专题五2多聚酶链式反应扩增DNA片段ppt课件

多聚酶链式反应扩增DNA片断,温故知新1:,组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？,2,A,G,C,T,1、DNA的基本单位脱氧核苷酸,一、DNA分子的结构,C,G,A,3,4,5,脱氧核苷酸链结构简图,磷酸二酯键,6,5,5,3,3,7,DNA分子的复制过程是怎样的？DNA分子的复制需要哪些条件？,温故知新2,8,2、时间：,细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期）,1、概念：以亲代DNA为模板，根据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。,3、场所：主要是细胞核（其次是线粒体、叶绿体）,二细胞内DNA复制的过程,9,4、条件：,模板：亲代DNA的两条母链原料：游离的四种脱氧核苷酸能量：ATP酶：解旋酶、DNA聚合酶引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,5、过程,（1）解旋：解旋酶、ATP,（2）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。,（3）子链、母链螺旋构成子代DNA,10,6、复制特点,半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。,7、DNA复制的方向,DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,11,12,1、PCR（多聚酶链式反应）技术：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2、原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。,一、基础知识（一）PCR原理：,13,体内DNA复制与PCR的技术区别：,14,DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA),3、PCR反应的条件,80100：,耐热的DNA聚合酶：,缓冲溶液：维持反应的pH值不变,(一般是一小段单链DNA),15,(二)PCR反应的过程,1、变性：,温度上升到90以上时,双链DNA解聚成为单链。,2、复性（退火）：,温度下降到50左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。,3、延伸：,温度上升到72左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。,16,PCR循环第一步：加热变性:双链DNA解聚成为单链,17,PCR循环第二步：引物与模板序列复性（退火）:引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,18,PCR循环第三步：引物延伸:合成新的DNA链,19,模板序列,模板序列,第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的序列,20,30次循环后扩增的数量,21,4、PCR循环的结果,DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。,22,第一轮结果,1,2,3,4,1,2,3,4,第二轮结果,23,二、实验操作,1、PCR仪,（一）设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器。,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。,24,PCR仪,25,26,1、准备,2、移液,（二）实验操作步骤,按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上,用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂,27,过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。,注意：,3、混合,B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。,A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。,28,将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。,4、离心,5、反应,离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。,29,30,PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：,6、注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,一次性吸液枪头用一次更换一次。,31,（一）理论上DNA扩增数目的计算,三、课题成果评价,1、一条DNA，复制n次，DNA为：2n,2、a条DNA，复制n次，DNA为：a2n,（二）实验中DNA含量的测定,1、原理,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。,32,2、过程,稀释,2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。,取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。,计算,33,计算,DNA含量（g）50 x（260nm的读数）x稀释倍数,公式中50的含义：50g/ml的DNA在标准厚度为1cm比色杯中的吸光值为1。,34,比色杯,35,（三）DNA片段扩增失败的原因,可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。,36,四、课题延伸,例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。,PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异性强、敏感性高、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点。,37,五、实验小结,PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,模板,互补,Taq聚合酶,四种脱氧核苷酸,引物,变性、复性和延伸,72,38,课堂小结,39,练习巩固,1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,40,2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一