圆形线粒体和丰富的核糖体【5 1 5 2 】。随着科技的发展，现代的透射电子显微镜( t e m ) 技术展现了迄今为止已研究过的所有动物门类的生殖细胞胞质中均存在一种具有区别于其他细胞的特征、与线粒体相联系的电子致密物质，在生精细胞中往往被称为拟染色质( c h r o m a t o i db o d y ) ，但也有人称为n u a g e l 5 3 , 5 4 l ，在卵子发生过程中多被称为生殖质( g e r mp l a s m ) ，其物质组成中含有丰富的r n a 和蛋白质【5 5 , 5 6 】。在线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 称为p 颗粒( pg r a n u l e s ) ，它们只在生殖细胞中出现，而不在体细胞中出现，并且般出现在早期发育的生殖细胞中，因此可以用来鉴定早期发育时期的生殖细胞【4 1 1 。现代分子生物学的研究结果已广泛证实了传统组织学鉴定p g c s 的正确性。相信随着人们对原始生殖细胞的研究，关于原始生殖细胞形态的描述将进一步丰富。1 5 1 2v a s av a s a 编码一种d e a d b o x 家族中a t p 依赖的r n a 解旋酶，最先在果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 中发现，在很多物种的生殖细胞中均存在特异性表达，因此v 3 s a 基因家族的表达产物已有很多学者用来标记p g c s 和生殖细胞。斑马鱼的v a s a裸体方格星虫( s i p u n c u l u sn u d u sl i n n a e u s ) 胚胎发育及原始生殖细胞的发生和迁移的研究首先被克隆出来 5 7 , 5 8 】，后又有研究者用v a s a 作为标记物对其他硬骨鱼中p g c s 的起源及迁移进行了实验研究。但对海洋无脊椎动物的研究则较少。1 5 1 3 其他特异性基因有一些特异性基因也曾经作为p g c s 的标记，但都由于特异性较差逐渐被研究学者们放弃。如属于p o u 家族的转录因子o c t 一4 ，曾被用作鉴定小鼠生殖细胞的标记物 5 9 , 6 2 】。但因其在分裂早期胚胎、内细胞团( i c m ) 、原始外胚层和p g c s 等具有发育全能性的细胞中均有表达【6 引，因此特异性比较差，本质上更适合作为多潜能细胞的标记物，而不是生殖细胞的标记物畔l 。也有国外学者将p l l 0 作为小鼠雄性生殖细胞的标记物【6 4 南6 1 。但后期的研究发现p l l 0 在许多物种的组织中有广泛的表达【6 n ，并不能专一的标记生殖细胞。1 5 1 4 时期专一性胚胎表面抗原( s t a g e s p e c i f i ce m b r y o n i ca n t i g e n s ，s s e a s )s s e a 1 、s s e a 3 抗原等是几种不同类型的糖类结合体，它们是细胞迁移和增殖所必需的，在p g c s 与基质的特异性识别和粘附反应中发挥重要作用。由于它们在p g c s 的不同发育阶段( 尤其是p g c s 迁移至生殖嵴后) 其表现方式不同，因此常被用来鉴定和处理p g c s 。但这些抗原仅可鉴定有限的几个胚胎发育阶段，连续性比较差，无法实现生殖细胞起源、分化全过程的追踪，同时不同物种的特异性抗原差异较大，很难实现统一6 8 7 0 】。1 5 1 5 碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a l p )碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a l p ) 是一种广泛存在的单酯磷酸水解酶( 正磷酸单酯水解酶e c 3 1 3 1 ) ，是一种膜结合金属糖蛋白。体外在碱性条件下，a l p 催化无机和有机的磷酸酯水解。体内a l p 一般认为参与物质转运、离子分泌、机体防御和软骨钙化等。但是，迄今为止，a l p 在体内的确切功能及其生理底物尚不清楚。a l p 是研究生殖细胞常用的标记物，在不同种属的p g c s 中均存在不同程度的表达，可以用来鉴定p g c s 。此方法首次应用是在1 9 5 4 年被作为老鼠生殖细胞的标记物，此后广泛作为家畜的p g c s 标记物【7 1 , 7 2 】。利用a l p 的表达特异性跟踪p g c s 信号，可揭示p g c s 的产生、迁移及其分化途径。虽然这种标记方法存在特异性不好【4 1 , 7 3 - 7 5 1 和连续性不好两点小缺陷外，但a l p 标记仍然不失为鉴定p g c s 最简单有效的方法之一。国内外许多学者利用这一方法对实验模式生物p g c s 进行了研究，包括利用a l p细胞化学法对体外培养小鼠精原细胞检测以及活性测定1 7 5 1 、大鼠原生殖细胞培养和分化【7 7 】、人原始生殖细胞的分离和体外培养的a l p 活性7 8 , 7 9 】、a l p 在文昌鱼胚胎和幼体中表达图式的研究【8 0 】。其p g c s 的a l p 标记均呈阳性，由此a l p 标记p g c s 的实效性及可靠性可见一斑。鉴于在海洋无脊椎动物生殖细胞发生和分化领域研究的空白及其重要性，本文采用a l p 组织化学方法对裸体方格星虫的原始生殖细胞进行跟踪研究，以期为海洋低6广东海洋大学硕士学位论文等无脊椎动物原始生殖细胞的发生及迁移模式研究奠定基础，并为进一步深入研究提供理论依据。1 5 2 原始生殖细胞的发生和迁移目前关于动物生殖细胞的起源分化现在存在两种观点：先成论( p r e f o r m a t i o n )和后成论( e p i g e n s i s ) 。先成说认为：在一些动物中，生殖细胞在胚胎发育得很早时期就可以很容易鉴定出来，其分化在受精之前或紧随受精之后的母性遗传决定子通过定位而确定，在卵裂中，有的卵裂球的细胞质中含有一种特殊物质称为生殖质，或具有特殊形态的卵裂球( 如细胞较大，变形虫状，内涵丰富的糖原或有类似生殖质的电子致密小体) 分化出来，这些卵裂球就是p g c s ，这种先成论多发生在昆虫( i n s e c t a ) 、线虫纲( n e m a t o d a ) 、轮虫纲( r o t i f e r a ) 、蛭纲( h i r u d i n e a ) 、头足纲( c e p h a l o p o d a )及两栖( a m p h i b i a n s ) 中。相对而言的后成论认为：在一些动物中，直到发育的晚期才能观察到生殖细胞，生殖细胞从体细胞中分化而来，其产生使周围组织诱导信号作用的结果，多见于海绵( p o r i f e r a ) 、腔肠( c o e l e n t e r a t a ) 、益虫( e c h i u r a ) 、苔藓( b r y o z o a ) 、部分鱼类和哺乳类动物【4 l 8 1 】。c a s s a n d r a 等研究总结了目前已研究过的2 8 个后生动物f - j ( 5 6 类动物) 生殖细胞的分化，发现p g c s 的形成时期在不同动物中存在很大差别：虽然在模式动物中，生殖细胞的先成论是占多数的方式，但对普遍的后生动物来说，生殖细胞后成论分化方式可能比先成论更原始和常见。先成论动物的p g c s 一般来源于早期胚胎发育形成的分裂球，如吸虫纲、毛颗类和无尾目动物在第一次卵裂就