（生物化学与分子生物学专业论文）植酸酶高效生产菌株74＃的改良.pdf

摘要 植酸酶是一种可以水解植酸的磷酸酶类，能够分解饲料中的植酸为动物可利用的无机磷和肌 醇，已经在动物营养，人类营养以及酶法合成低磷酸肌醇方面有了很广的应用范围。但目前，提 高植酸酶生产菌株的单位表达量，进一步降低其生产成本仍然是最重要的植酸酶产业目标之一。 本研究以目前植酸酶表达量最高的实际生产菌株7 4 ”为材料，通过共表达二硫键异构酶、透明 颤菌血红蛋白，增加基冈拷贝数等方法，以期进一步提高其表达量，降低生产成本。本研究也对 毕赤酵母表面展示植酸酶进行了尝试。 根据己发表的毕赤酵母来源二硫键异构酶( p d i ) 基因序列，克隆获得p d i 编码基因，并构建了 含有p d i 编码基因的毕赤酵母胞内表达载体p p i c z a - p d i ，以植酸酶生产菌株7 4 # 为受体进行了转 化。从6 0 0 个转化子中筛选到3 个酶活性更高的重组子，其中酶活性最高的4 9 ”菌株其活性是原有 菌株7 4 8 酶活性的1 2 0 ，在5 l 发酵罐中表达活性达到1 6 ，5 8 2u m l 。在此基础上，用经密码子优 化的大肠杆菌植酸酶基因a p p a m ，构建了表达载体p p i c 9 k a p p a m 。以共表达p d i 蛋白的植酸酶 菌株4 9 ”为受体，筛选重组子后得到多拷贝的植酸酶菌株7 9 。，酶活性达到1 7 ，4 3 4u m l ，与共表 达p d i 蛋白的4 9 ”菌株相比，提高了1 0 ；与生产菌株7 4 8 相比，提高了3 4 。 根据已发表的树干毕赤酵母基因组序列克隆了低氧启动子p s a d h 2p r o m o t e r 序列，并根据已 发表的透明颤菌血红蛋白序列，按照毕赤酵母密码子偏爱性对血红蛋白基因进行了密码子改造和 合成。构建了表达载体p p i c 9 k - p s a d h 2 v g b m ，以植酸酶生产菌株7 矿为受体进行了转化。对重 组子进行筛选得到低氧条件下植酸酶活性最高的转化子1 5 ”，利用摇瓶培养，其在低氧条件下的酶 活性是7 4 ”菌株酶活性的4 倍，达到2 4 9u m l 。 另外，本研究对表面展示植酸酶进行了尝试。通过己发表的啤酒酵母基冈组序列克隆了q 凝 集素蛋白a g t t l 编码基因，构建了表达载体p p i c 9 k a p p a m - a g a l ，转化毕赤酵母，对重组子进 行筛选，得到了在酵母细胞表面有植酸酶活性的菌株。 关键词：植酸酶，二硫键异构酶，乙醇脱氢酶启动子，透明颤菌血红蛋白，a 凝集素蛋白， 毕赤酵母 a b s t r a c t p h y t a s e ( m y o i n o s i t o lh e x a k i s p h o s p h a t ep h o s p h o h y d r o l a s e s ) c a nh y d r o l y z ep h y t a t et ol o w e rm y o i n o s i t o lp h o s p h a t e sa n di n o r g a n i cp h o s p h a t ea n dh a se x t e n s i v ea p p l i c a t i o n si na n i m a ln u t r i t i o n ，h u m a n n u t r i t i o na n ds y n t h e s i so fl o w e ri n o s i t o lp h o s p h a t e s o n eo ft h em a i no b j e c t i v e so fp h y t a s ei n d u s t r i a l p r o d u c t i o ni st of u r t h e ri m p r o v et h ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e lo ft h ep h y t a s ep r o d u c t i o ns t r a i na n dr e d u c e i t sp r o d u c t i o nc o s t s u s i n gt h ec o m m e r c i a lp h y t a s es t r a i n # 7 4a st h eh o s ts t r a i n ，w h i c hh a st h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e la t p r e s e n t ，t h r o u g ht h ec o e x p r e s s i o no fp r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s ea n dv h r e o s c i l l ah e m o g l o b i n ( v h b ) ，a n d i n c r e a s i n gt h ea p p a - mg e n ec o p yn u m b e r , w ea i m e da tf u r t h e ri m p r o v i n gt h ep h y t a s ep r o d u c t i o nl e v e l a n dd e c r e a s i n gt h ec o s t s b e s i d e s t h ec e l ls u r f a c ed i s p l a yo ft h ep h y t a s eo npp a s t o r i sw a sa l s ot r i e d a c c o r d i n g t ot h er e p o r t e dg e n es e q u e n c e ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ra j 3 0 2 0 1 4 ) o fd i s u l f i d e i s o m e r a s e ( p d i ) f r o mp i c h i ap a s t o r i s ，t h ep d ie n c o d i n gg e n ew a sc l o n e da n dt h e nl i g a t e di n t ot h ev e c t o r p p i c z a p l a s m i dp p i c z a - p d iw a st h e nt r a n s f o r m e di n t ot h ec o m p e t e n tc e l lo fpp a s t o r i s # 7 4 a m o n g t h e6 0 0p o s i t i v ec l o n e s ，pp a s t o r i s # 4 9h a dt h eh i g h e s tp h y t a s ea c t i v i t yo f16 ，5 8 2u m li na5l f e r m e n t e r , 2 0 m o r et h a nt h a to fpp a s t o r i s # 7 4 w e s t e r nb l o tr e s u l tr e v e a l e dt h a tt h ep d lw a s f u n c t i o n a l l ye x p r e s s e di npp a s t o r i s # 4 9w i t ht h em o l e c u l a rl l l a s so fa b o u t6 5k d r e s u l t i n gi nt h e i m p r o v e m e n to fp h y t a s ep r o d u c t i o n u s i n gt h eec o l ip h y t a s eg e n ea p p a mw h i c hh a sb e e nm o d i f i e d a c c o r d i n gt ot h ec o d o nb i a so f 户p a s t o r i s , t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k - a p p a - mw a sc o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e di n t opp a s t o r i s # 4 9f o rm u l t i c o p yi n t e g r a t i o n a m o n gt h e3 0 0c l o n e s 户p a s t o r i s # 7 9 s h o w e dt h eh i g h e s tp h y t a s ea c t i v i t yo f17 ，4 3 4u m l ，10 h i g h e rt h a nt h a to f 只p a s t o r i s # 4 9a n d3 4 h i g h e rt h a nt h a to fpp a s t o r i s # 7 4 a c c o r d i n gt ot h er e p o r t e ds e q u e n c e ( e m b la c c e s s i o nn u m b e r sy 13 3 9 7a n da f 0 0 8 2 4 5 ) ，t h ea d h 2 p r o m o t e ro f6 0 0b pw a so b t a i n e df r o mp i c h i as t i p i t i s m o r e o v e r , b a s e do nt h ev t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n s e q u e n c e ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rm 2 7 6 0 1 ) ，t h ev g bg e n ew a sm o d i f i e da n ds y n t h e s i z e da c c o r d i n g t ot h ec o d o nb i a so fpp a s t o r i s , w i t h o u tc h a n g i n gt h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fv h b t h ep s a d h 2 一 p r o m o t e ra n dt h ev g b mg e n ew e r ef u s e dt h r o u g ho v e r l a pp c r t h epp a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o r p p i c 9 k p s a d h 2 v g b mw a st h e nc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t opp a s t o r i s # 7 4 u n d e ro x y g e n l i m i t a t i o n ，pp a s t o r i s # 1 5s h o w e dt h eh i g h e s tp h y t a s ea c t i v i t yo f2 4 9u m l ，t h r e et i m e sh i g h e rt h a nt h a t o fpp a s t o r i s # 7 4 b e s i d e s w ea l s o 研e dt h ec e l ls u r f a c ed i s p l a yo fec o l ip h y t a s e b a s e do nt h ep u b l i s h e ds e q u e n c eo f a a g g l u t i n i n ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e rx 16 8 61 ) f r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i a s e ，a g ale n c o d i n gg e n e w a so b t a i n e db yp c ra n de x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k a p p a m - a g a lw a sc o n s t r u c t e d ，a n dt h e n t r a n s f o r m e di n t opp a s t o r i sg s l1 5 p h y t a s ea c t i v i t yw a sd e t e c t e do nt h ey e a s tc e l ls u r f a c e k e yw o r d s ：p h y t a s e ，a p p a ，p r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e ( p d i ) ，p s a d t t 2p r o m o t e r , i s t r e o s c i l l a h e m o g l o b i n ( v h b ) ，0 t a g g l u t i n i n ( a g a l ) ，p i c h i ap a s t o r i s 独创性l 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 序揖冠 时间：溯年月0e l 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 做作者签名：毒坞羟 导师签名膨式 时间：沙口g 年6 月i 口日 时间：厶九，驴年石月口日 中围农、f p 科学院硕十学何论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 毕赤酵母表达系统研究进展 甲醇酵母表达系统是一种近年来发展迅速的外源蛋白表达系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为 唯一碳源和能源的一类酵母，主要有p f 咖i a p a s t o r i s ，c a n d i d ab o d i n i i 、h a n s e n u l a p o l y m o r p h a 三种 ( e g l i ，1 9 8 0 ) ，其中巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 目前使用最为广泛。 巴斯德毕赤酵母作为表达系统具有以下优点( 彭毅，2 0 0 0 ) ：( 1 ) 具有强有力的乙醇氧化酶 ( a l o c h o lo x i d a s e ，a o x l ) 基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；( 2 ) 作为真核表达系统，可对 表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；( 3 ) 营养要求低、生长 快、培养基廉价，便于工业化生产；( 4 ) 可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达1 2 0g l 以上；( 5 ) 表达量高，许多蛋白可达到克每升以上水平；( 6 ) 在户p a s t o r i s 中表达的蛋白既可存在于 细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；( 7 ) 糖基化程度低，与& c e r e v i s i a e 相比，只p a s t o r i s 不产生过度的糖基化。pp a s t o r i s 表达的糖蛋白的糖链长度为8 1 4 个甘 露糖，而曼c e r e v i s i a e 糖链中甘露糖多达5 0 1 5 0 个；sc e r e v i s i a e 分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有 终端a 一1 ，3 糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明显增强，而只p a s t o r i s 的糖基化位点与哺乳类 细胞的相同，其所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。 1 1 1 甲醇代谢途径 甲醇代谢途径是p p a s t o r i s 的重要代谢途径，在p p a s t o r i s 细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代 谢途径所必需的酶，如醇氧化酶( a l c o h o lo x i d a s e ，a o x ) 、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶等( v e e n h u i s m 等，1 9 8 3 ) 。a o x 为甲醇代谢途径的第一个酶，在a o x 作用下，甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢，后 者在过氧化氢酶的作用下分解咸水。所产生的甲醛一部分进入细胞质，经甲醛脱氢酶( f i d ) 和 甲酸脱氢酶( f m d h ) 氧化生成甲酸和二氧化碳，在这一氧化过程中同时产生大量的能量( c r e g gj m 等，2 0 0 0 ；g e l l i s s e n g ，2 0 0 0 ) 。另一部分甲醛经过氧化物酶体中的二羟丙酮合成酶的催化，和来自 细胞质中的5 磷酸木酮糖通过转酮反应生成3 一磷酸甘油醛和二羟丙酮，后者进入细胞质后在一系 列酶的作用下进一步生成5 磷酸木酮糖和3 磷酸甘油，整个反应中1 ，3 的3 磷酸甘油醛经糖异生途 径生成细胞组分。图1 1 表示甲醇代谢途径。 中同农、f p 科学院硕十学位论文第一审绪论 图1 1 毕赤酵母的甲醇代谢途径( c e r e g h i n o 几，2 0 0 0 ) f i g 1 - 1t h em e t h a n o lp a t h w a yi npp a s t o r i s ( c e r e g h i n o 几2 0 0 0 ) 1 1 2 表达系统的组成 1 1 2 1 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载体，但以整合型载体为主。常见的 整合型载体又分为表达胞内蛋白和分泌表达两类，表达胞内蛋白的载体有：p p i c 3 ，p p i c 3 k , p h i l - d 2 ，p p i c z a ( b ，c ) 等；分泌表达的载体有：p p i c 9 ，p p i c 9 k , p h i l s 1 ，p a c 0 8 1 5 ，p p i c z a a ( b ，c ) 等( 马孟根，2 0 0 1 ) ( 表1 1 ) 。这些载体在结构上有共同点：5 a o x l ，m c s , i t , 3 a o x l ，h i s 4 , a m p 抗性基因等( 表1 2 ) 。 表1 - 1 毕赤酵母表达载体 f i g 1 - 1t h ep p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o r s 2 中同农、f k 科学院硕_ 卜学佗论文第一审绪论 表l - 2 毕赤酵母表达载体的结构和功能 f i g 1 - 2t h ef u n c t i o na n ds t r u c t u r eo fp p a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o r s 1 1 2 1 1 启动子 在毕赤酵母中有两个基因a o x i 和a o x 2 编码乙醇氧化酶，a o x i 受甲醇专一诱导且能高水平表 达。当细胞以葡萄糖、甘油和乙醇为碳源时，不能检测到a o x i 的表达，而在以甲醇为唯一碳源时， 该酶可达到细胞可溶性蛋白的3 0 以上。虽然a o x 2 与a o x l 有9 7 的相似性，但a o x 2 的甲醇利用 能力很低( 樊建勇，2 0 0 3 ) 。由于a o x l 在细胞中起主要作用，故多数表达系统都以a o x l 为启动子。 在甲醇诱导下，a o x i 启动子启动目的基因的表达，而当以甘油或葡萄糖为碳源时，a o x i 启动子 处丁阻遏状态。a o x i 启动子由于具有以下优点而成为目前最广泛使用的一种启动子：外源基冈的 表达受阻遏去阻遏机制的严格调控；外源蛋白包括对细胞有毒性的蛋白都能高水平的表达；初始 碳源对外源蛋白表达的阻遏确保了大量表达前菌体的生长；诱导表达易于实现( m a c a u l e y p a t r i c ks 等，2 0 0 5 ) 。但是它也存在着一些缺点，比如甲醇米源于石化产品，不太适宜用于食品行业。 除了a o x i 启动子，其它启动子也被克隆得到并投入使用。这些启动子包撇o x 2 ( a l c o h o lo x i d a s e ) ，d a s ( d i h y d r o x y a c e t o n es y n t h a s e ) ，c u p l ( c o p p e r i n d u c i b l ey e a s tm e t a l i o t h i o n e i n ) ，g a p ( g l y c e r o l l d e h y d e s3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ) ，f l d l ( f o r m a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ) ，i c l l ( i s o c i t r a t el y a s e ) ，p e - x 8 ( p e r o x i n 一8 ) ，y p t l ( r a s l i k es m a l lg t p a s ei n v o l v e di ny e a s tp r o t e i nt r a n s p o r t ) 等。 k o b a y a s h i ( 2 0 0 0 ) 通过添加0 0 1 ( w v ) 油酸将利用a o x 2 启动子表达的重组人血清白蛋白( r h s a ) 表达量提高了1 倍。t o j on ( 2 0 0 8 ) 利用突变了的m a o x 2 启动子在蛋白酶a 缺陷型菌株s m d l l 6 8 表达 了重组的人纤维蛋白素原，并将培养基的p h 值调节至5 5 7 0 ，结果表明重组的人纤维蛋白素原在 毕赤酵母中进行了正确的组装并且有生物学活性。这些实验表明了通过改变培养条件或启动子改 造，a 锨2 启动子也可以成功表达外源蛋白。 t s c h o p pj f ( 1 9 8 7 ) 用来源于p i c h i a p a s t o r i s 的控$ 1 j d a s ( 二羟丙酮合成酶基因) 的假定调控序列 与来源于e c o l i 的缸c z 基因构建了肼s 肠c z 融合序列，并在p i c h i a p a s t o r i s 中进行了表达。结果表明 用来调控这些融合基因表达的机制是一种阻遏去阻遏机制和诱导机制。 k o l l e ra ( 2 0 0 0 ) 利用来源于s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 的c u p l 启动子构建了毕赤酵母整合型表 达载体，并证明了c 卯j 启动子是被铜诱导的而且诱导水平取决于培养基中的铜含量。 3 中国农业科学院硕十学位论文 第一审绪论 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼曼曼皇置曼量皇曼量舅量皇曼鼍量曼曼曼曼喜寡- = - - =|i i 鼍曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼曼曼曼皇 w a t e r h a m 等获得了g a p ( 三磷酸甘油醛脱氢酶) 基因，并利用该基因的启动子构建了组成型表 达载体( w a t e r h a m ，1 9 9 7 ) 。g a p 启动子( p g a p ) 是一种组成型启动子，培养过程中无需更换碳源，可 用于表达对毕赤酵母没有毒性的外源蛋白。尽管使用g a p 启动子时蛋白的表达量不如使用a o x l 启动子时表达量高( b o e rh ，2 0 0 0 ：r a g o nm ，2 0 0 8 ) ，但是由于该启动子不需甲醇诱导，发酵工艺更 简单，所以成为替代p a o x l 的最有潜力的启动子。 依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动子( p f l d l ) ，是一种能以甲醇或甲胺为唯一碳源诱导型启动子， 是一种高水平表达的启动子。这种启动子的优点在于，以甲胺或甲醇诱导f l d l 启动子表达外源蛋 白时，葡萄糖或甘油可代替甲醇为碳源( r e s i n ad ，2 0 0 4 ) 。 m e n e n d e zj ( 2 0 0 3 ) 通过同源p c r 杂交探针的方法从p i c h i a p a s t o r i s 基因组文库中筛选了异柠檬 酸酶基冈( i c l i ) ，并利用i c l l 启动子在毕赤酵母中表达了来源于青酶的葡聚糖酶基因( d e x a ) 。这个 结果说明了在毕赤酵母中表达异源蛋白时，i c l l 启动子可以成为一种较好的选择。 p e x 8 基因编码过氧化物酶体基质蛋白，在葡萄糖存在下为低表达水平，而在甲醇诱导下转为 中等表达水平，这对于表达多哑基蛋白非常重要；y p 基因编码g t p 酶，当以葡萄糖甲醇或甘露 糖醇为碳源时，为低水平组成型表达( l i uh 等，1 9 9 5s e a r si b ，1 9 9 8 ) 。这些启动子是用来表达因 被启动的表达水平过高，而导致蛋白折叠错误或定位错误的一些外源基因( b r i e r l e yr a ，1 9 9 8 ) ，它 们可以启动基因的柔和表达。 1 1 2 1 2 选择标记 选择标记一般有两种：( 1 ) 对应于营养缺陷型受体的野生型基因；( 2 ) 抗性基因。常用的是来源 于毕赤酵母或酿酒酵母的基因。 对应于营养缺陷型受体的野生型基冈有：h 1 s 4 ( h i s t i d i n o ld e h y d r o g e n s e ，组氨酸脱氢酶) ( c r e g g j m ，1 9 8 5 ) ，s u c 2 ( i n v e r t a s eg e n e ) ( s r e e k r i s h n ak1 9 8 7 ) ，a r g 4 ( a r g i n i n o s u c c i n a t el y a s e ，精氨基琥珀 酸裂解酶) ( l i nc e r e g h i n o ，2 0 0 1 ) ，u r a 3 ( o r o t i d i n e5 - p h o s p h a t ed e c a r b o x y l a s e ，5 一磷酸乳清酸核苷脱 羧酶) 和u r a 5 ( o r o t a t e p h o s p h o r i b o s y lt r a n s f e r a s e ，乳清酸磷酸核糖基转移酶) ( n e t tj h ，2 0 0 3 ) 等，是常 见的转化子筛选标记。n e t t ( 2 0 0 5 ) 利用与对应s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 基因的同源性鉴定了毕赤酵 母中的a r g l ，a r g 2 ，a r g 3 , h i s l ，h i s 2 ，h i s 5 和h i s 6 基因，并利用p p u r a 5 - b l a s t e r 作为选择标记， 以克隆的基因序列为基础，构建了一系列敲除载体，获得了相应的营养缺陷型受体菌。 抗性选择标记有：来自转座子t n 9 0 3 的k a n 7 基因( 用抗生素g 4 1 8 来筛选) ；印度斯坦链异壁菌 ( s t r e p t o a l l o t e i c h u sh i n d u s t a n u s ) 来源的s h b l e 基因( 用z e o c i n 筛选) 等，常用于筛选转化后的多拷贝菌 株。 1 1 2 1 3 信号肽 相l l s c e r e v i s i a e 而言，p i c h i a p a s t o r i s 本身的分泌蛋白较少，分泌的外源蛋白可占总分泌蛋白 的9 0 以上，有利于产品的分离纯化，所以分泌表达是一种理想的表达方式。在p p a s t o r i s 载体中 运用最为广泛的信号肽是s c e r e v i s i a e 的a 融合因子的p r e - p r o 前导序列，除此之外，还有转化酶基 因s u c 2 的信号序列、酸性磷酸酶基因p h o i 的信号肽序列以及间质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e ，m m p ) 间质金属蛋白酶组织抑$ 1 j 齐l j ( t i s s u ei n h i b i t o ro fm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e ，t i m p ) 信号 肽序歹i j ( s r e e k r i s h n ak 等，19 9 7 ) 。 酿酒酵母的a 融合因子信号肽包含1 9 个氨基酸的p r e 序列和6 6 个氨基酸的p r o 序列，这其中含有 3 个保守的n 糖基化位点和一个k e x 2 内肽酶识别位点( k u r j a nj 等，1 9 8 2 ) 。信号肽的加工是在内质网 4 中国农、i p 科学院硕十学位论文 第一币绪论 中进行的，包括三个步骤：第一步是信号肽酶去除p r e 信号序列；第二步是k e x2 内肽酶在p r o 序列 的精氨酸和赖氨酸之间进行切割：第三步是s t e l 3 蛋白对谷氨酸一丙氨酸重复序列进行切割。酶切 割位点周同氨基酸序列及外源蛋白的三级结构可以影响信号肽加工效率。c 【融合因子序列分泌效率 高，利用它表达外源基因获得成功的可能性大，尤其对小分子物质，如：抑肽酶、表皮生长因子、 凝血因子等( s r e e k r i s h n a ，1 9 9 7 ) 。 c h a n g 等( 19 8 6 ) 利用s u c 2 信号肽表达人干扰素杂合蛋白。s u c 2 信号肽用于表达不同蛋白时 分泌效果不一样。当s u c 2 信号肽用于细菌来源的热稳定性伍淀粉酶的表达时，分泌蛋白量为 2 5 9 l ，而用a 淀粉酶的自身信号肽时分泌蛋白量仅为0 9g l ( p a i f e r 等，1 9 9 4 ) 。而它用于分泌表 达伍一1 一抗胰蛋白酶( q a t ) 时，只有2 0 的蛋白分泌到胞外，8 0 的蛋白仍滞留在啤酒酵母细胞内 ( m o i r d t 等，1 9 8 7 ) 。 毕赤酵母酸性磷酸酶( a c i dp h o s p h a t a s e ，p h o ) 的信号肽被用来成功表达多种蛋白，如小鼠 5 一h t 5 a 羟色胺酸受体( w e i s s 等，1 9 9 5 ) 和猪胃蛋白酶原( y o s h i m a s um a 等，2 0 0 2 ) 等。 r a e m a e k e r sr j ( 1 9 9 9 ) 发现在尸p a s t o r i s q 表达植物血凝素( p h a s e o l u sv u l g a r i sa g g l u t i n i n ；p h a e ) 时，由s c e r e v i s i a e 的q 融合因子信号肽引导的蛋白处理不完全，在n 端带有多余序列，但是由自身 信号肽引导表达的蛋白正确地分泌和折叠并具有功能活性。p h a e 信号肽还正确引导了g n a ( g a l a n t h u sn i v a l i sa g g l u t i n i n ) 和绿色荧光蛋白( g f p ) 的表达，说明它在毕赤酵母表达时有普遍适用 性。 泛肽( u b i q u i t i n ) 的过度表达可增加在酿酒酵母中整合的人白细胞蛋白酶抑制剂的分泌产量，而 巴斯德毕赤酵母中的分泌产物之一泛肽，据推测也可增加巴斯德毕赤酵母中外源蛋白的分泌。 在巴斯德毕赤酵母的基冈表达系统中，如果外源基因产物不能分泌到胞外，则可将产物连上 一个过氧化物酶体导向信号( p e r o x i s o m et a r g e t i n gs i g n a l ，p t s ) ，使其定向输送到过氧化物酶体，以 免产物积累对宿主细胞产生毒害，同时产物本身的稳定性也会大大加强。w a t e r h a m 等也利用定向 肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将p g a p 启动下的p 一内酰胺酶定向输送到过氧化物酶体( w a t e r h a m h r 等，1 9 9 7 ) 。 还有报道称，在a 交配因子和目的基因之间插入一个间隔肽( s p ) 可以提高外源蛋白的表达 水平。 1 1 2 2 宿主菌株 所有毕赤酵母受体菌都是由菌株n r r l - y 1 1 4 3 0 ( n o r t h e r nr e g i o n a lr e s e a r c hl a b o r a t o r i e s ，p e r - o r i a ，i l ) 演变而来的( 表1 3 ) 。目前使用最广泛的pp a s t o r i s 宿主菌株是c r e g g 在1 9 8 5 年建立的 g s l l 5 ，它们一般具有一个或多个选择标记，因组氨酸脱氢酶基因( 凡醚浮) 的突变而形成的营养缺陷 型宿主菌常作为选择标记。 表1 - 3 常用毕赤酵母菌株 f i g 1 3pp a s t o r i sh o s ts t r a i n s 菌株基冈型表现型 y 一1 1 3 4 0w i l dt y p e s m dl 16 8 h i s 4 ，p e p 4 m u t + ，h i s ，p e p 4 。 s m d l1 6 5 h i s 4 ，p r b lm u t + ，h i s ，p r b l s m d1 16 3 h i s 4 ，p r b l 。p e p 4m u t + ，h i s 。，p e p 4 , p r b l 。 5 中同农、l p 科学院硕i 学位论文 第一章绪论 1 1 2 2 1 甲醇利用表型 根据对甲醇利用的情况，巴斯德毕赤酵母可分为三种表型：( 1 ) 甲醇利用正表型( m u t + ) ，这种 菌株含私o x l 和a o x 2 基因，在含甲醇的培养基内生长正常，g s l l 5 和s m d l l 6 8 的表型就是m u t + ； ( 2 ) 甲醇利用慢表型( m u t 8 ) ，如k m 7 1 菌株，它的a o x l 基冈被取代，a o x 2 虽然与a o x i 有9 7 的同 源性，但在含甲醇的培养基内生长速度比野生型菌株慢：( 3 ) 甲醇利用负表型( m u t - ) ，该型菌株的 a o x l 和a o x 2 基冈完全缺失，不能利用甲醇，如m c l 0 0 3 菌株就属y - m u t 。重组表达载体转化g s l l 5 后，长出的转化子中，m u t + 和m u t 8 两种表型都有，需要在m m 和m d 培养基上鉴定表型。所有这些 菌株都能利用a o x i 启动子进行外源蛋白的表达。 1 1 2 2 2 蛋白酶缺陷型菌株 为了提高分泌蛋白的稳定性，避免被宿主蛋白酶降解，可使用蛋白酶缺陷型菌株，如： s m d l l 6 8 ( h i s 4 p e p 4 ) ，s m d l l 6 5 ( h i s 4 p r b l ) ，s m d l l 6 3 ( h i s 4 p e p 4 p r b l ) 。p e p 4 基冈编码蛋白酶a ，该 酶是蛋白酶b 激活所必需的；p r b l 基因编码蛋白酶b 。p e p 4 、p r b l 基因双缺失会导致这两种蛋白 酶活性显著降低或完全缺失( s r e e k r i s h n ak1 9 9 7 ) 。 1 1 2 3 转化方法 目前相关载体在毕赤酵母的转化主要有四种方法：原生质体法，p e g l 0 0 0 法，电转化法，l i c i 法。其中l i c i 法和p e g l 0 0 0 法简便，但效率很低，不常用。最多用的是电转化法和原生质体法。 其中电转化法最为方便，转化效率最高，所以成为最常用的转化方法。影响电转化效率的冈素有 以下几点：( 1 ) 酵母细胞的质量：制各酵母感受态细胞时酵母细胞要新鲜且浓度要高。( 2 ) 线性d n a 的质量：一般d n a 浓度要求5 2 0 岭为宜。( 3 ) 电击参数：应该根据不同的宿主细胞来调整参数。 巴斯德毕赤酵母细胞一般为：电压2 0 0 0v ，时间6m s 。 1 1 2 4 表达载体在酵母基因组中的整合 导入酵母细胞内的重组表达载体和酵母染色体上的同源区发生重组，从而整合到染色体上， 外源基因能够稳定的存在，并能实现稳定的表达。毕赤酵母的重组可分为两种情况：插入和重组。 一种是利用载体上的选择标记基因( 如且僻) 或5 a o x l 的单一酶切位点，将载体线性化。线性化 后的载体两端的基因组同源序列与基因组发生单交换整合，表达载体以插入的方式整合到染色体 基因组中。a o x l 基因仍然保留，这样得到的转化子表型为m u t + 。另一种是利用3 a o x i 附近的酶切 位点线性化载体，使表达框和选择标记基因的两端为a o x i 的5 $ n 3 端序列，外源基因通过重组替 换了染色体上的a o x l 基因，造成a d x j 缺失，得到的转化子表型为m u t 8 ( 图1 2 ) 。 6 中同农、f k 科学院硕f j 学何论文第一审绪论 专 i i 皿圃囝忽盈_ 盈_ 口i 丑两璃燃群五1 配盈h 匮珏 e x p r e s s i o nc a s s e t t e a 、一 l i n e a r i z e dp l a s m i d p l a s r n l di n t e g r a t e d 拥t og e n a h n e b 图1 - 2 表达载体在酵母基因组中不同的整合方式 f i g 1 - 2t h ei n t e g r a t i o n o fp l a s m i di n t ot h ep p a s t o r i sg e n o m e a g e n ei n s e r t i o na ta o x i ；b g e n er e p l a c e m e n ta ta o x i 1 1 2 5 蛋白质的糖基化 p i c h i ap a s t o r i s 能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰，包括二硫键形成、信号序列加 工、折叠、o 连接和n 一连接糖基化等。糖基化是将寡糖连接到一个蛋白质分子上，是真核生物细 胞在进行基因产物生产时最重要的一种翻译后修饰。在哺乳动物中，o 一连接寡糖链成分复杂，包 括n 乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸等；而酵母的o 连接寡糖链则由单一甘露糖残基组成( 李洪 钊，2 0 0 3 ) 。巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2 个主要特征：( 1 ) 极少出现过度 糖基化。一般情况下p p a s t o r i s 能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链，且较均一，长度 在8 1 4 个之间，使产物更加稳定。( 2 ) 糖链中不含具有潜在致敏作用的a 一1 ，3 甘露糖( m o n t e s i n or ， 1 9 9 8 ) 。然而，一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化。 如人体内合成的胰岛素样生长因子i 为非糖基化蛋白，而由巴斯德毕赤酵母表达时，却有1 5 发生 了糖基化作用( b r i e r l e yr a ，1 9 9 8 ) 。不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副 7 中同农、科学院硕十学伊论文第一帚绪论 作用，解决这一问题的可能方法主要是尝试胞内表达，利用基因工程手段改造糖基化位点( u r b a t s c h il 等2 0 0 1 ) ，用糖苷酶进行处理，降低抗原性( c a l le w a e r tn 等，2 0 0 1 ) 。 影响蛋白糖基化的因素很多：外源目的蛋白的氨基酸序列和三维空间结构决定着潜在糖基化位 点的分布和数目；表达系统中细胞的类型和培养条件等因素决定糖基化所形成的糖链结构。 蛋白质的糖基化主要分n 一糖基化和0 糖基化两种。 1 1 2 5 1 蛋白质的n 一糖基化 由于n 糖基化发生较多且其对许多蛋白质的折叠、药物动力学的稳定性及功能是必需的，故 对其研究也相对较为深入。当蛋白质含有一致性序歹u a s n x a a t h r s e r ( x a a 代表除脯氨酸外的任何 氨基酸) 时，p p a s t o r i s 能对其中天冬氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，即产生n 糖基化。真核细 胞的n 糖基化均起始于内质网，即连接在脂质上的寡糖单位g l c 3 m a n 9 g l c n a c 2 ( g l c 3 为葡萄糖， g i c n a c 2 为n 一乙酰葡萄糖胺) 转移至a s n x s e r t h r 识别的天冬酰胺上，随后寡糖单位被剪切为 m a n 8 g l c n a c 2 。蛋白的n 一连接m a n 8 g l c n a c