（作物遗传育种专业论文）利用est序列对二倍体棉种染色体物理序号的fish定位.pdf

嬲嗍物 华中农业大。、产学位论文独创性声明及使用授权书 学他论文 墨、 如需保密，解密时间 砷年7 月日 是否保密 张哆本 帆年办夕日 始掺蒋摊名：一 签名日期：。6 年石月吵日 签名日期： 秒6 ；月，7 日 利用e s t 序列对- 二倍体棉种染色体物理序吁的f i s h 定位 目录 摘要i a b s t r a c t i i 1 文献综述1 1 1 原位杂交技术的基本原理及技术特点1 1 1 1 荧光原位杂交技术的基本原理1 1 1 2 荧光原位杂交技术操作步骤。1 1 1 3 荧光原位杂交技术的特点1 1 2 荧光原位杂交技术的发展概况2 1 2 1 不同探针的应用2 1 2 2 分辨率的提高。2 1 3 荧光原位杂交在植物研究中的应用4 1 3 1 高度或中度重复的d n a 序列的鉴定：4 1 3 2 低拷贝或单拷贝d n a 序列及遗传标记的物理定位。4 1 3 3 异源染色质的鉴定5 1 3 4 易位体的鉴定6 1 3 5 基因组d n af i s h 研究。6 1 3 6b a c f i s h 定位7 1 3 7 染色体物理图谱的构建7 1 3 8 亲缘关系7 1 3 9 转基因检测：8 1 4 棉属荧光原位杂交的研究应用8 1 4 1r d n a o f i s h 研究。8 1 4 2 非整倍体的鉴定1 0 1 4 3 易位体的鉴定1 0 1 4 4g d n a f i s h 研究1 0 1 4 5 构建染色体物理图谱。1 1 1 4 6b a c f i s h 定位1 1 1 5 染色体顺序编号的研究方法1 2 1 5 1 棉花染色体顺序编号的研究方法1 2 1 5 2 其它作物染色体顺序编号的研究方法1 2 1 6 本试验研究目的意义1 3 华中农业人学2 0 0 6 届硕t 学位论文 2 材料与方法1 4 2 1 实验材料1 4 2 2 实验方法1 4 2 2 1 棉花基因组d n a 的提取，1 4 2 2 2 粗线期染色体制片。1 5 2 2 - 3 探针的制备1 5 2 2 4 探针的标记1 5 2 2 5 荧光原位杂交1 6 2 2 6 荧光观察。1 7 2 2 7 数据统计1 8 2 2 8s o u t h e m b l o t t i n g 1 8 3 结果与分析2 2 3 1 以单拷贝e s t 序列为探针的雷蒙德氏棉粗线期染色体f i s h 2 2 3 2 以1 8 s r d n a 和5 s r d n a 为探针的雷蒙德氏棉粗线期染色体f i s h 2 4 3 3 棉属5 s r d n a 同步进化的s o u t h e r nb l o t t i n g 研究2 5 3 4 雷蒙德氏棉粗线期染色体核型分析。2 6 4 讨 仑。2 8 4 1 关于构建棉花高密度粗线期染色体物理图谱及全基因组测序的设想。2 8 4 2 棉花粗线期染色体f i s h 的优越性2 8 4 3 对棉花染色体物理序号编号问题的探讨2 9 4 4 对单拷贝e s t 序列信号检出率的探讨2 9 4 5 关于棉花粗线期染色体f i s h 分辨率的探讨3 0 4 6 对棉花粗线期染色体制片技术的探讨3 0 4 7 棉花粗线期染色体原位杂交中部分问题的探讨3 1 4 7 1 对棉花f i s h 流程的改进。3 1 4 7 2 变性条件的筛选3 l 4 7 3 杂交后的正确洗脱强度3 2 4 7 4 关于棉花粗线期f i s h 抗体浓度的探讨3 2 5 结论3 3 参考文献3 4 致谢4 5 利用e s t 序列对二倍体棉种染色体物理序i j - 的f i s h 定位 摘要 棉花染色体物理序号的确定大多以染色体全长、着丝粒位置、臂长、臂比等形态 学数据为依据。但由于棉花染色体形体较小，很难从形态上区分各条染色体，尽管有 许多学者报道了棉花四倍体和二倍体核型的研究结果，并对其进行了顺序编号，但不 同学者之间依然存在着很大的分歧。 本实验以四倍体棉公认的起源二倍体种之一雷蒙德氏棉为材料，利用荧光原位杂 交技术( f i s h ) ，选取较长的单拷贝e s t 序列作为探针，旨在对雷蒙德氏棉1 3 对粗线 期染色体进行f i s h 定位，从而把染色体区分开。主要研究结果如下： 1 在国内首次在棉花的花粉母细胞中制出了粗线期染色体制片。从d 组野生棉遗传 图谱每个连锁群上选取3 个e s t 序列，共选取3 9 个e s t 序列作为探针，对每个 探针设计引物，以雷蒙德氏棉基因组为模板进行p c r 扩增、回收、纯化、测序， 最终在每条染色体上筛选出一个单拷贝探针，共十三个探针对雷蒙德氏棉十三条粗 线期染色体进行f i s h 定位，探针长度在8 6 6 b l r - - 1 3 7 5 b p 之间。并最终将十三个 e s t 探针分别定位到十三条雷蒙德氏棉粗线期染色体上。 2 r d n a 基因是高度保守的串联重复序列，通过f i s h 技术对其在染色体上分布的位 置、位点以及拷贝数多少进行比较研究，是确定棉花起源与进化的重要手段之一。 根据棉花1 8 s r d n a 、5 sr d n a 基因序列设计引物，以陆地棉标准系t m 1 基因组 为模板进行p c r 扩增、回收、纯化、测序。雷蒙德氏棉是棉花四倍体栽培种公认 的起源种之一，利用1 8 s r d n a 和5 sr d n a 基因为探针，对雷蒙德氏棉粗线期染色 体进行双色荧光原位杂交的物理定位。并通过s o u t h e n 杂交确定5 sr d n a 基因 在陆地棉( t m 1 ) 、海岛棉( 新海7 号) 、草棉和雷蒙德氏棉基因组中的拷贝群的 数量，对5 sr d n a 基因在四倍体和二倍体棉种中的同步进化进行了研究。 3 首次对雷蒙德氏棉十三条粗线期染色体进行了核型分析，根据染色体的全长值从高 到低确定了染色体的物理序号，并对雷蒙德氏棉粗线期染色体与体细胞中期染色体 进行了核型比较。 关键词：棉花，物理序号，荧光原位杂交，e s t 序列，粗线期染色体，r d n a a b s t r a c t n u m b e r i n go fc o t t o nc h r o m o s o m ei sg i v e nb yc h r o m o s o m el e n g t h ，p o s i t i o n o f c e n t r o m e r e ，e l a t i v el e n g t h so fc h r o m o s o m e ，r mr a t i o s a s c o t t o nc h r o m o s o m ei sv e r y s m a l l ，i ti sd i f f i c u l tt oi d e n t i f ym o r p h o l o g i c a l l yt h ei n d i v i d u a lc h r o m o s o m ef r o m c o t t o n c h r o m o s o m ec o m p l e m e n t a l t h o u g hm a n ys t u d i e sh a v eb e e nc o n d u c t e do n t h ek a r y o t y p e o f t e t r a p l o i d a n d d i p l o i d c o t t o n ，n u m b e r e d c h r o m o s o m eo r d e r b yl e n g t h s ，b u t c o n t r o v e r s i e ss t i l le x i s ta m o n gd i f f e r e n tr e s e a r c h e r s i nt h i ss t u d y , w es e l e c td g e n o m ed i p l o i dc o t t o ng r a i m o n d i ia sm a t e r i a l s a n ds i n g i e c o p ye s t sa r eu s e da sp r o b e ，d i s t i n g u i s ht h i r t e e np a c h y t e n ec h r o m o s o m e s o fr a i m o n d i i b yf l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) t h em a i n r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 w em a k es l i d e so fc o t t o np a c h y t e n ec h r o m o s o m e sf r o mp o l l e nm o t h e rc e l l a tf i r s ti n c h i n a w ec h o o s et h r e ee s t sf r o me v e r yl i n k a g eg r o u p ，a n dt h i r t yn i n ee s t sa sp r o b e a g g r e g a t e l y e v e r ye s t i sd e s i g n e dp r i m e ，p c rw i t ht e m p l a t ed n a o fr a i m o n d i ig e n o m e ， r e c l a i m e d ，p u f i f i c a t e da n ds e q u e n c e d a tl a s t ，w es e l e c tt h i r t e e ne s t s ( 8 6 6 b p 一1 3 7 5 b p ) a s p r o b et o g e t h e r t h ep r o b e sw es e l e c t e da r el o c a t e dt h i r t e e np a c h y t e n ec h r o m o s o m e s 0 f r a i m o n d i ir e s p e c t i v e l yb yf i s h 2 t h er d n a g e n e so fc o t t o na r et a n d e m l yr e p e a t e dd n a i ti sa l li m p o r t a n ts t u d y m e t h o do n t h eo r i g i na n de v o l u t i o no ft e t r a p l o i d m a n yr e s e a r c h e r ss t u d yi t sl o c a l i t i e sa n dc o p i e sb y f i s h w ed e s i g np r i m e sw i t hs e q u e n c eo f1 8 s r d n aa n d5 s r d n a w ep e r f o r mp c r w i t ht e m p l a t ed n ao ft m 1g e n o m e ，r e c l a i m ，p u r i f i c a t i o na n ds e q u e n c e 1 8 s r d n aa n d 5 sr d n aa sp r o b el o c a t e dt h ep a c h y t e n ec h r o m o s o m e so fr a i m o n d i i w ec o n f i r mc o p y g r o u p so fg h i r s u t u m ，g b a r b a d e n s e ，g r a i m o n d i i ，g h e r b a c e u m ，a n ds t u d yc o n c e r t e d e v o l u t i o no f5 s r d n ai nt e t r a p l o i da n dd i p l o i dc o t t o n 3 w ea n a l y s ek a r y o t y p eo ft h et h i r t e e np a c h y t e n ec h r o m o s o m e so fr a i m o n d i if i r s t ，a n d n u m b e rc h r o m o s o m e sv i a t h el e n g t ho ft h i r t e e np a c h y t e n ec h r o m o s o m e s w ec o m p a r e t h e k a r y o t y p eo fp a c h y t e n e a n dm e t a p h a s ec h r o m o s o m e s k e yw o r d s ：c o t t o n ；p h y s i c a ln u m b e r i n g ；f l u o r e s c e n ti ns i t u h y b r i d i z a t i o n ； e s t ；p a c h y t e n ec h r o m o s o m e ；r d n a 利用e s t 序列对二倍仆棉种染色体物理序i ，的f i s h 定位 1 文献综述 1 1 原位杂交技术的基本原理及技术特点 1 1 1 荧光原位杂交技术的基本原理 “ d n a 荧光原位杂交( f i s h ) 技术是7 0 年代末8 0 年代初开始发展起来的一种重 要的非放射性原位杂交技术，它的基本原理是将d n a 探针用特殊修饰的核苷酸分 子标记( 如b i o t i n d u t p 或d i g o x i g e n i n d u t p ) ，根据d n a - - d n a 和d n a m r n a 碱 基的配对原则与染色体上相对应的序列杂交。进行原位杂交时，先用高温或碱处理 d n a 分子，使之发生变性；当温度下降或p h 值恢复到中性，变性的d n a 会按照 碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源 不同，只有它们之间的碱基序列是同源互补或部分同源互补时，才能全部或部分复 性，产生分子杂交。由于探针带有荧光物质，因此杂交的位点可直接在荧光显微镜 下观察到。利用该技术可以检测d n a 序列在染色体或d n a 纤维上的定位、定性、 相对定量分析。 t ， 1 1 2 荧光原位杂交技术操作步骤 根据探针标记的方法不同，可分为直接法和间接法原位杂交。前者是将荧光素 如异硫氰酸荧光素( f i t c ) ，罗丹宁( r h o d a m i n e ) ，德、i l l ( t e x a sr e d ) 等染料直接结合 到d n a 或r n a 上，在荧光显微镜下观察杂交信号；后者是先用d n a 标记物( 如生 物素、地高辛) 标记探针，然后制备其荧光抗体，待探针与标本杂交后，再用抗体进 行反应，根据荧光信号所在的部位以确定目的d n a 的位置。荧光原位杂交的操作 步骤可概括为( 1 ) 隹i l j 备染色体；( 2 ) 标记探针；( 3 ) 将探针与实验材料的靶序列进行杂交： ( 4 ) 在荧光显微镜下检测杂交的结果。 1 1 3 荧光原位杂交技术的特点 随着荧光原位杂交技术的发展与不断完善，其在植物上应用与研究的优越性越 来越明显：( 1 ) 与用放射性物质来标记探针的分子原位杂交相比，它不需要放射性同 位素，安全可靠，不需特殊方法处理，检测时间短，背景清晰，检测灵敏度高，底 物可长期贮存而不失活：( 2 ) 与其它非放射性原位杂交技术相比，它可用不同荧光素 标记的探针与同一目的d n a 进行杂交，即进行多重标记，一次定位多个d n a 序列； ( 3 ) 杂交信号可逐级放大，进行定量或非定量分析，并且可通过计算机软件图像分析 系统检测并处理杂交微弱的信号，使其可视化更强。 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 2 荧光原位杂交技术的发展概况 总的说来，f i s h 技术的发展沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从 而衍生出许多f i s h 新技术，如m u t i c o l o r f i s h 、c g h 、g i s h 、c i s s 、b a c f i s h 、 c h r o m o s o m e p a i n t i n g 、r r e v e r s ec h r o m o s o m ep a i n t i n g 等等；另一方面则是努力提高 f i s h 技术的分辨率，将靶目标从中期染色体发展到d n a 纤维，使其分辨率由1 m b 发展到几百b p ，这更进一步拓展了f i s h 技术的应用领域，成为分子细胞生物学的一 项代表技术。 1 2 1 不同探针的应用 a ：以基因组为探针的g i s h 技术可以定位外源d n a 片段在染色体上的位置、大 小、插入点等。d u m a m ( 1 9 8 5 ) 首先将g i s h 应用于体细胞杂种的异源染色体检测。 本实验室采用g i s h 方法对棉花四倍体的起源和进化进行了研究。 b ：以不同的荧光素标记探针的多色荧光原位杂交( m u t i c o l o r f i s h ) ，可以同时 定位不同探针序列的分布。1 9 9 0 年n e d e r l o f 等创建了多色荧光原位杂交技术。他们 用生物素、a a f ( 氨基乙酰荧光素) 和c p 三种半抗原对不同探针作单、双、三标 记，再用这三种半抗原相应的分别标记了异硫氰酸荧光素( f i t c ，绿色) 、氨甲香 豆素乙酸( a m c a ，蓝色) 和碱性蕊香红( t r r r c ，红色) 的抗体来检测荧光，该 技术最多可同时观察7 个靶染色体。 c ：以正常基因组d n a 与异常基因组d n a 混合为探针，以正常中期染色体为靶 目标的比较基因组杂交( c o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d i z a t i o n ，c g h ) 技术可以根据两种 探针信号的强度差异找出基因组中d n a 增加或缺失的区域。 d ：以单一染色体文库为探针，以异常染色体为靶目标的染色体涂色技术 ( c h r o m o s o m ep a i n t i n g ) 特别适合于检出染色体多体和易位。 e ：以显微分离的异常染色体区段为探针，以正常染色体为靶目标的反向染色体 涂色技术( r e v e r s ec h r o m o s o m ep a i n t i n g ) 可以确定异常染色体区段的来源。 f 以b a c 、y a c 、c o s m i d 文库为探针，可以同时对多个文库克隆进行定位、定 序。运用b a c f i s h 技术，现已将抗白叶枯病基因x a 2 1 、抗稻瘟病基因p i 2 5 ( t ) 、抗 绿叶蝉基因基因g l h 和抗水稻黄萎病基因r t s v 成功地定位到染色体上。 g ：直接在靶d n a 上以探针为引物进行原位合成的引物原位d n a 合成技术 ( p r i m e di ns i t ud n a s y n t h e s i s ，p r i n s ) 和原位p c r 技术( p c ri ns i t u ) 提高了原位杂 交的效率和检测的灵敏度。 1 2 2 分辨率的提高 为了更精确地进行d n a 序列定位，必须努力提高f i s h 技术的分辨率。它的分 2 利用e s t 序列对- 二倍体棉种染包体物理序譬的f i s h 定位 辨率是指两个不同d n a 探针能够被检测到的最小距离。在决定f i s h 分辨率的因素 中，最重要的是所使用的靶d n a 在染色体或d n a 纤维上的浓缩度( c o n d e n s a t i o n ) 亦即d n a 在染色体结构或d n a 纤维上的三维空间包裹程度，浓缩度越高，分辨率 越低。 a ：早期的f i s h 多以中期染色体作为靶d n a 的载体，它有制片容易，可稳定保 持染色体结构和形态的优点，但它的分辨率只有1 3 m b 。 b ：为了得到浓缩度低的染色体作为靶d n a 的载体，i n a z a w a 等( 1 9 9 4 ) 、h a a f 和w a r d ( 1 9 9 4 ) 分别采用了有丝分裂前期染色体及用离心机械力拉长的中期染色体， 将分辨率提高到2 0 0 k b 左右，但制片困难，提高分辨率的能力有限。 c ：a l b i n i 等( 1 9 9 2 ) 在黑麦粗线期染色体上成功地进行了两个重复序列的定位研 究。z h o n g 等( 1 9 9 6 ) 采用番茄的减数分裂粗线期染色体作为靶目标，进行了d n a 单一序列的定位研究，使分辨率水平达到5 0 1 0 0 k b ，但制片有一定难度。 d ：为了突破f i s h 分辨率的限制，须考虑人为改变染色质的原有空间结构。h e n g 等( 1 9 9 2 ) 用碱性溶胞剂( a l k a l i n el y s i sb u f f e r ) 对处于g 1 和g 2 期之间的间期细胞 核进行处理，释放出游离的染色质丝( f r e ec h r o m a t i n ) ，其f i s h 分辨率水平接近 1 0 k b 。 e ：游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构，但它仍是d n a 和蛋白 质的复合大分子。在h e n g 等( 1 9 9 2 ) 的思路的基础上，w i e g a n t ( 1 9 9 2 ) ，w i n d l e ( 1 9 9 3 ) 进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理，让d n a 分子完全从蛋白质中分 离出d n a 纤维( e x t e n d e dd n af i b e r ) 。通过含高盐的碱性变性剂处理间期的细胞 核( w i e g a n t ，1 9 9 2 ) 、游离的单细胞培养液( p a r r aa n dw i n d l e ，1 9 9 3 ) 或提出的细胞 核( z h o n g ，1 9 9 6 ；s c o t t ，1 9 9 8 ) ，或用p f g e 分离大分子d n a 制备出的d n a 纤维，其 d n a 伸展度都可使f i s h 分辨率达到l k b 甚至更低。 这种高分辨率的f i b e r - f i s h 在应用上有其独到的优势，如分析重叠克隆群 ( h e i s k a n e n ，1 9 9 4 ) 、检测染色体重排( h e i s k a n e n ，1 9 9 5 ) 、判断基因间距离和基因长 度( h e i s k a n e n ，1 9 9 5 ) 、测量长d n a 位点的大小( s h i e l s ，1 9 9 7 ) 并最终加速图位克隆 ( l a a n ，1 9 9 6 ) 。在某些情况下，f i b e r - f i s h 几乎是必不可少的工具，如当进行b a c 重叠克隆群的组装时，由于重复序列的存在、在某些区域没有有效的b a c 文库或由 于低重组率而没有足够的d n a 标记时，将会在物理图谱上形成间隔，几乎在所有 的重叠克隆群的报告中都存在这样的间隔，利用f i b e r f i s h 可以快速地估算出间隔 的大小。f r a n s z 等( 1 9 9 6 ) 通过f i b e r f i s h 在拟南芥上进行了高分辨率物理作图， 分析了包含3 个c o s m i d 的c o n t i g ，覆盖8 9 k b 长的基因组片段。这种方法结合了多色 f i s h ，分辨率达0 7 k b 。 华中农业大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 3 荧光原位杂交在植物研究中的应用 1 3 1 高度或中度重复的d n a 序列的鉴定 由于重复d n a 序列的拷贝数多，探针杂交信号强，检测的灵敏度和准确性较 高，所以利用f i s h 技术来鉴定这些高度重复序列已在许多植物中取得成功。r a y b u m 等( 1 9 8 5 ) 最早将f i s h 技术应用于植物领域，他用一个来自黑麦的1 2 0b p 的重复序 列作探针，检测该序列在小麦染色体上的分布情况。以后许多学者在不同作物上也 开展类似的研究。v a h e d i a n 等( 1 9 9 5 ) 在大豆中利用fi s h 技术对s b 9 2 卫星序列进 行定位分析，检测该重复序列在染色体上的分布情况，对了解基因组的组成和来源 以及物种的进化关系提供了有价值的参考。f l u k u i 等( 1 9 9 4 ) 和o h m i d o 等( 1 9 9 5 ) 用 1 7 sr d n a 作探针，对稻属9 个种的r d n a 位点进行f i s h 定位。结果表明，其中来 自中国或日本的3 个粳稻品种均具有1 个4 5 sr d n a 位点，3 个籼稻品种和3 个爪哇 稻品种分别都有2 个4 5 sr d n a 位点，而野生稻种则含有第3 个位点，这个位点在栽 培稻中不存在。f u k u i 还结合三体材料作进一步分析，将籼稻中的两个4 5 sr d n a 位 点具体定位于第9 和第1 0 染色体的末端。以上的结果与r f l p 作图的结果是一致的。 1 3 2 低拷贝或单拷贝d n a 序列及遗传标记的物理定位 随着原位杂交的的分辨率、灵敏度的不断提高，也使得植物的单或低拷贝基因 在染色体上的定位成为可能。任南、宋运淳等( 1 9 9 8 ) 首次报道了生物素标记的玉 米两个低拷贝基因c d c 2 和p r h l 在体细胞染色体上的定位结果。供试探针为这两个 基因的c d n a 克隆c d c 2z m a 和z m p p l ，其长度分别为1 3 k b 和1 7 k b 。结果表明， c d c 2z m a 的信号分布在第4 、8 和9 染色体上的长臂；p r h lz m p p l 的信号分布在第 4 、6 和8 的长臂。b i 和s o n g 等( 1 9 9 8 ) 人成功的将长度分别为0 8 k b 和0 3 k b 的c a m 和c a 2 + a t p a s e 基因分别定位到了水稻的体细胞染色体上。王玲等( 1 9 9 9 ) 将玉米( z e am a y sl ) 两个广谱抗病基因r i p 和p a l l 成功进行了原位杂交定位，两个基 因长度分别为7 0 0 b p 和5 0 0 b p 。n i n g 等( 2 0 0 0 ) 利用荧光原位杂交技术将长度分别 为1 1 k b 和2 2 k b 的人的抑癌基因p 5 3 和原癌基因c - m y c 的c d n a 探针定位到了玉 米的中期染色体上。随后，刘静宇等人利用f i s h 技术将同样的两个基因定位到了 大麦有丝分裂中期染色体上，并且信号检出率达到了3 0 以上。杨征等( 2 0 0 0 ) 利 用f i s h 技术将长度为6 6k b 原癌基因r a s 成功的定位到了玉米的染色体上。宁顺 斌等( 2 0 0 0 ) 将长度分别为1k b 和1 6k b 的玉米( z e am a y sl ) 过氧化物酶编码基 因p x 和冷调控蛋白编码基因c l d 定位在了玉米的染色体上。n i n g 等( 2 0 0 0 ) 以长 度分别为5 7 k b 和6 6 0 b p 的烟草和拟南芥中的单拷贝抗病基因m y b l 和n d r i 作探 针，利用荧光原位杂交的方法分别将这两个基因定位到了玉米的第8 、5 染色体上。 4 利用e s t 序列对二倍体棉种染色体物理序号的f i s h 定位 韩永华等( 2 0 0 3 ) 人将长度为1 5 k b 的水稻程序性细胞死亡抑制基因d a d 1 定位到 了薏苡的体细胞染色体上。刁英( 2 0 0 4 ) 把长度分别为1 5 0 0 b p 和3 0 0 b p 的玉米b z l 和b z 2 基因成功定位到了莲藕根尖体细胞染色体上。此前，l i 和n i n g 等人也成功 地将这两个基因定位到了玉米体细胞染色体上，并且检出效率高达3 0 。 采用原生质体制片技术，消除细胞壁的影响，s o n g 等( 1 9 9 5 ) 将多个1 k b 左 右的水稻r f l p 单拷贝标记杂交定位到了根尖的体细胞染色体上，供试的r f l p 探 针长度在0 7 3 4 k b 之间。采用生物素标记的染色体原位杂交技术，李立家对与玉 米大斑病抗性基因紧密连锁的两侧两个r f l p 标记u m c 2 2 和u m c l 2 2 进行了定位， 长度分别为7 8 0 b p 和4 9 0 b p 。结果表明，u m c 2 2 和u m c l 2 2 探针都同时与第2 号和第 7 号染色体杂交，而且，u m c 2 2 也和第4 号染色体杂交n o b u k oo h m i d o ( 1 9 9 8 ) 成 功的将1 2 9 k b 的r f l p 序列定位到了水稻第四号染色体上。 随着单拷贝基因片断和分子标记序列在染色体上物理定位的成功，为构建植物 的物理图谱提供了非常有效的方法。可将遗传图谱的分子标记序列直接定位于相应 的染色体上，构建出基因的物理图谱，亦必将大大促进植物的比较染色体图的发展 与完善揭示植物在进化上的来龙去脉，促进重要的经济作物的遗传育种研究。 1 3 3 异源染色质的鉴定 利用远缘杂交手段将有利基因的异源染色质渐渗到植物中形成新的种质，这是 丰富植物种质资源的一条有效途径。r a j a r a m 和m a n n ( 1 9 8 3 ) 将带有几种抗病基因的 黑麦1 r 染色体成功地转移到其他高产小麦品种中从而培育出抗病高产小麦新种质。 异源染色质的有效转移极大地依赖于异源染色质的准确鉴定，而荧光原位杂交技术 则是鉴定异源染色质的有效手段。s c h a w a r z a c h e r 等( 1 9 9 2 1 首次报道了利用f i s h 技 术对异源染色质的鉴定，他们用外源基因组总d n a 为探针，以小麦剩余未标记的 d n a 作封阻进行荧光原位杂交，结果发现标记的异源染色质杂交信号为黄绿色，而 普通小麦染色体反染信号为橘红色，从而快速有效地鉴定出异源染色质。之后，国 内外许多学者利用该技术进行异源染色质的有效鉴定。i s l a m 和m u j e e b ( 1 9 9 5 ) 以外源 基因组总d n a 为探针利用h s h 技术成功地鉴定了小麦黑麦易位系1 b l 1 r s ， 1 a l 1 r s ，5 a s 5 r l 和6 b s 6 r l 。我国张辉和贾继增( 1 9 9 6 ) 禾1 j 用f i s h 和染色体 显带技术成功地检测到小黑麦黑麦附加系。马渐新等( 1 9 9 7 ) 用荧光素标记的簇毛 麦基因组总d n a 作探针，以普通小麦基因组作总d n a 作封阻，与花粉母细胞减数 分裂中期i 制片的染色体进行原位杂交，结果发现抗白粉病小麦品系g n 2 2 是普通 小麦一簇毛麦二体代换系。魏育明等( 1 9 9 9 ) 应用f i s h 和r f l p 标记成功地检测到多 小穗小麦新种质1 卜a 中含有黑麦染色质。颜辉煌等( 1 9 9 9 ) 以药用野生稻总d n a 作探针，利用f i s h 技术从栽培稻药用野生稻的杂交、回交后代中鉴定出4 个单倍 体异源附加系和3 个双倍体异源附加系。 5 华中农业大学2 0 0 6 届硕_ f _ 。学位论文 1 3 4 易位体的鉴定 荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。染色体易位在中期细胞中最容易 被检测到，它们也能在染色体着色后的间期细胞的染色体区域断裂或通过与抗特异 病害断裂点两侧探针的接近而被检测。m u k a i 等首次以基因组d n a 和d n a 重复序 列作探针运用三色原位杂交区分六倍体小麦的3 套基因组，为进一步鉴定更加复杂 的结构变异奠定了基础。含有几种植物染色体类型的体细胞杂种在绘制染色体基因 或建立染色体特异性d n a 序列文库方面是非常重要的资源。然而植物细胞染色体 在培养中可能迅速丢失或重排，因此杂种的标准细胞遗传学特性是十分必要的，这 已用f i s h 很方便地做到。植物中不同种属的非完整染色体可通过特定基因组d n a 杂交而被检测到，在小麦遗传背景下已成功地鉴定出外源染色质，如长穗偃麦草、玉 米、中间偃麦草、黑麦等。同样，杂种d n a 可以直接分离或用p c r 扩增，然后被 用作探针，这项技术非常方便，但中心粒序列或小染色体重排可能不被检测到。 1 3 5 基因组d n af i s h 研究 用杂种一个亲本的基因组d n a 作探针，与杂种进行染色体原位杂交，可有效 地将同源性比较接近的两个染色体组( 如同一属内的不同种之间) 区分开来，这就是 比较基因组杂交( c o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d i z a t i o n ，c g h ) 技术。它采用待测d n a 和参照d n a 进行不同的荧光标记，以相同比例让两者竞争性地与正常染色体进行 原位杂交，检测两种颜色的荧光强度，根据两种颜色的比率情况来显示基因组的结 构状况，如发现两种颜色比率改变，则说明该区域存在d n a 序列的缺失或扩增。 如待测d n a 有过量扩增，则与染色体结合的荧光占优势，信号增强。如待测d n a 有缺失，则只显示参照d n a 所标记的荧光颜色。 基因组d n af i s h 技术在异源多倍体的起源和进化的研究中也得到了广泛的应 用。利用基因组原位杂交( g i s h ) 技术，以标记的白菜型油菜( a a ，2 n = 2 0 ) 的基因组 总d n a 为探针，分别同芥菜型油菜( a a b b ，2 n = 3 6 ) 和甘蓝型油菜( a a c c ，2 n = 3 8 ) 的中期染色体和间期核杂交，结果芥菜型油菜有2 0 条染色体表现大而明亮的杂交信 号，其它染色体上信号很弱或无，可以区分a 、b 基因组；甘蓝型油菜染色体上表现有 3 8 个信号，a 、c 基因组不能区分开来。以黑芥( b b ，2 n = 1 6 ) 的基因组总d n a 为探 针与埃塞俄比亚芥( b b c c ，2 n = 3 4 ) 的中期染色体和间期核杂交，1 6 条染色体上显示 明显的杂交信号，其它染色体上信号很弱。说明在长期的进化过程中，芸薹属中b b 与 a a 和c c 基因组间分化程度较大，而a a 与c c 基因组分化较小。 随着f i s h 技术朝着多色方向发展，g i s h 技术也迅速借用该技术应用于多倍体 物种基因组的同时鉴定。m u k a i 等用生物素标记二倍体a a 基因组祖先种t r o t o c i u r a r t u 总基因组d n a ，地高辛标记二倍体d d 摹因组祖先种ae gi l o pss q u ar r o s a 6 利用e s t 序列对- 二倍体棉种染也体物理序号的f i s h 定位 总基因组d n a ，未标记的总基因组d n a 为可能的b b 基因组祖先种ae gi l o pss p e l t o i d 酷，对六倍体普通小麦( 丁r i t i c u ma e s t i v u m ) 中期染色体进行原位杂交，仅用两 种荧光素就将a 、b 和d 基因组同时显示为黄、棕和橙色。此后s a n c h e z m o r a n 等 利用该技术用不同颜色同时显示小麦黑麦衍生种中的a 、b 、d 和r 基因组。植 物中多倍体现象普遍存在，关于它们的起源与进化路径、距离，许多植物还处于未知 状态，随着研究不断地拓展和加宽，该技术的不断发展，还可能在木本植物中得到 广泛的应用。 1 3 6b a c f i s h 定位 将b a c 克隆与具有高灵敏度的f i s h 技术结合成为一种新的原位杂交技术，即细 菌人工染色体与荧光原位杂交合成技术( b a c f i s h ) 。采用b a c 克隆作为探针进行 染色体原位杂交较低或单拷贝小片段d n a 序列更为容易，而且准确可靠，从根本 上克服了过去单拷贝d n a 杂交信号检出率低的缺点。j i a n g ( 1 9 9 5 ) 等运用b a c f i s h 首次将x a 2 1 成功地定位到染色体上。n a k a m u r a ( 1 9 9 7 ) 等构建与p i t a 2 连锁的8 0 0 k b 的b a c 连接群，通过b a c f i s h 将p i t a 2 定位在水稻第1 2 号染色体的近着丝粒区域 中。同年，g o m e z 等用来源于玉米c d n as h 2 基因筛选高粱b a c 文库，筛选出的b a c 克隆8 6 8 6 通过f i s h 定位在d 型染色体上。y a h 将g l h 、p i 5 ( t ) 和r t s v 几个重要 水稻抗性基因分别定位在第4 染色体的长臂和短臂上。结果表明，b a c f i s h 为分 子细胞遗传学的发展开辟了新的道路，为重要经济作物的物理图谱的发展提供了新 思路。 1 3 7 染色体物理图谱的构建 d n a 序列在染色体上的定位和分子图谱的构建是克隆目的基因的基础。通常采 用d n a 分子标记如r f l p 、r a p d 、a l f p 、s t s 等的遗传分析，从中找出不同d n a 序列之间的连锁遗传关系和相关位置。这种分析方法的准确性和图谱的分辨率水平 取决于染色体减数分裂时d n a 的重组率。但由于重组率在染色体上的分布是不一 致的，着丝点附近的重组率比远离着丝点的常染色质区域低得多，从而造成两个分 子之间的遗传距离( g e n e m i cd i s t a n c e ) 发生偏差。随着f i s h 技术的不断发展和完善， f i s h 技术已成为一种最直接分析d n a 序列在染色体或d n a 分子上排列的细胞分 子遗传学技术，它能有效地弥补遗传距离和物理距离间的偏差，已被广泛地应用于 植物基因结构( g e n o m i co r g a n i z a t i o n ) 的研究和d n a 分子物理图谱( p h y s i c a lm a p ) 的构 建。 1 3 8 亲缘关系 用克隆的种属特异性重复d n a 序列作分子探针进行原位杂交，为研究密切相 关的类群之