（农业昆虫与害虫防治专业论文）Wolbachia对卷蛾赤眼蜂生殖行为的影响及其水平传播初探.pdf

摘要 w o l b a c h i a 是一类广泛存在于节肢动物体内的细胞质遗传细菌，它可以通过诱导产雌孤 雌生殖、引起细胞质不亲和、遗传雄性的雌性化、雄性致死和增强生殖力等作用方式引起 其宿主生殖行为的改变。赤眼蜂( t r i c h o g r a m m as p p ) 是许多种昆虫特别是鳞翅目昆虫的 卵寄生蜂，是目前在生物防治中应用最为广泛的一类寄生蜂。利用w o l b a c h i a 诱导赤眼蜂 的产雌孤雌生殖是提高生物防治效能的有效途径。本研究首先探讨了w o l b a c h i a 与卷蛾赤 眼蜂产雌孤雌生殖行为之间的关系通过高温处理卷蛾赤眼蜂，并结合w o l b a c h i a 的w s p 基因的分子检测发现，高温下卷蛾赤眼蜂体内的w o l b a c h i a 被抑制，4 代以后w s p 基因的 p c r 检测结果变为阴性；同时赤眼蜂的产雌孤雌生殖行为的改变程度也随着世代的增加呈 递增趋势。这显示卷蛾赤眼蜂的产雌孤雌生殖行为与其体内的共生菌w o l b a c h i a 具有一定 程度的相关性。应用显微注射技术对w o l b a c h i a 进行了人工水平转移，以松毛虫赤眼蜂为 受体蜂以卷蛾赤眼蜂为w o l b a c h i a 的供体蜂。根据三次显微注射的结果，注射菌液后的 赤眼蜂的成活率平均值仅为工1 。对完成显徽注射存活的松毛虫赤眼蜂繁育了3 代，逐代 进行了分子检测，从p c r 产物的电泳结果看并没有检测到w s p 基因。另外本文研究了 w o l b a c h i a 是否能通过赤眼蜂一寄主卵的这种寄生关系进行水平传播，根据实验结果可以初 步推断i l b a c h i a 能够通过赤眼蜂寄主卵的这种寄生关系进行水平传播。通过以上研究为 应用显微注射技术人工诱导赤眼蜂的产雌孤雌生殖，提高赤眼蜂的生防效能提供了理论依 据并奠定了实验基础。 关键词tw o l b a c h i a ；赤眼蜂；产雌孤雌生殖；水平传播；显微注射 a b s t r a c t w o l b a c h i ai sam a t e r n a l l yi n h e t i t e db a c t e r i at h a ti n f e c t st h er e p r o d u c t i v et i s s u eo faw i d er a n g e o fi n s e c ts p e c i e s ，a sw e l la si s o p o d s ，m i t e s ，a n dn e m a t o d e s t h i sg r o u po fa l p h a - p r n t e o b a c t e r i u mi s r e s p o n s i b l ef o rv a r i o u sm o d i f i c a t i o n si nh o s tr e p r o d u c t i o n + t h e s ep h e n o t y p a si n c l u d et h ef e m i n i z a t i o n o fg e n e t i cm a l e s ，t h ei n d u c t i o no fp a r t h o g e n e t i cd e v e l o p m e n t a n dm o s tc o m m o n l yt h ee x p r e s s i o no f c y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y t r i c h o g r a m m aw a s p ，w h i c hc a r lp a r a s i t ee g g so fm a n ys p e c i e so f l e p i d o p t e r a ，i st h em o s tw i d e l yu s e de g gp a r a s i t o i dw a s pi nw o r l db i o - c o n t r 0 1 a n di ti sb yi n d u c i n g t h e l y t o k o u sp a r t h e n o g e n e s i st h r o u g hs y m b i o n tw o l b a c h i at h a ti se x p e c t e dt ob ea ne f f e c t i v ew a yt o i m p r o v eb i o - c o n t r o le f f i c i e n c yo ft r i c h o g r a m m aw a s p s b a s e do nm o l e c u l a rd e t e c t i o no fw o l b a c h i a w s pg e n ea n do b s e r v a t i o no fi t sh o s tt r i c h o g r a m m ac a c o e c i a er e p r o d u c t i v eb i o l o g yf o re v e r y g e n e r a t i o n ，e f f e c to fw a s ps y m b i o n t sw o l b a c h i ao nt h et h e l y t o k o u sp a r t h e n o g e n e s i so fzc a c o e c i a e h a sb e e ns t u d i e du n d e rt h ec o n d i t i o no f3 0 f o r1 0g e n e r a t i o n s a f a rc o n t i n u o u sh e a tt r e a t m e n t b e h a v i o ro fzc a e o e c i a et h e l y t o k o u sp a r t h e n o g e n e s i sw a sa l t e r e da n dp c rp r o d u c to fw o l b a e m aw s p g e n et u r n e dt ob en e g a t i v ea f t e r4g e n e r a t i o n s i ts h o w st h a tt h e r ei ss o m er e l a t i o n s h i pb e t w e e nz e a c o e c i a et h e l y t o k o n sp a r t h e n o g e n e s i sa n di t ss y m b i o n t sl 袖i b a c h i n h o r i z o n t a lt r a n s f e ro f 1 _ b l b a e h i a b ym i c r o i n j e c t i o nf r o mzc u c o e c i a ei ot d e n d r o l i m ih a sa l s ob e e ns t u d i e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so f t h e eg e n e r a t i o n so fm i c r o i n j e c t i o n 。t h ea v e r a g eo fs u r v i v a lr a t ei so n l yt o2 1 a n dw s pg e n et h a t w h e t h e ri nt d e n d r o l i m io rn o ta f t e ri n j e c t i o nh a sb e e nd e t e c t e da n dt h ep c r p r o d u c t sa r ea l ln e g a t i v e b e s i d e s ，t h eo t h e rp a r to ft h i sr e s e a r c hs u g g e s t e dt h a tt h e r ei sa n o t h e rw a yo fw o l b a c h i ah o r i z o n m l t r a n s f e rt h a tu n i n f e c t e dp a r a s i t o i dw a s pc a nb ei n f e c t e db yi 砀b a c h ah a r b o u r e di ni t si n f e c t e dh o s t t h ec o n c l u s i o nd r a w ni nt h i sr e s e a r c hw i l lm a k eap r e p a r a t i o no fe x p e r i m e n tt e c h n i q u ea n da c a d e m i c e v i d e n c ef o rf o r t h e rs t u d ya n d 叩p l i c a t i o no fw o l b a c h i ai nt r i c h o g r a m m ai nt h ef i e l do f b i o - c o n t r 0 1 k e yw o r d s ：w o l b a c h i a , t d c h o g r a m m ，t h e l y t o k y , h o r i z o n t a lt r a n s f e r , m i c r o i n j e c t i o n 资助项目 国家自然科学基金项目“赤眼蜂体内共生菌 w o l b a c h i a 的微生态学干预研究”( 3 0 4 7 1 1 6 6 ) 瑞典国际基金( i f s ) 资助项e l ( c 3 2 5 7 1 ) d i s t r i b u t i o n o fw o l b a c h i ai nm a j o rt r i c h o g r a m m aw a s p si nc h i n a a n dh o r i z o n t a lt r a n s f e ro fw o l b a c h i as y m b i o n t sb e t w e e n t r i c h o g r a m m aw a s p s 博士点基金项目“利用w o l b a c h i a 提高赤眼蜂生防效 能的研究”( 2 0 0 2 0 0 1 9 0 1 3 ) 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 黜躲辗刍 帆似年眦日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 毋雪 时间：o p g 年黾f g 日 导师签名：7 屯 亿毒主j 时间：跏口厂年6 月f 多日 第1 章绪论 1 1w o l b a c h i a 简介 w o l b a c h i a 是一类寄生在节肢动物体内可以引起节肢动物生殖行为改变的细胞质遗传的 共生菌。亦称为立克次氏体( o n e i l l 等，1 9 9 2 ；j u c h a u l t 等，1 9 9 4 ) 。w o l b a c h i a 最早是1 9 2 4 年 h e r t i g 和w o l b a c h 在尖音库蚊c u l e xp i p i e n s 的卵巢中被发现的( h e r t i ga n dw o l b a c h ，1 9 2 4 ) 。 h e r t i g ( 1 9 3 6 ) 为了纪念他的合作者w o t b a c h ，于1 9 3 6 年将这种立克次氏体正式定名为w o l b a c h i a p i p i e n t i s 。在此后很长的一段时间里，w o l b a c h i a 的研究并没有得到更多学者的关注。直到1 9 7 1 年，y e n 和b a r r ( 1 9 7 1 ) 发现在蚊子中w o l b c h i a 引起的杂交不亲和现象，即没有w o l b c h i a 共生 的雌蚊的卵经含w o l b c h i a 的雄蚊的精子受精后，受精卵不能存活，有关w o l b c h i a 的研究才逐渐 引起了一些生物学家的兴趣特别是当发现w o l b a c h i a 的侵染及其对宿主的影响还存在于其他 种类的节肢动物中时，w o l b a c h i a 才在世界范围内引起较为广泛的关注，也使得相关的研究逐渐 开展起来。 g b l b a c h i ap i p i e n t i s 属于细菌门、变型菌纲的a 亚纲、立克次氏体目，立克次氏体科、 w o l b a c h i a 属根据1 6 sr d n a 对w o l b a c h i ap i p i e n t i s 的菌系建立系统亲缘关系它被分为了a 和b 两个娄群，并且这两个类群的1 6 s r d n a 基因的序列差异约为2 ，已经表现出了种的差异。 依据触基因建立的系统进化树可将w o l b a c h i a 分为四个类群( a - d ) ( f l e u t y 等，2 0 0 0 ；h o n g 等，2 0 0 2 ；j a m n o n g l u k ，2 0 0 2 ) ，a 和b 类群主要存在于昆虫、螭虫和甲壳类动物中，而c 和 d 类群只在丝虫线虫动物中有过发现( c o r d a u x 等，2 0 0 1 ；b a n d i 等，1 9 9 8 ) 。另外，在弹尾目 的一种跳虫f o l s o m i ac a n a d i d a 中发现的第五种w o l b a c h i a 类群( e ) 和在等翅目的欧洲木白蚁 k a l o t e r m e s f l a v l c o l l i s 及锯白蚁m i c r o c e r o t e r m e s 难中发现的第六种w o l b a c h i a 类群( f ) 仍在进 一步研究和确定中同时，由于e 类群的发现是以进化相对缓慢的1 6 sr d n a 为进化分析依据， 因此，比较根据1 6 sr d n a 和# s z 序列建立进化树的异同对w o l b a c h i a 种群的确立具有十分重 要的意义( c a m p b e l l 等，1 9 9 2 ) 。而根据w s p 基因建立的系统进化树，将w o l b a c h l a 分为a - d 四个总群( s u p e r g r o u p ) 的基础上，又将主要感染昆虫、螨虫及甲壳类动物的a 和b 总群细分 为了1 2 个类群( g r o u p ) ，或称为组。并且，随着新的w o l b a c h i a 菌系的不断发现，依据w s p 基 因序列的差异，又有很多新的类群( 组) 的地位被确定( b o r m 等，2 0 0 3 ：b r a i g 等，1 9 9 8 ；g o n g a n ds h e n ，2 0 0 0 ；w e n e n 等，1 9 9 5 a ，1 9 9 5 b ：z e h o r i 等1 9 9 5 ；z h o u 等，1 9 9 8 ) w o l b e h i a 之所以引起众多学者的广泛关注，最重要的贩因就是其对宿主生殖活动的调控作 用这种调控作用包括诱导宿主细胞质不亲和( c y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y ，c i ) ( b o e r ，1 9 8 2 ) 、 诱导孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s - i n d u c i n g ，p 1 ) ( s t o u t h a m e r 等，1 9 9 0 ) 、遗传雄性的雌性化 ( f e m i n i z i n g ) ( r o u s s e t 等，1 9 9 2 ) 、雄性致死( m a l e - k i l l i n g ) ( j i g g i n s 等，1 9 9 8 ) 和增强雌性繁 殖力和雄性生育力( f e c u n d i t ya n df e r t i l i t y - r o o d i f y i n g ) ( g i r i na n db o u l e t r e a u 。1 9 9 5 ) 。w o l b a c h i a 对其宿主的调控和宿主基因组对这些调控的反应可能暗含着性别决定的进化( r i g a u da n d j u c h a u l t ，1 9 9 3 ) 、物种形成( b r e c u w e r 等，1 9 9 0 ；h u r s t 等，1 9 9 8 ) 和麸生关系的重要机理。 w o l b a c h i a 能够在两个种群之问通过引起细胞质不亲和产生生殖隔离( r e p r o d u c t i v ei s o l a t i o n ) ， 进而分化成两个新种。双向细胞质不亲和被认为是一种特殊的生殖隔离，而单向和双向细胞质 不亲和对因其他原因已分化的两个种群间的生殖隔离有加强作用。因而w o l b a c h i a 在昆虫种群 分化( p o p u l a t i o nd i f f e r e n t i a t i o n ) 和快速的种的形成机制( m e c h a n i s mf o rr a p i ds p e c i a t i o n ) 中具 有重要作用。w o l b a c h i a 导致的杂交细胞质不亲和现象不仅在昆虫进化和分类学中具有重要的意 义而且也为通过遗传操纵的方法防治媒介昆虫提供了一条可行的新思路( 钟江等，2 0 0 3 ) 。另 外利用i # b l b a c h i a 诱导宿主的孤雌生殖也有望成为提高天敌的生防效能的有效途径( p i n m r e a u 等，1 9 9 3 ；s i l v a 等，2 0 0 0 ) 。 越来越多的研究表明w o l b a c h i a 在自然界中具有广泛的分布。w e r r e n ( 1 9 9 5 ) 发现来自巴 拿马的昆虫样本中1 6 以上被w o l b a c h i a 感染。对北美昆虫感染w o l b a c h i a 的频率作的调查， 发现有1 9 3 的昆虫被感染最近，孙晓等( 2 0 0 4 ) 首次发现我国柑橘小实蝇b a c t r o c e r ad o r s a l i s 体内有w o l b a c h i a 的共生利用分子检测技术研究发现，w o l b a c h i a 在昆虫纲的鞘翅目、双翅目、 半翅鑫、鳞翅耳、蛊翅目、蜻蜒目、等翅目、弹尾目( j i g g l n s 等，2 0 0 1 ) 圊翅b ( 莺伟和沈佐 锐，2 0 0 4 ) 中都有广泛分布w o l b a c h i a 不仅存在于余种昆虫中，而且在甲壳纲、蛛形纲中 也有分布。最近又有研究表明在线虫纲中发现了w o l b a c h i a 的共生，因此将w o l b a c h i a 的分布扩 展到了节肢动物门以外的其他门系( b o n n 等2 0 0 3 ；b r a i g 等，1 9 9 8 ；g o n ga n ds h e n 。2 0 0 0 ； w e r r e n 等，1 9 9 5 a ，1 9 9 5 b ：z c h o r i 等，1 9 9 5 ；z h o u 等，1 9 9 8 ) 。迄今己经在8 0 多种昆虫( w e r r e n 等，1 9 9 5 ) 。1 7 种等足目动物( r o u s s e t 等，1 9 9 2 ：j u c h a u l t 等，1 9 9 4 ) 和1 种螨类( j o h a n o w i c z a n dh o y ，1 9 9 5 ) 中发现了这种共生菌获知有w o l b a c h i a 共生的物种数仍在迅速增加，这类细 菌分布的界限尚没有明确结论在动物中。有w o l b a c h i a 共生的物种高达7 6 ( j c y a p r a k a s ha n d h o y ，2 0 0 0 ) 根据对新热带区和新温带区昆虫的普查得到的w o l b a c h i a 检测率推测，w o l b a c h i a 有可能是自然界分布最广、丰度最大的共生菌( w e r r e n ，1 9 9 5 ) 。 1 2w o l b a c h i a 诱导孤雌生殖 s t o u t h a m e r 等( 1 9 9 0 ) 发现共生细菌能够引起一些赤眼蜂品系的孤雌生殖 ( p a r t h e n o g e n e s i s - i n d u c i n g ，p i ) 。通过进一步的研究则发现参与这种诱导作用的是细胞质共生菌 w o l b a c 缸( s t o u t h a l n e r 等，1 9 9 3 a ；s t o u t h a m e r 等，1 9 9 3 c ) 。研究表明w o l b a c h i a 的a 和b 两个 类群中都有p i w o l b a c h i a ，它们存在于许多膜翅目的寄生蜂中，如掠蝇金小蜂m u s c i d i f u r a xs p p ， 赤眼蜂1 h c h o g r a m m as p p ，( s t o u t h a m e r 等，1 9 9 3 ) ：黄蚜小蜂a p h y t i ss p p ，恩蚜小蜂e n c a r s i as p p ， 隆背瘿蜂l e p t o p i l i n as p p ，( l e g n e r ，1 9 8 7 ；s t o u t h a m c r 等，1 9 9 3 ；w e r r e n 等，1 9 9 5 b ；z c h o f i 等，1 9 9 5 ) ：柄瘤蚜茧蜂l y s i p h l e b u ss p p ，( s t a r y ，1 9 9 9 ) ；瘿蜂d i p l o l e p i ss p p ，r h o d t n is p p 。 a y l a c i n is p p ，( p l a n t a r d 等，1 9 9 9 ) 。在膜翅目中，已证实p 陆b a c h a 参与至少柏多个物种的产 雌孤雌生殖( s t o u t h a m e r 等，1 9 9 7 ) 还不清楚w o l b a c h i a 是否能诱导除膜翅目之外其他昆虫的 2 产雌孤雌生殖。 w o l b a c h i a 诱导产雌孤雌生殖的产生是通过对第一次减数分裂的调控实现的( s t o u t h a m e r a n dk a z m c r 1 9 9 4 ) 。有p iw o l b a c h i a 共生的雌性个体所产的卵不经过受精作用即可发育为雌性 后代。含p lw o l b a c h i a 的卵，在第一次减数分裂的后期是不正常的，导致未受精的卵具有双倍 体核。膜翅目和其他一些昆虫类群有着特殊的性别决定系统：单倍体卵发育为雄性，双倍体卵 发育为雌性。不含p iw o l b a c h i a 的卵受精后成为二倍体，发育为雌性；未受精的卵为单倍体， 发育为雄性；而含p iw o l b a c h i a 的卵不经受精。全部发育为雌性，即( 产雌) 孤雌生殖在一 些物种中，内含p iw o l b a c h i a 的个体和不含p iw o l b a c h i a 的个体共同存在。内含p iw o l b a c h i a 的 雌性仍能与不含p iw o l b a c h i a 的雄性交配，在这种交配的情形下，w o l b a c h i a 不干涉正常的减 数分裂过程，单倍体卵受精后成为双倍体( r o u s s e t 等，1 9 9 4 ) p ii 畅b a c h a 的细胞遗传学机制在赤眼蜂中研究的最为深入( s t o u t h a m e ra n dk a z m e r ， 1 9 9 4 ) 第一次减数分裂前期染色体凝缩正常但在中期未分离导致核的双倍性。这一机理即配子 双倍性并导致了各位点的纯合。后续的减数分裂都是正常的配子双倍性在拉美掠蝇金小蜂 m u s c i d i f u r a x u n i r a p t o r 中也有报道( i _ g n e r ，1 9 8 5 ) 要明确p iw o l b a c h i a 如何引起配子双倍性， 需要对此进行详尽的分子生物学和细胞遗传学研究可能的机理包括中心体或纺锤体组成的破 坏纺锤体到染色体的连接，或纺锤体动力学。 由于雄性宿主个体不能传递w o l b a c h i a 给后代，因而雄性个体对于w o l b a c h i a 的共生生活 是多余的所以为了支持w o l b a c h i a 共生生活而对宿主进行生殖调控，诱导其宿主产雌孤雌生 殖- 而利于其传播无疑这种诱导作用对w o l b a c h i a 的传播是十分有利的，是其长期进化的一 种适应性生活策略 1 3 w o i b a c h i a 的水平传播 1 3 1 自然条件下w o l b a c h i a 的水平传播 垂直传播是w o l b a c h i a 的基本传播模式，它是通过母系遗传的方式在宿主的群体中传播扩 散的( p i n t u r e a u 等，1 9 9 8 ：h e u t y 等，2 0 0 0 ) 。已有研究表明，在自然条件下，w o l b a c h i a 在同 种宿主的不同个体问也有水平传播。h u i g e n s 等( 2 0 0 0 ) 通过试验证实，当蚬蝶赤眼蜂 ( t r i c h o g r a m m a 妇咖j ) 的含菌个体和未含菌个体共享同一食物源时，w o l b a c h i a 可由含菌个体 传染给未含菌的同种个体。而且水平传来的w o l b a c h i a 可以在新宿主中垂直传递给其后代。 w o l b a c h i a 在不同种的宿主间亦有不同程度的水平传播。w e r r e n 等( 1 9 9 5 b ) 首次报道了 w o l b a c h i a 在不同种间的水平传播：金小蜂( n a s o n i ag i r a u l t i ) 和它的寄主丽蝇体内都有 w o l b a c h i a 尽管这两种寄主昆虫的亲缘关系较远，但它们所共生的w o l b a c h i a 的系统遗传关系 非常接近。这个发现不仅表明w o l b a c h i a 在不同种间的水平传播，而且显示寄生蜂与其寄主是 3 中田农业大学硕士学位论文 第1 章绪论 一i 一 w o l b a c h i a 种间传播一个可能的传播机制甘波谊等运用w o l b a c h i a 中多态性最高的w s p 基因 检测不同属的飞虱，发现它们感染的w o l b a c h i a 具有相同的w s p 基因序列；并在这几种飞虱的 寄生蜂中发现了同种w o l b a c h i a 的感染( 甘波谊等，2 0 0 0 ) 。另外，在一种寄生蜂蝇蛹集金小蜂 n a s o n i a 和其麻蝇属寄主s a r c o p h a g a 中都含有序列非常相似的w o l b a c h i a ( b o r d e n s t e i n ，2 0 0 0 ) 这些又为w o l b a c h i a 水平传播提供了一个有力的新证据。o n o 等( 2 0 0 1 ) 人在研究卢蛉d i p t e r a 和毛蠓科白蛉亚科p s y c h o d i d a ep h l e b o t o m i n a e 时发现两种亲缘关系很远的卢岭 l u t z o m y i a ( p s a n t h y r u m y i a ) s h a n n o i 和l u t z o m y i a ( n y s s o m y i a ) w h i t m a n i 感染了相同的w o l b a c h i a ， 暗示了这两种卢蛉之间在较近的年代内曾发生了w o l b a c h i a 的水平传播。 w o l b a c h i a 系统进化关系与宿主系统进化关系的比较分析是目前推测w o l b a c h i a 水平传播 采用的主要方法之一通过对w o l b a c h i a 系统发生的研究。直接支持了w o l b a c h i a 在寄主间进行 水平传播的事实。寄主昆虫与其共生菌w o l b a c h i a 间的系统发生缺少一致性联系即可说明这个 问题( t a m a s 等，2 0 0 2 ：w e r r e n ，1 9 9 7 ) 。w e r r e n 等将w o l b a c h i a 的a 总群分为两个亚群，a d m 和a t e ，发现虽然a d m 存在于双翅目、鞘翅目、膜翅目、鳞翅目等不同种昆虫中，但a d m 亚 群表现出高水平的序列相似性，说明a d m 亚群在这些宿主问是水平传播的( w e r r e n 等1 9 9 5 ) 当然，就现在的礤究来看，这穗水平传播仅限于w o b a c h i a 的a 总群，b 、c 、d 总群的w o l b a c h i a 的系统发生与宿主具有一致性。也没有证据表明昆虫和线虫的w o b a c h a 可以相互传播( m a s u i 等，2 0 0 1 ) f t s z 和1 6 sr d n a 序列分析表明：a 类群w o l b a c h i a 的水平传播程度较强。对一些鞘翅目、双 翅目、膜翅目和鳞翅目昆虫体内w o l b a c h i a 的a d i l l 亚群不同族的隔离进往船z 序列分析，可推测出 这些共生菌的分化不超过1 6 m y a ( w e f f c n 等，1 9 9 5 b ) 。而它们各自的昆虫宿主的分化已超过 2 0 0 m y a ( h e n n i g ，1 9 8 1 ) 膜翅目蚜小蜂科的黄蚜小蜂属4 p y 凼的几种寄生蜂中a 类群w o l b a c h i a 的系统进化关系的分析是w o l b a c h i a 水平传播的又一例证( g o t t l i e b 等，1 9 9 8 ) 。b 类群w o l b a c h i a 在不同的宿主种间也有水平传播而线虫中共生的c 、d 类群的w o l b a c h i a 的水平传播程度很低 节肢动物( 主要含a 、b 类群的w o l b a c h i a ) 与线虫( 主要含c 、d 类群的w o l b a c h i a ) 问极少有w o l b a c h i a 的水平传播( b a n d i 等1 9 9 8 ) 。 不同的共生细菌其宿主范围会有差异可以推测：某w o l b a c h i a 与宿主协同进化的时间愈久， 其水平传播的可能性愈低不同系统发育距离的物种间矸留i b 口曲妇水平传播的可能性研究显然是探 索这种共生物与其宿主基因组相互作用模式的有力工具。而且，礅怕n 曲i 口的水平传播途径可以使 其作为载体将特定基因在其宿主种群中扩散传播。 1 3 2 w o l b a c h i a 的人工水平转移 研究w o l b a c h i a 的水平转移对于深入研究w o l b a c h i a 对其宿主生殖行为的调控及其在遗传 工程中的应用有重要的意义。已经有很多学者尝试通过人工的方式进行w o l b a c h i a 的水平转移 目前进行w o l b a c h i a 人工水平转移所采用的主要是显微注射的方法。显微注射技术是在2 0 世纪 4 5 0 年代发展起来的一种精细的实验技术。是指通过微操作装置将外源物质向细胞内或细胞亚结 构内进行注射的一种实验技术自g o r d o n 等1 9 8 0 年首次将显微注射技术用于小鼠受精卵的基 因导入以来。该技术已得到广泛应用。目前显微注射技术仍然是应用最广泛和最为有效的制作 转基因动物的方法。一套完整的显微注射系统包括显微镜、微操作系统、显微注射器和辅助装 置( 拉针仪、烧针仪和磨针器) 四部分。随着生物学的蓬勃发展，特别是分子生物学的兴起，显 微注射技术的应用领域也越来越广泛显微注射技术最多是用于制备转基因动物。此外在人类 疾病的动物模型建立、家畜的品种改良、生物活性物质及药物的生产诸方面均已得到广泛应用。 除了用来注射d n a 分子外，还可用于蛋白质、寡核苷酸、多糖甚至药物的显微注射，也可注 射细胞和细胞的亚组分；接受注射的细胞可以是动物的受精卵、囊胚或悬浮、贴壁的培养细胞。 另外显微注射技术还可以用于遗传、发育、细胞分化、基因的调控与表达和微生物的转移等多 方面基础理论研究 在以往的相关研究中最值得注意的是从白纹伊蚊a e d e a a l b o p i c m s 中将一种b 亚组中引起细 胞质不亲和的w o l b a c h i a 成功转入果蝇中( b n i g 等，1 9 9 4 ) ，这是w o l b a c h i a 在亚目间的人工 转移，而且受体物种不是b 亚组w o l b a c h i a 的自然宿主b o y l e 等( 1 9 9 3 ) 用显微注射的方法 将w o l b a c h i 人为她从其宿主转入了原本没有w o l b a c h i a 共生的物种中在以赤眼蜂为对象的 研究中，c o e n r a d 等( 1 9 9 7 ) 通过使用显微注射的方法使不含w o l b a c h i a 的赤眼蜂感染w o l b a c h i a 。 g r e n l e r 等( 1 9 9 8 ) 实现了p , 函i b a c h a 在寄生蜂中的室内人工水平转移；从t r i c h o g r a m m a p r e t i o s u m 到zd e n d r o l i m i 中进行的w o l b a c h i a 人工水平转移已获得了成功，转入的w o l b a c h i a 在受体蜂繁 殖2 6 代后的检测结果仍然为阳性 1 4w o l b a c h i a 韵分子检测技术 w o l b a c h i a 是典型的细胞内共生菌，至今未有进行体外培养的可行方法，所以很难用传统的 微生物学的方法对其进行研究( w e i s sa n dm o u l d e r ，1 9 8 4 ) ，这极大限制了w o l b a c h i a 研究工作 的开展。在以p c r 为基础的分子检测技术出现之前。曾用d a p i 染色法( 用非特异性的 d n a - b i n d i n g 荧光染料d a p i 染色。然后在荧光显徽镜下观察) ( o n e i l l 等，1 9 9 0 ) 和电镜分析 的方法( l o u i s 等，1 9 8 9 ：1 9 9 3 ) 对w o l b a c h i a 进行观察性检测现代分子生物学的发展大大促 进了w o ! b a c h i a 的研究，尤其是p c r 技术的发展和分子系统学方法的应用使这些细胞内微生物 的鉴别有了重大突破( b r e e u w e r 等，1 9 9 2 ；r o u s s e t 等，1 9 9 2 ：o ，n e i u 等，1 9 9 2 ；s t o u t h a m e r ， 1 9 9 3 ) 。以p c r 为基础的分子检测技术，为w o l b a c l d a 的分布和w o l b a c h i a 的多样性进行系统研 究( a k s o y 等2 0 0 1 ；b r e s s a ca n dr o u s s e t ，1 9 9 3 ) 提供了一些有利的工具。o n e i l 等( 1 9 9 0 ) 用p c r 的方法成功扩增w o l b a c h i a 的1 6 sr d n a 的基因片段，通过对这些分子数据的系统分析 确定了引起a 现象的微生物同属骱b a c d a 并开辟了一个崭新的研究领域。 1 4 1w o l b a c h i a 核糖体d n a ( r d n a ) 基因区 目前，w o l b a c h i a 的1 6 sr d n a 和2 3 sr d n a 的绝大部分序列已经明确和其他大多数细菌 5 中园农业大学硕士学位论文 一 第1 章塑丝 不同的是，w o l b a c h i a 的1 6 sr d n a 和2 3 sr d n a 并不定位在同一区域( b e n s a a d i m e r c h e r m e k 等， 1 9 9 6 ) 。不同w o l b a c h i a 品系的1 6 sr d n a 序列分析所显示的序列差异较小，其值小于3 。w e r r e n 等( 1 9 9 5 a 1 9 9 5 b ) 设计了i 嵇l b a c h i a 的1 6 sr d n a 的特异性p c r 扩增引物( 表1 - 1 ) 。w o l b a c h a 的b 亚组1 6 sr d n a 的p c r 扩增产物为2 5 9 b p ，其中有一个r s a i 酶切位点，若对w o l b a c h i a 的 b 亚组1 6 sr d n ap c r 扩增产物进行酶切将得到1 1 7 b p 和1 4 2 b p 两个酶切片段。 2 3 sr d n a ( r o u s s e t 等。1 9 9 2 ) 和5 sr d n a ( m e e r 等，1 9 9 9 ) 的序列分析也曾用于w o b a c h i a 的研究中。核糖体d n a ( r d n a ) 基因区在w o b a c h a 大尺度的系统关系研究中是非常有价值 的。但由于这个区域的相对保守性，所以并不适于分析p c b l b a c h i a 小尺度的系统发育关系。 塞! ：! 丝墼些垫至旦茎醛壁基! 箜型薹重堡堑! i 塑 i b l b a c h i a 类群正向引物 反向引物 a d m 4 o u p ( 1 6 s a f l 6 s a ：) s - t r c o g c e g g g t r c a c a c a g - 3 5 - t a a g g g a t r a g c ir a g o u t c - 3 ! 壁竺! ! 坚墅! 竺塑! 墨! 里篓塑笆! 里曼竺竺蔓：! 墨! 竺坠坐坚堂里坚塑竖： 1 4 2 尚z 基因 # s z 基因是一种编码细菌细胞分裂蛋白基因，该基因是一种细菌细胞周期基因，参与调控 细胞分裂( l u k e n h a u s 1 9 9 0 ) 不同w o l b a c h i a 品系的f t s z 基因序列分析所显示的序列差异较 大，其值约为1 5 ，使如z 基因成为分析w o l b a c h a 小尺度的系统发育关系的有力的遗传标记 ( w e r r e n ，1 9 9 5 a ：1 9 9 5 b ) 根据俺z 基因序列的分析，w e r r e n 等( 1 9 9 5 a ) 推测i b b a c h a 两 个亚组的分化大约在5 8 - 6 7 百万年以前。而w o l b a c h i a 的a 亚组又分为a d m 和a t c 两个亚群， 分别是根据它们的寄主黑尾果蝇d r o s o 咖a am e 妇聊踯泔和杂拟谷盗t r i b o l i u mc o n f f 口m $ b 来命名 的。m a l l o c h 等于2 0 0 0 年又根据# s z 基因序列，将在绒毛小花甲毋m ，t o m e n t o s u s 中发现的 w o l b a c h i a 列为a 亚组中一个新的a b t 亚群( m a l l o e h 等，2 1 3 0 0 ) 。 根据伽z 基因的侧翼序列，w e r r e n 等( 1 9 9 5 a ) 设计了；t b l b a c h t a 的昭基因p c r 特异性 引物，( w o l b a c h i a 的a 亚组特异引物和w o l b a c h i a 的b 亚组特异引物) ，建立7 节肢动物感染 w o l b a c h i a 的分子检铡技术( 表1 - 2 ) 。这种方法的建立使节肢动物内共生菌w o l b a c h i a 的衄 基因在g e n b a n k 等核酸序列电子数据库的登录迅速增加，迄今在g e n b a n k