（动物学专业论文）wolbachia感染对果蝇hira基因表达的影响.pdf

学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：他鹋坤分 日期：加1 1 年r 月f 日 导师签名：舢 日期：如一年厂月；日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 w o l b a c h i a 是广泛存在于节肢动物和线虫体内的一类微生物，属于立克次氏体， 可通过宿主卵的细胞质传递给子代。w o l b a c h i a 能够通过多种机制调节其宿主的生 殖方式，如细胞质不相容( c y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y ，c 1 ) 、孤雌生殖、雌性化以 及杀雄等，通过这些机制使其在宿主种群内广泛传播。c i 是w o l b a c h i a 共生引起的 一种最普遍的表型，表现为w o l b a c h i a 感染的雄性宿主与未感染或感染了不同品系 w o l b a c h i a 的雌性宿主交配后，子代死亡或仅有部分能够存活。但感染相同 w o l b a c h i a 的雌雄宿主交配后能够产生正常的后代。关于c i 的分子机制虽然有一些 研究，但目前还是不甚清楚，且存在很多争议。 h i r h i r a ( h i s t o n er e g u l a t i o n ) 基因是组蛋白h 3 3 的一种伴侣蛋白编码基因，果 蝇h i r a ( h i r a ) 基因的突变对果蝇存活没有影响，但导致雌性果蝇不育，因为突变 果蝇的卵受精后精核不能正常解凝，无法形成正常的雄性原核，因此后代在胚胎早 期死亡，其表型与w o l b a c h i a 诱导的c i 表型类似。 考虑到h i r a 基因对雄性原核形成的影响，以及w o l b a c h i a 感染导致宿主c i 的表型，我们用荧光定量r t p c r 方法研究了w o l b a c h i a 诱导的c i 强度与果蝇h i r a 基因表达量之间的关系，结果表明，w r i 品系感染引起拟果蝇( d r o s o p h i l a s i m u l a n s ) 产生强烈的c i 表型，即当1 d 感染果蝇( d s i mw r i ) 的雄体与未感染果蝇( d s i mt ) 雌体交配后，胚胎的孵化率只有7 6 74 - 2 1 8 ，而w a u 品系感染则没有产生c i 表 型，胚胎孵化率为8 7 6 24 - 2 6 7 ，与未感染果蝇交配组胚胎孵化率( 9 2 7 6 3 8 3 ) 没有显著差异。在雄性果蝇中，与未感染的果蝇相比，w r i 感染引起h i r a 的表 达水平显著下调( d s i mw r i d s i mt ：o 4 24 - 0 1 1 ) ( 砌0 5 ) ，而w a u 感染则没有引起 h i r a 的表达显著改变( d s i mw a u d s i mt ：0 8 64 - o 1 4 ) 。 已有研究表明，随着雄性果蝇日龄的增加，其诱导的c i 水平会逐渐下降。为 此我们检测了1 d 和5 d 雄果蝇引起c i 强度的变化情况。结果发现，当用5 d 的w r i 感染的雄体与未感染果蝇雌体交配后，胚胎的孵化率显著提高到5 0 8 94 - 5 5 6 ，说 明c i 强度已经显著下降。定量r t - p c r 结果表明，与1 d 雄果蝇相比，5 d 雄果蝇中 h i r a 的表达水平显著升高。这些结果提示，w o l b a c h i a 诱导的c i 强度可能与雄性 宿主体内h i r a 基因表达下调有关。 由于本研究组前期对黑腹果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) 的研究得到了与拟果 蝇中同样的结果，我们又利用实验室已有的h i r a 突变的黑腹果蝇( 商耐锄和 矾r 口h r l ，前者是点突变，后者为缺失突变) 来进一步验证雄体中h i r a 的表达与子代 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 胚胎孵化率的关系。结果表明，两种h i r a 突变的雄性果蝇与未感染w o l b a c h i a 的 雌性黑腹果蝇交配后，胚胎孵化率都显著低于未感染组，分别为7 2 9 84 - 5 1 0 、 7 4 3 44 - 4 0 3 。对早期胚胎进行荧光染色分析，发现在这些交配组的部分胚胎中有 典型的c i 表型图像：核分裂不同步，染色体分裂不全，有染色质问桥出现。由于 h i r a 基因位于x 染色体上，为了明确子代的死亡是否由h i r a 基因突变引起，我们 还统计了子代的雌雄比例，发现来自h i r a 突变组子代中的雌雄比例显著降低，分别 为：o 6 8 ( 圭0 0 8 ) 和0 6 0 ( 士o 1 1 ) ，说明子代中带有突变h i r a 的x 染色体的雌性果 蝇发生了大量死亡。有趣的是，能够引起黑腹果蝇强c i 表型的w m e lw o l b a c h i a 感 染的雌果蝇( d m e lw m e l ) 能够挽救h i r a 基因突变造成的胚胎发育缺陷，即当h i r a 突变的雄性果蝇与d m e lw m e l 雌果蝇交配后，子代的孵化率和雌雄比例都恢复正 常，与对照组没有显著差异。 综合这些研究结果，说明w o l b a c h i a 感染可能是通过引起雄性宿主体内h i r a 基 因表达下调，影响了精子的质量，从而导致后代胚胎发育异常。由于h i r a 是组蛋 白伴侣之一，因此w o l b a c h i a 感染导致雄性宿主h i r a 基因表达下调，引起组蛋白功 能异常，可能是c i 产生的原因之一。本研究不仅可以为研究c 1 分子机制提供一条 新的思路，而且可以为动物精子发生及早期胚胎发育过程的基础研究及共生菌和其 宿主间的相互作用研究工作奠定基础，在有害动物性别控制、农业害虫及媒介昆虫 的生物防治等应用基础研究领域，也具有潜在价值。 关键词：果蝇；w o l b a c h i a ；细胞质不亲和( c i ) ：h i r a 基因 e f f o r t , t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m su n d e r l y i n gc ia r ec u r r e n t l yl m k n o w n h i r h i r ao i l s t o n er e g u l a t i o n ) g e n ei si n i t i a l l yi d e n t i f i e d 船t h en e g a t i v er e g u l a t o ro f h i s t o n eg e n ee x p r e s s i o ni ny e a s t am u t a t i o no ft h eh i r ag e n ei nd r o s o p h i l i ar e s u l t si n s t e r i l i t yi nf e m a l e sd u et oa b n o r m a ld e c o n d e n s a t i o no fs p e r mn u c l e u sa f t e rf e r t i l i z a t i o n , t h ef o r m a t i o no f m a l ep r o n u c l e ii sa r r e s t e di nt h el a t ec h r o m a t i nd e c o n d e n s i n gs t a g e t h e r e f o r et h ep a t e r n a lc h r o m a t i nc a nn o tp a r t i c i p a t ei nt h ee m b r y o n i cd e v e l o p m e n t c o n s i d e r i n gt h a th i r a i si n v o l v e di nm a l ep r o n u c l e if o r m a t i o na n dt h a tt h e p h e n o t y p eo f c ii n d u c e db yw o l b a c h i ai n f e c t i o na l s oe x h i b i t st h ea b n o r m a ld e v e l o p m e n t o f m a l ep r o n u c l e i ，w ew o u l dl i k et oi n v e s t i g a t ew h e t h e rt h ec ip h e n o t y p ei sc o r r e l a t e d w i t hh i r ag e n ee x p r e s s i o ni nt h eh o s t s w ei n i t i a l l yt e s t e dt h ec is t r e n g t hi n1 - d a y - o l dd s i m u l a n sm a l e s t h er e s u l t so fc r o s s i n ge x p e r i m e n t ss h o wt h a tc ii so n l yi n d u c e di n m a t i n g sb e t w e e n1m a y o l dd s i mw r im a l e sa n du n i n f e c t e dd m e ltf e m a l e s ( h a t c hr a t e o f8 7 8 士1 0 3 ) i nc o n t r a s t , n oc ii si n d u c e db yd s i mw a u 1 - d a y - o l dm a l e s ( h a t c hr a t eo f 9 5 5 54 - 1 2 6 ) i ns t r o n gc il e v e l 幽( w r i ) i n f e c t e dm a l ef l i e s ，t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l o fh i r ai sl o w e rt h a nt h a ti nu n i n f e c t e dm a l e s ( d s i mw r i d s i mt ：0 4 24 - 0 11 ) 俨 o 0 5 ) ， t h en o nc ii n d u c i n gw a us t r a i nd i dn o tr e s u l ti nd r a m a t i c a l l yd e c r e a s e dh i r ae x p r e s s i o n i nm a l e s ( d s i mw a u d s i mt ：0 8 64 - 0 1 4 ) i tw a sr e p o r t e dt h a tc il e v e l sd e c l i n e dr a p i d l yw i t hi n c r e a s i n go fm a l ea g ei n d r o s o p h i l as t r a i n si n f e c t e db yw o l b a c h i a i no r d e rt of u r t h e ri n v e s t i g a t et h ec o r r e l a t i o n o fc ii n t e n s i 够w i t hh i r ae x p r e s s i o ni nw o l b a c h i a - i n f e c t e dm a l ef l i e s ，w ec o m p a r e dh i r a e x p r e s s i o nl e v e l sb e l n 嗍1 - d a y - o l da n d5 d a y - o l dm a l e so fd s i mw r i w ef o u n dt h a t 1 - d a y o l dd s i mw r im a l e sr e s u l ti ns i g n i f i c a n t l yl o w e rh a t c hr a t e s ( 7 6 7 2 18 ) i n c o m p a r i s o nt ot h a to f t h e5 - d a y o l dd s i mw r im a l e s ( 5 0 8 9 + - 5 5 6 ) 妒叼0 1 ) t h el e v e l i l l 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s o fh i r ag e n ee x p r e s s i o ni n c r e a s e sw i mm a l ea g e h i r ae x p r e s s i o ni n1 - d a y o l dm a l e sw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti n5 - d a y - o l dm a l e s 妒 o 01 ) t of u r t h e re x a m i n et h ei n v o l v e m e n to fh i r ae x p r e s s i o ni nt h ec ip h e n o t y p e ，t h e c r o s s i n ge x p e r i m e n t sw i t ht w oh i r a m u t a t e dd m e l a n o g a s t e rl i n e s ( h i r a s ma n dh i r a 腿1 ) w e r ea s s e s s e ds i m i l a rt ot h a ti nc ia s s a y s w ef o u n dt h a tb o t hh i r a - m u t a t e dm a l e sm a t e d t ow o l b a c h i a u n i n f e c t e dd m e ltf e m a l e sr e s u l t e di ns i g n i f i c a n t l yl o w e re g gh a t c hr a t e s ( 7 2 9 8 士5 1 0 ，7 4 3 44 - 4 0 3 ，r e s p e c t i v e l y ) r e l a t i v et od m e ltm a l e s ( 9 2 4 4 0 7 7 ) 俨 o 0 5 ) i nt h ee a r l ye m b r y o sd e r i v e df r o mt h ec r o s s e so fh i r a - m u t a n tm a l e sw i t hd m e l tf e m a l e s ，t h ea s y n c h r o n o u sc l e a v a g ea n dc h r o m a t i nb r i d g e sw e r eo b s e r v e dw h i c hi s s i m i l a rt ot h ec ip h e n o t y p ei nd m e l a n o g a s t e r t l l i ss u g g e s t st h a tt h em u t a t i o no fh i r a i nm a l e sm a ym i m i ct h ec ip h e n o t y p ei n d u c e db yw o l b a c h i a s i n c eh i r ai so nt h ex c h r o m o s o m e ，w ea l s oe x a m i n e dt h eo f f s p r i n gs e xr a t i ot o ew h e t h e rh i r am u t a t i o n i m p a c t ss p e r mq u a n t i t y w ef o u n dt h a tm a t i n gw i t hb o t hh i r a - m u t a n tm a l e sr e s u l t e di n s i g n i f i c a n t l yl e s sf e m a l ep r o g e n yi nt h en e x tg e n e r a t i o n i nt h ep r o g e n y ，t h er a t i oo f f e m a l e st om a l e sd e r i v e df r o mt h ec r o s s e sw i t h 删锄a n dh i r a r m lw e r eo 6 8 任o 0 8 ) a n do 6 0 ( 士o 1 1 ) ，r e s p e c t i v e l y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tm a n yf e m a l ep r o g e n ym o r t a l i t y w a sa s s o c i a t e dw i 也肺阳m u t a t i o n so no n exc h r o m o s o m e h o w e v e r ，t h ec r o s s e s b e t w e e nh i r a - m u t a t e dm a l e sa n dw m e l - i n f e c t e df e m a l e sr e s u l t e di n1 1 0s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e so fh a t c hr a t ec o m p a r i n gw i t hu n i n f e c t e dc r o s s e s t h ep r e s e n c eo ft h ew m e l s t r a i no fw o l b a c h i ai nf e m a l e sr e s t o r e dt h es e xr a t i oa ss h o w nb yas e xr a t i oo f 1w h e n h i r a - m u t a t e dm a l e sw e r ec r o s s e dw i t hd m e lw m e lf e m a l e s t a k e nt o g e n l e r ，t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tw o l b a c h i ai n f e c t i o nm a yc a u s eh i r a e x p r e s s i o nd r a m a t i c a l l yd e c r e a s e di nm a l e s ，t h u sa _ f l e e tt h eq u a l i t yo fs p e r ma n dr e s u l ti n a b n o r m a le m b r y o n i cd e v e l o p m e n to fo f f s p r i n g s i n c eh i r ai so n eo ft h eh i s t o n e c h a p e r o n e s ，i ti sp o s s i b l et h a tt h el o wl e v e lo fh i r ai nw o l b a c h i a - i n f e c t e dm a l e sr e s u l t s i nas t r u c t u r a lm a l f o r m a t i o no fs p e r mn u c l e u s ，w h i c hc a u s e st h ed e f e c t si nt h ee a r l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t t h e s er e s u l t sm a yh e l pd e t e r m i n et h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s mo f c ia n dp r o v i d ef i l 加i n s i g h ti nt ot h ei m p o r t a n tr o l eh i r ap l a y si nt h ei n t e r a c t i o no f w o l b a c h i aa n di t si n s e c th o s t k e y w o r d s ：d r o s o p h i l a ；w o l b a c h i a ；c y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y ( c i ) ；h i r ag e n e i v 录 i i l l l l 4 1 1 4g o l b a c h i a 的潜在应用价值“7 1 2h i r a 在精核解凝中的作用8 1 3 本研究的目的及意义“9 2 材料和方法 1 0 2 1 实验材料”l0 2 2 主要仪器设备1 0 2 3 试剂盒及主要试剂ll 2 4 实验方法1 1 2 4 1 果蝇培养基的配制”1 1 2 4 2 加有四环素的果蝇培养基配制1 l 2 4 4 葡萄汁收集盘的制作1 2 2 4 5c 1 分析( 胚胎孵化率的测定) 1 2 2 4 6 果蝇胚胎d a p i 染色实验步骤1 2 2 4 7 果蝇d n a 的提取1 2 2 4 8 果蝇r n a 的提取( t r i z o l 提取法) l3 2 4 9 荧光定量p c r ”1 3 3 实验结果 1 6 3 1 不同w o l b a c h i a 品系感染拟果蝇产生c i 强度不同1 6 3 2w o l b a c h i a 感染对果蝇体内h i r a 基因表达的影响”1 7 3 3 不同日龄雄性果蝇胚胎孵化率的测定1 8 m 甜a s t 粒e r s 敞t h e 姗 3 4 不同日龄雄性果蝇中h i r a 基因表达1 8 3 5h i r a 基因突变对果蝇胚胎发育的影响一1 9 3 6h i r a 缺失突变雄蝇后代早期胚胎核分裂异常2 0 4 讨论 2 2 4 1w o l b a c h i a 感染导致c i 的强度与雄性果蝇体内h i r a 基因表达下调有关2 2 4 2h i r a 突变对雄性果蝇生殖力的影响2 3 参考文献 缩略语表 攻读硕士学位期间发表的学术论文 致谢 2 5 3 3 3 4 3 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 前言 1 1w o l b a c h i a 的研究进展 w o l b a c h i a 是一种存在于多种节肢动物及线虫体内的微生物，属于立克次氏体。 由于它对宿主的生殖方式产生许多重要影响，如引起胞质不亲和( c i ) 、诱导孤雌 生殖、雌性化以及杀雄等，w o l b a c h i a 的研究已成为近年来生物学研究的热点之一。 在体、内外细胞中的研究都证明了w o l b a c h i a 可以广泛地影响宿主基因的表达，包 括一系列与繁殖、免疫反应、热激反应有关的基因【l 】。w o l b a c h i a 的基因甚至可以插 入到其寄生宿主的基因组内，即使去除了w o l b a c h i a 感染，这些插入的基因依然可 以随着宿主基因的转录而得到表达【2 3 】。w o l b a c h i a 可能正是通过这些方式对宿主的 生殖及发育等生命活动过程产生影响，如导致c i 等。通过这些调控也可能推动动 物进化、促进新物种形成。 1 1 1w o l b a c h i a 的宿主范围 在自然界中，w o l b a c h i a 的宿主范围非常广泛。已有研究表明，6 6 以上的昆 虫都有w o l b a c h i a 的感染1 4 j ，某些地区昆虫w o l b a c h i a 的感染率甚至达到7 6 【5 】，几 乎涉及到昆虫中所有的目。此外，w o z 6 a c h i a 在蛛形纲的蜘蛛类、螨类、甲壳纲的等 足目中也大量存在【6 1 ，在节肢动物以外的类群线虫中也有w o l b a c h i a 的共生【7 ，8 】。 这就表明，w o l b a c h i a 具有较为广泛的宿主范围。在我国，目前已发现被w o l b a c h i a 感染的物种分别有：果蝇【9 】、南亚果实蝇【1 0 1 、尖音库蚊【l l 】、三色书虱【1 2 】、烟粉虱【1 3 】、 灰飞虱【1 4 】、赤眼蝌1 5 1 、金蜂【1 6 1 、栗糜蜂【1 7 1 、二斑叶螨【1 8 】、朱砂叶螨f 1 9 】、棉蚜【2 0 】、 蚂蚁【2 1 1 、米蛾c 2 2 】、蜘蛛【2 3 】等。然而w o l b a c h i a 在我国不同地理种群间的分布是不均 匀的，这种不均匀性可能与不同地区的地形、气候、宿主条件以及w o l b a c h i a 的传 播效率等因素有关。 1 1 2w o l b a c h i a 的主要存在部位 w o l b a c h i a 主要存在于宿主生殖腺的细胞质中。在卵巢中，主要集中于滋养细 胞。在卵子发生过程中，滋养细胞能够通过胞质桥将营养物质输送到卵子，存在于 其中的w o l b a c h i a 可能在此时对胞质不亲和以及孤雌生殖的诱导起重要作用洲。后 来的研究发现，w o l b a c h i a 不仅存在于生殖组织中，有时在马氏管，邻近体腔的肌 硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 肉组织，血细胞和血淋巴等其他部位也有发现。另外，在一些物种，如拟果蝇 ( d r o s o p h i l as i m u l a n s ) 1 9 、博寡节小蜂( d a h l b o m i n u sf u s c i p e n n i s ) 2 5 1 、和目虱 ( a r m a d i l l i d i u mv u l g a r e ) t 2 6 1 的神经组织中同样发现有w o l b a c h i a 的存在。因此， w o l b a c h i a 的共生部位的范围也是较为广泛的，这种广泛性可能与w o i b a c h i a 对宿 主生殖以及行为产生的各种影响密切相关。 果蝇的卵巢是由一束具有鞘的卵巢小管构成的，每个卵巢小管的末端连结着原 卵区，这个区域有2 3 个生殖干细胞( g s c s ) 【2 7 1 。每个生殖干细胞分裂形成一个生殖 干细胞以及一个包囊干细胞。在共生的果蝇的生殖干细胞中可以清楚地看到 w o l b a c h i a 。 在干细胞进行有丝分裂期间，肋l b a c h i a 存在于自我更新的干细胞和分化的包 囊干细胞之间，这可能是w o l b a c h i a 从生殖干细胞进入到分化的子细胞中的一个暂 时过渡位置 2 7 1 。w o l b a c h i a 在干细胞和包囊干细胞之间的分布的机制还不甚明了。 带有w o l b a c h i a 的包囊干细胞之后转变为共生w o l b a c h i a 的卵腔，包囊干细胞经过 四次不完全胞质分裂的有丝分裂，形成由1 6 个细胞组成的包囊，这些细胞之间由 环管状的细胞质桥相互连接，w o l b a c h i a 平均分布在包囊中的每个细胞中幽】。原卵 区包囊被周围一组体壁滤泡细胞包围着，滤泡细胞里存在着很多w o l b a c h i a ，这可 能是w o l b a c h i a 传递到生殖系包囊中的第二个位点【2 9 】。当生殖系细胞到达体壁干细 胞区域时，一层体壁细胞包裹着它，在这个时间点过后，被包裹的包囊开始形成卵 腔阳。 w o l b a c h i a 开始是不均匀的分布在卵腔的生殖系细胞中的，这种不均衡是由卵 腔的细胞骨架影响的，最后一个细胞形成卵母细胞，其他1 5 个细胞形成滋养细胞， 卵母细胞的后极明显有一微管形成中心，含有丰富的中心粒和微管负极【2 7 1 。微管由 卵母细胞的后端发出，他们的正极经过环管指向滋养细胞。这被认为是滋养细胞通 过负极指向蛋白例如细胞质动力蛋白向卵母细胞输送物质 3 0 3 】。在卵子发生的3 6 期，微管排列已经确定了，w o l b a c h i a 开始在卵母细胞前端皮质区聚积，这种定位 模式在共生w m e lw o l b a c h i a 的黑腹果蝇以及共生w r iw o l b a c h i a 的拟果蝇中均有报 道 2 s ，3 2 】。对黑腹果蝇所做的实验发现，w o l b a c h i a 在前端皮质区域聚集主要依赖微 管和细胞质动力蛋白。 在卵子发生中期，w o l b a c h i a 随着卵母细胞大范围的细胞骨架重排而发生移位。 在卵子发生的第6 期，以卵母细胞与邻近的滤泡细胞之间的表皮生长因子受体为基 础的信号，激发卵母细胞发生极化 3 3 - 3 5 l 。这个信号导致在卵子发生的第7 期时卵母 细胞的的微管网络发生显著的重排。后端的微管中心解体，微管重排从而微管负极 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 从前端的皮质辐射开来，正极指向卵母细胞的后端。在重组期间，卵母细胞核从卵 母细胞后端移动到前背侧位置。w o l b a c h i a 也随之发生转移，本来在前端聚集，在 卵子发生的6 9 期均匀分布在细胞质中【3 6 4 1 1 。 w o l b a c h i a 在卵子发生晚期分布不均匀，在果蝇卵子发生的8 1 0 a 期间，微管 的正极朝向卵细胞的后端，这种极性决定了m r n a 和大量的其他因子聚集在卵子后 端形成极质【4 2 川】。在卵子发生的9 期后阶段和1 0 a 阶段，w m e lw o l b a c h i a 也在卵子 后端极点处聚集【4 5 l 。抑制试验和遗传分析揭示w o l b a c h i a 在后端的聚积需要微管、 驱动蛋白( k i n e s i n - 1 ) 和无o s k a r 的极质( p o l ep l a s m ) 的作用。w o l b a c h i a 在卵子 后端聚积包括两步：k i n e s i r l - 1 介导w o l b a c h i a 顺着微管转移到卵母细胞后端；接下 来极质介导w o l b a c h i a 锚定到后端皮层。 w o l b a c h i a 虽然不经过雄性生殖系传播，但可能在精子发生过程中对精子进行 了某种修饰。w o l b a c h i a 分布在雄性生殖系中，在精子成熟的最后阶段被去除， w o l b a c h i a 在雄性生殖系中的聚集和分布可能是引起c i 的主要原因之一。 精子发生在一个具有膜的精巢小管中进行，生殖干细胞位于尖端处，成熟的精 子在最远端【蛔。与卵子发生相似，2 3 个原生殖干细胞由一簇体壁衍生的一组称为 “h u b 的细胞团包围，原始生殖干细胞经有丝分裂，一个子细胞和h u b 细胞团相 连，另一个形成原生殖细胞，对于w o l b a c h i a 在雄性原始生殖干细胞中的数量以及 分离模式还知之甚少，但是对果蝇生殖系的研究表明，每个细胞中可能存在4 5 个 w o l b a c h i a l 4 刀。 w o l b a c h i a 在精子发生进程中呈现不均匀的分布。新生的精原细胞被两个体囊 细胞包围着，这一组细胞后来发育为一个包囊，在这个包囊里，精原细胞经过四次 不完全的胞质分裂形成1 6 个初级精母细胞，彼此之间有胞质环相连，由拉长的体 细胞包囊着 4 8 1 。当精母细胞分裂时，w o l b a c h i a 通过某种机制分散到精细胞中去。 w o l b a c h i a 的分布与中心体和微管没有密切联系，还没有证据显示w o l b a c h i a 是通过 环管来运输的。很多的包囊里既有感染也有未感染的精母细胞【4 7 1 。 在精原细胞转变为精母细胞后w o l b a c h i a 的数目开始增多，在这期间，精母细 胞进入生长和基因表达的时期。精母细胞生长的同时，w o l b a c h i a 在每个细胞中的 数目增加至3 0 5 0 个，推测w o l b a c h i a 也进行了复制【4 7 , 4 9 1 。w o l b a c h i a 数目的增多也 有可能是因为临近感染的体细胞中的w o l b a c h i a 转移过去的。后一种解释得到体内 试验的支持，在卵巢中，w o l b a c h i a 可以由体细胞传递到生殖干细胞中网。 与卵子发生不同，1 6 个初级精母细胞经过两次不完全的胞质分裂产生“个相 连的精子细胞。在这一过程中w o l b a c h i a 并不复制，每个包囊中的w o l b a c h i a 数目 以及凝集的细胞核的浓缩结构【稍】。核心组蛋白被从核d n a 中移除，取而代之的是 鱼精蛋白，有利于d n a 的包装而形成精子的头部。当鱼精蛋白沉积的同时，球形 的精子头部与核变为长形。另外，精子细胞经过一个分离的过程，称为个体化 ( i n d i v i d u a l i z a t i o n ) ，即精子之间不再相互连接在一起了，而是分成一个个独立的精 子。在这期间，胞质环分离、细胞质、多种细胞器以及w o l b a c h i a 形成一个“废物 包 ( w a s t eb a g ) 被排出胞外，这样w o l b a c h i a 就被从精子中排除掉了【4 8 ，5 ”n 。 1 1 3w o l b a c h i a 与细胞质不亲和 细胞质不亲和( c i ) 是w o l b a c h i a 引起的最普遍的表型，c i 包括两种类型：单 向不亲和和双向不亲和。当感染w o l b a c h i a 的雄性和未感染的雌性交配时导致雌性 产的卵不能正常孵化，死于胚胎发育期，即单向不亲和，反之( 未感染w o l b a c h i a 的雄性和感染的雌性交配时) 是亲和的( 可育) ：当同时被不同品系的w o l b a c h i a 感 染的雄性和雌性个体交配时，导致子代在胚胎期死亡，称为双向不亲和。c i 最早是 在c u l e xp i p i e r m 中发现的 5 2 , 5 3 】，现在几乎每种w o l b a c h i a 感染的昆虫目中都有报道 【驯。c i 最引人瞩目的一个特征是感染的雌性与感染了同种w o l b a c h i a 或未感染的雄 性交配之后可以正常繁殖，产生携带w o l b a c h i a 的后代。b o u r t z i s 等认为，c i 可以 用“修饰( m o d i f i c a t i o n ) 一和“挽救( r c s c u e ) 模型来解释，即w o l b a c h i a 可能在 宿主精子发生时期对精核进行某种修饰，当这些经过修饰的精子进入到含有相同 w o l b a c h i a 的卵细胞中时，卵中存在着的相同w o l b a c h i a 就能够挽救被修饰过的精核， 使得雌雄配子可以相互融合，从而使胚胎得以正常发育。如果被修饰的精核进入到 未感染的卵子中则挽救不可以进行【5 5 1 。挽救和修饰是具有种属特异性的，共生了一 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 种肋场a c h i a 的卵不能挽救另一种l 孩o l b a c h i a 对精核的修饰。感染的雌性和未感染 的雄性交配是可育的，感染的雌性相对未感染的雌性就有一个选择优势，从而使 w o l b a c h i a 能够在昆虫种群中迅速传播。 细胞学研究表明，c i 胚胎第一次有丝分裂存在着严重的缺陷【”巧7 1 。理解c i 的 分子机制关键在于了解胚胎早期发育特征。当精子进入卵细胞后，精子质膜和核膜 立即被移除，核膜被移除的机制还不清楚。这时，父本d n a 中的鱼精蛋白被去除， 卵母细胞中的母源性核心组蛋白和组蛋白变体进入精核，帮助精核解除浓缩状态， 从而确保精子染色质的重塑，形成正常的雄性原核【5 s l 。紧接着雄性原核又变为圆形 并获得母本提供的包含有核纤层蛋白及核孔的核膜。在核重塑完成后，父本染色质 复制、浓缩，为第一次有丝分裂做准备。父本和母本原核依赖微管和微管动力蛋白 彼此靠近。在原核定位时，核膜破裂，纺锤体形成，后期时同源染色体分离形成两 个二倍体的子细胞核【5 9 , 6 0 。而在c i 胚胎中，受精之后的第一次有丝分裂异常。科 学家第一次发现这个现象是在寄生蜂o v a s o n i av i t r i p e n n i s ) 中，在第一次有丝分裂时 紧靠着正常浓缩的雌性同源染色体旁的父本染色质仍然呈现异常凝集状态1 6 1 1 。其他 的研究也验证了这种现象并称为父本染色体去浓缩缺陷。后来的研究表明非正常浓 缩凝集的父本染色体在第一次有丝分裂期间变为碎片，有一些碎片掺入到子核 6 2 , 6 3 】。和v i t r i p e n n i s 相似，果蝇dm e l a n o g a s t e r 和d s i m u l a n s 的c i 早期胚胎显 示了在原核并列时雄性原核d n a 是弥散的。与mv i t r i p e n n i s 不同，在分裂后期， 可以观察到大量的染色体连接在起，形成染色质间桥，表明染色体分离不完全。 分裂后期染色质桥是d n a 复制损伤或不完全的重要标志【6 3 彤】，因此说明在c i 胚胎 中，来自父本的染色体中的d n a 复制出现异常。 对拟果蝇的c i 胚胎的进一步研究发现，当母本的染色体己经进入到第一次有 丝分裂的中后期时，父本染色体依旧处于浓缩状态从而不能分离开来，这种延迟可 能与纺锤体装配检验点的激活有关嗍。在其他的细胞中已经验证了纺锤体检验点的 激活能够抑制染色体的分离。在拟果蝇c i 胚胎中，有一半的纺锤体拉动母本染色 体进入到分裂后期而父本染色体的分离却被延迟了。这也说明了虽然父本和母本染 色体共用同一纺锤体但两者的纺锤体检验点的调控却是独立的。父本和母本第一次 有丝分裂纺锤体的行为在中期和后期转换的相对独立性可以用来解释单倍体二倍 体和二倍体二倍体昆虫之间不同的c i 结果。对三种亲缘关系较近的单倍体二倍体 的n a s o n i a 属中，c i 造成l o n g i c o r n i s 和g i r a u l t i 死亡，而在v i t r i p e n n i s 中， c i 胚胎可以发育成为雄性后代嗍。对这前两种n a s o n i a 胚胎的第一次有丝分裂的细 胞学分析发现，父本染色体在第一次有丝分裂的分离产生非整倍体的子细胞核而造 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 成胚胎死亡。相反的，v i t r i p e n n i sc i 胚胎中父本染色体遭到严重破坏而不能进入 到分裂后期，推测可能是因为纺锤体装配检验点被激活了。但是，因为分为两部分 的纺锤体功能独立各自进入中后期转换，母本染色体能够正常分离，产生能够存活 的子代单倍体有丝分裂产物。这些胚胎最终发育为单倍体雄性寄生蜂后代。当父本 染色体遭受比较轻微的染色体包装破坏时，纺锤体检验点不能被激活，从而造成染 色