（生物物理学专业论文）模拟微重力对斑马鱼胚胎发育及microrna表达的影响.pdf

、弋 j 、1， 1 e f f e c to fs i m u l a t e d - m i c r o g r a v i t yo nz e b r a f i s he m b r y o n i c d e v e l o p m e n t a n dm i c r o r n ae x p r e s s i o n at h e s i ss u b m i t t e dt o d a l i a nm a r i t i m eu n i v e r s i t y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e b y l ih u i ( b i o p h y s i c s ) t h e s i ss u p e r v i s o r ： p r o f e s s o rs u n y e q i n g m a y 2 0 1 1 j l l f _ i 吖 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究：i ：作所取得的成果， 撰写成博硕士学位论文“搓拯堂重么盟逛璺鱼! ! 脸蕉直及堡i 堡! q 型盔选曲毖 响”。除论文中已经注明引用的内容外，对论义的研究做出。醺要贡献的个人和集 体，均已在文中以m j 确方式标明。本论文中刁i 包含任何木加明确注明的其他个人 或集体已经公j i ：发表或末公，r 发农的成果。本卢明的法律责任t - f 1 本人承担。 学位论文作者签名：缝 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有天保留、使用研究牛学 位论文的舰定，即：大连海事大学有权保留并向阁家有灭部门或机构送交学化论 文的复印件和电子版，允许：论义被查阅和借阅。本人授权人连海雨人学町以将本 学位论文的全部或部分内锌编入有关数据库进 j 二枪索，也可采用影印、缩印或手i 拙等复制手段保存和? l ：编学化论文。意将本学化论文收录到中幽优秀博顺上 学位论文全文数据库( 中国学术期f ：0 ( 光盘版) 电子杂j 占礼) 、巾闯学位论 文全文数据库( r 1 因科学技术信息研究所) 等数据库巾，并以电j 三出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权。f 弓。 不保密囱( 请在以j ：方框内打“”) 论文作者签名：座惫 导师签名： 吆 h 期口。f 年舌月拶17 9 t f d 7 j 噜 中文摘要 摘要 太空环境是一个复杂、多变而极端的环境，具有多种辐射、微重力、弱磁场 等特点，其中微重力是宇航员在太空环境中所面对的最大障碍之一，因此微重力 的生物学效应的研究成为科学家们所关注的最重要的太空问题之一。 本论文以斑马鱼( d a n i or e r i o ) 胚胎作为地面模拟微重力效应的研究模型，采 用美国航天航空局( n a s a ) 研制的微重力模拟系统( r o t a r y c e l lc u l t u r es y s t e m ， r c c s ) ，对不同发育时期的斑马鱼胚胎进行模拟微重力处理，从表型和基因表达两 个层面上探讨模拟微重力对斑马鱼产生的生物学效应。结果表明，在表型水平上， 模拟微重力可以导致斑马鱼胚胎发育的畸形和死亡比率增加；体长在重力恢复的 短期内变长，1 0 天后恢复到正常水平；心率在微重力处理过程中及重力恢复的短 期内有所加快，但7 天后恢复到正常水平。在基因表达水平上，应用m i c r o a r r a y 对斑 马鱼胚胎在模拟微重力条件下的m i c r o r n a 表达谱进行分析。结果表明，在不同发 育时期对斑马鱼胚胎进行模拟微重力处理，以及对发育时期相同的斑马鱼胚胎进 行不同时长的模拟微重力处理，均可导致m i c r o r n a 表达谱的改变；在三组不同的 微重力处理实验中( 8 - 7 2 h p f , 2 4 7 2 h p f 和2 4 - 4 8 h p f ) ，共发现9 个m i c r o r n a 的表达出 现显著变化，用于后续m i c r o r n a 靶基因的预测和通路分析。靶预测结果表明， m m r o r n a 2 0 4 ，- 4 2 9 和2 2 a 表达上调，m i c r o r n a 一16 a 表达下调，由于其靶基 s g c g 与心肌细胞缺陷，肌肉萎缩，导致心律不齐，心脏功能下降有关，因此本研究发 现的微重力引起的其对应的斑马鱼心率的增加，可能和这些m i c r o r n a 上调有关。 研究发现的m i c r o r n a 7 3 8 ，1 3 3 b ，。9 木和1 3 3 a 表达上调，它们对应的靶基因n r a r p a ， 能间接影响n o t c h 通路和w n t 通路，而这两个通路都是机体形态发生和发育的重要 机制，因此是否与模拟微重力产生的胚胎畸形率和死亡率增加有关联，是非常有 必要进一步分析的问题。 另外，本论文还应用r e a l t i m e p c r 的技术，对前期模拟微重力蛋白表达谱研 究中获得的差异表达蛋白质对应基因的表达水平进行了定量分析。被检测的基因 包括肌肉 2 ( a c t a 2 ) ， 因在不同 增殖蛋白 肌酸激酶 蛋白质表 与的调控 究。 关键词： 1 一 a b s t r a c t s p a c ec o n d i t i o n sa r eac o m p l e xs e to fp h e n o m e n ai n v o l v i n gm u l t i r a d i a t i o n ， m i c r o g r a v i t ya n dw e a km a g n e t i cf i e l de t c a m o n g s ta l lt h e s ep h e n o m e n a ，m i c r o g r a v i t y i sac o n s t a n tp h y s i c a lf a c t o ra s t r o n a u t sm u s tm e e td u r i n gs p a c ef l i g h t t h e r e f o r e ，t h e m e c h a n i s mo fm i c r o g r a v i t y - i n d u c e db i o l o g i c a le f f e c t si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n t i s s u e si ns p a c eb i o l o g i c a ls t u d i e s i nt h i sp a p e r ，z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) e m b r y o sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e s w e r ee x p o s e dt os i m u l a t e d m i c r o g r a v i t y ，r e s p e c t i v e l y ，u s i n gar o t a r yc e l lc u l t u r es y s t e m ( r c c s ) d e s i g n e db yn a t i o n a la e r o n a u t i c sa n ds p a c ea d m i n i s t r a t i o n ( n a s a lo f a m e r i c a b i o l o g i c a le f f e c t so fs i m u l a t e dm i c r o g r a v i t yo nz e b r a f i s he m b r y o sw e r e i n v e s t i g a t e da t t h ep h e n o t y p i ca n dg e n e e x p r e s s i o nl e v e l s m a l f o r m a t i o nr a t ea n d m o r t a l i t yr a t ew e r ef o u n di n c r e a s e da f t e rs i m u l a t e dm i c r o g r a v i t ye x p o s u r e b o d yl e n g t h a n dh e a r tr a t ew e r ea l s oi n c r e a s e dd u r i n gm i c r o g r a v i t ye x p o s u r ea n da f t e ras h o tp e r i o d o fg r a v i t yr e c o v e r y ，b u tb o t hr e t u r n e dt on o r m a ll e v e la f t e r 10d a y sa n d7d a y so f g r a v i t yr e c o v e r y ，r e s p e c t i v e l y a tg e n ee x p r e s s i o nl e v e l ，m i c r o r n ae x p r e s s i o np r o f i l e s o fz e b r a f i s h e m b r y o se x p o s e dt os i m u l a t e d - m i c r o g r a v i t yw e r ea n a l y z e d u s i n g m i c r o a r r a y s r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h em i c r o r n ae x p r e s s i o np r o f i l e so fz e b r a f i s h e m b r y o sv a r i e d ，d e p e n d i n go nt h ed e v e l o p m e n ts t a g e so fe m b y o se x p o s e dt os i m u l a t e d m i c r o g r a v i t ya n dt h ee x p o s u r et i m e a l lt o g e t h e r , n i n em i r n a ss h o w e ds i g n i f i c a n t c h a n g e sa f t e rt h r e ed i f f e r e n tm i c r o g r a v i t ye x p o s u r e ( 8 - 7 2 h p f , 2 4 - 7 2 h p fa n d2 4 - 4 8 h p f ) ， a n dw e r es u b s e q u e n t l yu s e di na n a l y s i so fm i c r o r n a t a r g e ta n dp a t h w a yp r e d i c t i o n t h er e s u l t so ft a r g e t p r e d i c t i o ns h o w st h a t ，m i c r o r n a 2 0 4 ，- 4 2 9a n d 2 2 a e x p r e s s i o nu p 。r e g u l a t e d ，m i c r o r n a - 16 ae x p r e s s i o nd o w n r e g u l a t e d ，a st ot h e i rt a r g e t g e n es g c gw a sr e l a t e dt oc a r d i o m y o c y t ed e f e c t s ，m u s c u l a ra t r o p h y ，a n dl e a d i n gt o a r r h y t h m i a ，d e c l i n ei nc a r d i a cf u n c t i o n ，i n c r e a s i n go fh e a r tr a t eo fz e b r a f i s hu n d e r m i c r o g r a v i t yi nt h i sp a p e rm i g h tb er e l a t e dt ot h e s em i c r o r n a s u p - r e g u l a t e d m i c r o r n a - 7 3 8 ，1 3 3 b ，。9 幸a n d 一1 3 3 ae x p r e s s i o nu p - r e g u l a t e d ，t h e i rt a r g e tg e n en r a r p a i n d i r e c t l ye f f e c t sn o t c hp a t h w a ya n dw n tp a t h w a y t h e s et w op a t h w a y sa r e t h e s i g n i f i c a n tm e c h a n i s ma b o u tm o r p h o g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n t ，t h e r e f o r e ， w h e t h e ri n c r - v 一 英文摘要 e a s i n go fm a l f o r m a t i o nr a t ea n dm o r t a l i t yr a t ew a sr e l a t e dt ot h i ss i g n i f i c a n tm e c h a n i s m n e e d sf u r t h e rs t u d i e s i na d d i t i o n ，t h em r n a e x p r e s s i o nl e v e l so ff i v ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n s ， o b t a i n e df r o mo u rp r e v i o u s s i m u l a t e d - m i c r o g r a v i t yr e s e a r c h ，w e r ea n a l y z e du s i n g q u a n t i t a t i v ep c r ( r t - q r c r ) t h ef i v e g e n e s ，i n c u l d i n gc r e a t i n ek i n a s em u s c l ea ( c k m a ) ，p r o t e a s o m e2 6 ss u b u n i tn o n - a t p a s e8 ( p s m d s ) ，a c t i na l p h a 2 ( a c t a 2 ) ，t u b u l i n b e t a2 c ( t u b b 2 c ) a n dp r o h i b i t i n ( p r o h i b i t i n ) ，d i s p l a y e d d u r i n gd i f f e r e n ts i m u l a t e d m i c r o g r a v i t ye x p o s u r e s ，t h em r n ae x p r e s s i o nl e v e l so fa c t i na l p h a 2 ( a c t a 2 ) ，t u b u l i n b e t a2 c ( t u b b 2 c ) a n dp r o h i b i t i n ( p r o h i b i t i n ) d o w n r e g u l a t e d ，h a dt h es a m e t r e n d st ot h e p r o t e i n s ；t h em r n ae x p r e s s i o nl e v e l so fc r e a t i n ek i n a s em u s c l ea ( c k m a ) ，p r o t e a s o m e 2 6 ss u b u n i tn o n a t p a s e8 ( m i n d s ) d o w n r e g u l a t e d ，h a d d i f f e r e n tt r e n d st ot h ep r o t e i n s w es u p p o s e di nt h el e v e lo fg e n e t r a n s c r i p t i o n a n dp o s t t r a n s c r i p t i o n t r a n s l a t i o n e x i s t e dr e g u l a t e dm e c h a n i s mo t h e rm o l e c u l a r i n v o l v e d h o w e v e r w h e m e rt h i s r e g u l a t e dm e c h a n i s mw a sr e l a t e dt om i e r o r n an e e d sf u r t h e rs t u d i e s k e yw o r d s ：s i m u l a t e d 。m i c r o g r a v i t y ；d a n i o r e r i o ；e m b r y o n i cd e v l o p m e n t ； m i c r o r n a ；g e n ee x p r e s s i o n 、 ， v 引 第1 第2 目录 2 2 11 目标基因m r n a 表达水平的检测3 3 2 2 1 2 数据处理3 3 第3 章结果与讨论3 4 3 1 微重力效应的模拟3 4 3 2 模拟微重力对斑马鱼胚胎发育表型的影响3 5 3 2 1 模拟微重力处理后致畸率与死亡率的变化3 5 3 2 2 模拟微重力处理后心率的变化3 7 3 2 3 模拟微重力处理后体长的变化4 0 3 3 模拟微重力对斑马鱼胚胎m i c r o r n a 表达的影响4 l 3 3 1m i c r o r n a 差异表达谱分析4 1 3 3 2m i c r o r n a 靶基因的预测4 4 3 4 单枚胚胎总r n a 的提取及浓度测定4 8 3 5e d n a 模板质量的验证4 9 3 6r e l a t i v eq u a n t i t a t i v e p c r 检测体系优化结果5 0 3 7r e l a t i v eq u a n t i t a t i v e p c r 检测结果及数据分析5 1 3 7 1p r o t e a s o m e 2 6 sn o n - a t p a s e8 ( p s m d s ) 的m r n a 表达水平51 3 7 2t u b u l i n b e t a2 c ( t u b b 2 c ) 的m r n a 表达水平5 3 3 7 3m u s c l e s p e c i f i cc r e a t i n ek i n a s e ( c k m a ) 的m r n a 表达水平5 5 3 7 4p r o h i b i t i n ( p h b ) 的m r n a 表达水平5 7 3 7 5a c t i n ，a l p h a 2 ( a c t a 2 ) 的m r n a 表达水平5 9 结论与展望6 4 1 结论6 4 2 展望6 5 参考文献一6 6 附录原始数据7 4 攻读学位期间公开发表论文8 0 致谢8 l 研究生履历8 2 【j p 模拟微重力对斑马鱼胚胎发育及m i c r o r n a 表达的影响 己i 吉 丁i口 随着航天事业的快速发展，宇航员在太空环境停留的时间越来越长，而宇航 员在太空飞行中，受到各种太空环境的影响，主要包括多种辐射，微重力，高真 空，温差大，弱磁场等。太空环境中重力的改变能够造成机体的生理改变，可以 导致许多脏器长期或短期的功能异常，如体液重新分布、肾小球滤过增加、心血 管功能改变、肌肉萎缩、骨质丢失、代谢紊乱、免疫功能的改变等。其中微重力 所致宇航员骨质的丢失是航天事业所面临的最严重的问题之一，也是长期太空飞 行最大的障碍之一。然而，尽管目前对于微重力生物学效应的研究较多，但微重 力对机体产生的分子机制尚不清楚。 本文以斑马鱼( d a n i or e r i o ) 胚胎作为地面模拟微重力效应的研究模型，采用美 国航天航空局( n a s a ) 研制的微重力模拟系统( r o t a r yc e l lc u l t u r es y s t e m ，r c c s ) ， 对不同发育时期的斑马鱼胚胎进行模拟微重力处理，并从发育和生理指标、基因 表达及m i c r o r n a 表达调控三个层面上探讨模拟微重力对斑马鱼产生的生物学效 应及可能的分子机制。 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 微重力生物学效应的研究现状 1 1 1 微重力生物学效应的研究 近年来，随着登月工程计划和火星探测等一系列太空探测计划的实施和发展， 未来人类飞行太空的频率会越来越多，驻留太空的时间也会越来越长。2 0 0 8 年9 月2 5 日，中国的神舟七号飞船顺利地发射成功，2 7 日翟志刚等3 名航天员成功出 舱，完成了中国太空史上的第一步。由此，空间的复杂环境对航天员健康的影响 成为了当前航天员们所面临和关注的严峻问题之一。 太空环境主要包括高真空，多种辐射，微重力，温差大，弱磁场等特点。而 宇航员在太空环境中进行活动时所受到的最大障碍便是微重力。地球上的生物是 在1 g 的重力环境中生长和发育的，重力的改变必然会对其生命活动带来影响。一 般说来，微重力状态会导致人体许多脏器长期或短期的功能异常，例如引起生物 体内流体的重新分布，增加肾脏过滤的能力，心血管功能失调，骨质恶化、丢失， 肌肉萎缩，代谢功能紊乱，免疫系统功能损伤【l 】等。一些简单的空间运动病仅对短 期航天飞行产生明显影响，一般采用药物即可预防其发生【2 】，但是对于一些复杂的 生理和病理的改变，通常不能通过充分地物理锻炼和营养补充来对抗，表明微重 力造成的生理及病理性改变可能是由于分子机制所调控的。 1 1 1 1 微重力对骨骼的影响 美国和俄罗斯的相关部门很早就开始研究空间飞行中骨变化所引起的潜在问 题。美国人类太空飞行计划开始于1 9 6 2 年，随后，多次空间飞行任务证实了空间 飞行时受到的微重力会造成骨骼中钙的流失。骨密度的检测显示，航天员每月平 均有o 5 2 的骨质丢失。在承重骨( 跟骨、胫骨、股骨、椎骨) 比非承重骨( 挠 骨、尺骨) 严重【3 】。而脊柱，股骨颈、股骨粗隆和盆骨中骨密度每月损失1 0 1 6 。 骨的生长代谢包括两个途径：一是骨的形成，另一个是骨的重建和吸收。骨 形成和骨重建的过程在人体内呈动态的平衡，使得骨组织不断的自我调整和自我 模拟微重力对斑马鱼胚胎发育及m i c r o r n a 表达的影响 更新。研究表明，微重力条件下骨形成的代表分子i 型胶原、骨碱性磷酸酶和骨 钙素明显下降，而骨吸收的代表分子一前胶原c 端肽、脱氧吡啶呈正常水平或仅 轻度升高，因此骨形成减少和骨基质成熟障碍是微重力引起骨丢失的根本原副4 1 。 除上述个体水平的研究外，细胞水平的研究也在空间搭载或模拟微重力装置 上广泛开展。目前己对人，大鼠和小鼠的多种骨细胞在微重力条件下的生长、代 谢和基因表达调控等方面进行了深入研究。2 0 0 5 年，p a r d o 实验室利用随机定位仪 ( r a n d o mp o s i t i o n i n gm a c h i n e ，r p m ) 检测到了模拟微重力抑制前体成骨细胞( 2 t 3 ) 的分化和改变其基因的表达，发现a l p 、r u n x 2 、p t h l r 、o m d 、c t s k 、o s t e r i x 基因表 达下调【5 1 。2 0 0 9 年，该实验室利用低强度高频率装置( m a g n i t u d ea n dh i g hf r e q u e n c y m e c h a n i c a ll o a d i n g ，l m h f ) 和r p m 装置迸一步对2 t 3 细胞进行了微重力条件下基 因表达和重力恢复后基因表达的研究【6 】。 我国在微重力骨细胞生物学效应的研究方面也取得了一定的成果。张晓铀等【j 7 】 利用回转器模拟微重力，观察测定了成骨样细胞的增殖、周期的变化以及恢复作 用，发现模拟微重力条件下，成骨细胞增殖受到明显抑制，g 1 期细胞显著增多， s 与g 2 m 期细胞显著减少。模拟微重力处理1 2 h 后，再经过1 2 h 以上的正常生长， 细胞周期可恢复至正常水平。张舒等【8 】利用回转器模拟微重力培养大鼠骨肉瘤细 胞，观察骨肉瘤细胞内i 型胶原的基因和蛋白表达的变化，发现模拟微重力处理 7 2 h 后细胞内i 型胶原的m r n a 和蛋白表达量均明显降低。 综上所述，骨细胞如何感受，以及微重力所致骨质丢失的具体机制尚不十分 清楚，有待进一步研究，但微重力可致骨代谢失平衡即骨吸收增强和骨形成 功能降低已在人和动物的太空搭载或地面微重力模拟实验中得以证实。 1 1 1 2 微重力对肌肉的影响 研究表明，在太空飞行前几周内会出现骨骼肌萎缩，肌肉缺乏力量强度的现 象。这种肌肉萎缩的现象主要是由失去重力负荷而使蛋白质合成减少所致。有报 告指出【9 】，飞行后的蛋白合成比飞行前的要减少1 5 ，肌纤维的横断面积减少 2 0 5 0 。也有文献报道【1 0 】，在太空飞行2 周后，肌肉质量减少2 0 ；在飞行3 - 6 个月后，肌肉质量减少3 0 。2 0 0 0 年，r o b e r th f i t t s 等人解释了微重力对肌肉萎 第1 章绪论 缩所产生的基本原理。在微重力条件下，收缩蛋白与其他细胞中的蛋白比例失衡， 并且肌动蛋白的细肌丝与肌球蛋白的粗肌丝也出现比例失调。收缩蛋白的减少使 得大量的横断面面积减小，而细肌丝减少可导致在飞行后i 型、i ia 型肌纤维大幅 度地缩短。微重力诱导的力量强度的降低可部分地通过增加肌纤维的强度来抵消 【1 1 】。因此微重力通过诱导慢肌纤维中快速型肌球蛋白同工酶的表达和快速i i 型肌 纤维的表达来增加肌肉强度。太空飞行会增强骨骼肌损伤的敏感性。以上结果表 明空间飞行和后肢悬吊会导致有选择性的收缩蛋白合成减少，以及在收缩与调节 蛋白中的快慢转变【1 2 1 。已有实验表明，太空飞行会导致大鼠疲劳性的增加及骨骼 肌中脂肪氧化能力的减少。 2 0 0 1 年，r o b e r t 等【l3 】对大鼠和人经过太空飞行后，骨骼肌的结构和功能进行 了研究。发现微重力会导致细胞质量的快速减少。在大鼠中，肌肉的质量在飞行1 周内减少了3 7 。同时在两个物种中都发现，抗重力的跟腱肌比快速收缩的腓肠 肌更容易发生萎缩的现象。在大鼠中，慢速i 型肌纤维的萎缩比快速i i 型肌纤维 严重，而在人类中，快速i i 型肌纤维的萎缩与慢速肌纤维则基本没有变化。d a n n y 等【1 4 】对4 名宇航员在飞行1 7 天后，显微镜观察他们跟腱肌纤维飞行前与飞行后的 变化。发现粗肌丝的密度没有发生变化，而细肌丝密度发生明显减少。细肌丝密 度的下降会使粗肌丝一细肌丝之间的间距增大，也会过早地促使横桥断裂和肌节快 速收缩。 一直以来，人们都在个体水平上研究微重力对肌肉的影响，直到2 0 0 0 年， g r a d a m s 等【1 5 】在分子水平上研究微重力对肌肉的生物学效应。他们将新生大鼠 带入太空飞行1 6 天，发现个体生长非线性减少了约5 0 ，肌肉质量减少约6 0 。 随后他们测定了血浆中i g f 1 的含量，并且用荧光测定的方法测定了d n a 的含量， 发现肌肉中i g f 1 和d n a 的含量比对照组均明显下降。g r a d a m s 等【l6 】对同一 批的幼鼠利用r t p c r 技术又做了进一步的分子水平研究，发现太空飞行后，在 抗重力骨骼肌中，慢速i 类抗原递呈分子( m h c ) 的基因表达下降了约5 5 ，而快 速的i i x 和i i b 类m h c 分子的基因表达却是增加的。表明i 类m h c 基因的表达 与负重活动的信号分子相关；i i b 类m h c 基因的表达不受负重活动的影响。随后， k 模拟微重力对斑马鱼胚胎发育及m i c r o r n a 表达的影响 2 0 0 2 年t a y l o r 等【1 7 】在经过1 7 天空间站生活的雄性大鼠。利用r t p c r 和d n a 芯片技术检测m r n a 水平表达出现差异，发现有1 2 个基因出现上调。3 8 个基因下 调，这其中包括参与细胞增殖与细胞因子级联( p 2 1 ，r e t i n o b l a s t o m a , m a p k 3 ，m a d 3 ， r a s r e l a t e dp r o t e i nr a b 2 ) 的分子，指出涉及肌肉卫星细胞增殖的基因出现下调。 1 1 1 - 3 微重力对免疫系统的影响 宇航员在飞行后出现免疫系统失调的现象最早出现在上世纪六、七十年代。 宇航员免疫状态的改变包括血液循环中白细胞分布的改变、细胞因子数量的改变、 自然杀伤细胞活性降低、粒细胞功能降低、免疫球蛋白水平的变化和潜伏病毒再 活化等。 通过对空间飞行鼠的研究显示，长时间空间飞行可致淋巴样器官发育不良，t 淋巴细胞数目减少以及有丝裂原诱导的淋巴细胞增殖水平降低。在经过地面恢复 作用后，淋巴细胞的数目及功能又能得到恢复【1 8 】。地面利用回转器分析具有丝裂 原活性的t 淋巴细胞，其增殖能力降低，产生i l 2 的水平也降低，因此完整的t 淋巴 细胞活性受到抑制1 9 1 。目前，微重力对t 淋巴细胞的生物学效应的研究比较深入， 但是对b 细胞影响的研究还处于初级阶段，与b 细胞功能相关的体液免疫的研究报 道十分有限，得到的结果也不尽相同。对其他免疫细胞的研究也略有涉及。 b u r a v k ov a 等2 0 】对宇航员的自然杀伤细胞( n k ) 进行了研究，发现在飞行后n k 细胞的数目减少，并且对肿瘤细胞的细胞毒作用减低。c o g o l i a 等【2 1 】利用随机定位 仪模拟微重力，揭示了微重力条件下发生变化的信号通路，主要包括n f - k b 和 m a p k 信号。但是由于人体的生理功能太过于复杂，人们对人类免疫系统与太空飞 行相适应的变化尚不清慰2 2 1 。 1 1 1 4 微重力对心血管的影晌 宇航员处于失重环境时，由于过载值g 等于0 ，使流体静压消失、血液重新 分布、总血量减少，返回地面后导致心血管功能失调，引起血压的变化【2 3 1 。研究 者采用人体太空飞行实验和利用回转仪模拟微重力的方法研究心血管的生物学效 应取得了一定的进展。 第1 章绪论 内皮细胞位于循环血液与血管壁内皮下组织之间，是血管壁最重要的组成成 分之一，通过其功能的紊乱可以间接了解微重力状态下心血管的去适应性反应。 本实验室的刘明等利用人脐静脉内皮细胞在二维回转器模拟的微重力条件下分别 培养1 2 、2 4 及4 8 小时，之后恢复1 g 重力培养2 4 小时，结果发现模拟微重力通 过阻滞细胞周期的g 2 m 期来抑制血管内皮细胞的增殖。同时在模拟微重力处理 4 8 小时后发现有3 9 个基因表达上调，2 6 个基因表达下调，在恢复2 4 小时后1 5 个基因出现回复性变化，这些基因主要是一些参与细胞增殖，细胞周期和血管生 成【2 4 】的基因。 1 1 1 5 微重力对神经系统的影响 与神经和神经内分泌相关的基因和蛋白在微重力环境的适应性研究中已有报 道。模拟微重力环境中，鼠的神经干细胞( n s c s ) 的直径、整合素的表达量以及 c a 2 + a t p a s e 活性均明显大于正常重力对照组，揭示了微重力环境能够增强n s c s 细胞的粘附能力，提高c a 2 + _ a t p a s e 活性，有助于细胞间的联系跚。肇海等2 6 1 利 用回转器研究模拟微重力效应对w i s t a r 大鼠皮质神经元蛋白羰基化的影响，发现 经过微重力处理后，皮层神经元羰基化蛋白水平显著增加。 1 1 2 应用斑马鱼为模式生物对微重力效应的研究进展 1 1 2 1 斑马鱼在微重力生物学效应研究中的优势 斑马鱼( d a n i or e r i o ) 又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼等，是一种热带观赏鱼， 属鲤科短担尼尔属，原产于印度、孟加拉国。斑马鱼成鱼体型较小，胚胎透明且 体外发育，易于活体观察，可在光学显微镜下观察整个胚胎的发育过程。斑马鱼 生长发育快，受精后2 4 小时主要器官原基基本形成，便于研究组织器官的发育和 功能，7 2 小时发育为幼鱼，2 3 个月可长成成鱼，繁殖能力强且易于饲养，可快速 获得大量胚胎。随着斑马鱼基因组测序工程的完成，发现斑马鱼的基因与人类的 基因保守度达到8 5 ，使得斑马鱼成为研究人类疾病的一种优秀的模式动物。同 时，斑马鱼胚胎发育遗传学技术的逐步建立和完善也为斑马鱼的人类疾病模型的 建立和分析提供了良好的基础【2 7 】。 0 j j t 模拟微重力对斑马鱼胚胎发育及m i e r o r n a 表达的影响 根据k i m m e lc 等的分期法，可以把斑马鱼的胚胎发育大致分为7 个时期，即 受精卵期( z y g o t ep e r i o d ) ，卵裂期( c l e a v a g ep e r i o d ) ，囊胚期( b l a s t u l ap e r i o d ) ，原肠 胚期( g a s t r u l ap e r i o d ) ，体节期( s e g m e n t a t i o np e r i o d ) ，咽部期( p h a r y n g u l ap e r i o d ) 和 孵化期( h a t c h i n gp e r i o d ) 。卵在受精后3 天内即可完成胚胎发育的7 个时期【2 8 】。从 受精卵开始，到受精后8 小时，胚胎进入肠胚期的后期，开始出现内外胚层和胚 轴的分化，各器官( 如脑，脊索和尾) 原基开始形成。到受精后2 4 小时，胚胎进入 咽部期，黑色素细胞几乎出现在胚胎的全身，脑和体轴开始发育，具有早期的运 动能力。受精后4 8 小时，胚胎进入孵化期，早期的器官发育基本完成；头，胸鳍 的软骨发育完全，开始破卵膜孵化。受精后7 2 小时，主要的组织器官原基已形成， 各个脑室、眼睛、耳、血细胞、体节等均清楚可见，相当于2 8 d 的人类胚胎。因 此，受精后8 小时，2 4 小时，4 8 小时和7 2 小时是发育比较关键的时期，为微重 力对斑马鱼发育影响的研究提供了时间的参考。 1 1 2 2 斑马鱼在微重力效应研究中的进展 应用斑马鱼作为模式生物进行微重力生物学效应的研究并不多见，主要来自 于m o o r m a n 科研小组。2 0 0 2 年，m o o r m a n 小组应用旋转式生物反应器( r o t a t i n g w a l lv e s s e l ，r w v ) 模拟微重力对斑马鱼胚胎的前庭系统进行了研究。作者分别进 行两组实验，即实验一，将斑马鱼胚胎分别在3 ，2 4 ，3 0 ，3 6 ，4 8 ，7 2 h p f 时置于 模拟微重力处理系统中处理至9 6 h p f ，观察幼鱼的前庭反射；实验二是将斑马鱼胚 胎从3 h p f 开始模拟微重力处理，直到2 4 ，3 6 ，4 8 ，6 0 ，6 6 ，7 2 和9 6 h p f 分别取出 观察幼鱼的前庭反射。结果发现实验一中在3 0 h p f 前开始模拟微重力处理的处理组 和实验二中模拟微重力处理至6 6 h p f 之后的处理组中均出现了前庭反射的缺陷。表 明前庭系统发育的关键时期为3 0 h p f 之前和6 6 h p f 之后，这个关键时期对生理平衡 十分重要【列j 。 随后，2 0 0 5 年【3 们，他们将转有绿色荧光蛋白基因的斑马鱼在微重力模拟仪中 进行处理，检测了微重力处理后不同发育时期的斑马鱼成鱼的心脏、体节、眼、 脊索等器官荧光强度变化，在基因表达水平上确定了不同器官对微重力的感受时 间。s h p f - 3 2 h p f 是斑马鱼胚胎脊索对微重力的敏感时间，基因表达水平发生改变； 第1 章绪论 3 2 h p f - 5 6 h p f 是心脏对微重力最强的敏感时间；脊索、眼、体节等器官在2 4 h p f 至 7 2 h p f 基因表达变化明显；然而，尽管一直使用模拟微重力处理斑马鱼胚胎，上述 器官或组织基因水平的改变也会在8 0 h p f 得到恢复。 2 0 0 6 年，他们用同时转有绿色荧光蛋白和热激蛋白7 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n7 0 ， h s p 7 0 ) 基因( h s p t o ：g f p ) 的斑马鱼研究微重力对眼球中h s p t o 基因表达的影响。 发现模拟微重力可导致h s p t o 基因在眼球中特异性的表达上调【3 1 1 。 2 0 1 0 年，李晓燕等研究微重力效应对斑马鱼耳石的影响。他们应用旋转仪 ( w a l lv e s s e lr o t a t i o n ，w v r ) 处理1 0 h p f 的斑马鱼胚胎，此时胚胎的内耳原基开 始出现。结果发现，在短期处理3 、6 天后，斑马鱼耳石的大小比1 g 重力场中的 耳石显著性增加。但在经过长期处理9 、1 2 天后，处理组与对照组的耳石大小没 有明显变化【3 2 1 。而m o o r m a n 小组在1 9 9 9 年，用r w v 模拟微重力对斑马鱼胚胎的 矢耳石进行研究，发现处理4 天后，r w v 中的矢耳石却比1 g 重力场中的小【3 3 1 。 m o o r m a n 小组的研究结果大体上清晰证明了模拟微重力确实能够引起斑马鱼 不同组织器官基因表达水平的变化，但对于究竟是哪些基因的表达发生了变化、 这些变化会引起后续哪些生物学功能的改变、以及它们的分子机理没有深入的研 究。m o o r m a n 小组的研究为我们研究斑马鱼的微重力效应提供了一些启发，即微 重力对斑马鱼胚胎的生物学效应具有时间和组织特异性。 1 2m i c r o r n a 研究进展 一系列的研究表明，m i c r o r n a 可以通过与特定m r n a 结合或调节特定m r n a 的蛋白质翻译过程来调控基因表达。目前人类基因组中已确认的m i c r o r n a 有几 百个，可能参与3 0 人类蛋白质的表达调控【3 4 1 。另外，许多证据显示，m i c r o r n a 参与调控许多复杂的生理生化过程，如与肿瘤相关的信号转导通路 3 5 】；心脏发育 调节【3 6 】；哺乳动物脂肪细胞分化【3 7 】；胰岛素分泌【3 8 】；细胞增殖促进【3 9 】等。d a v i dl 等【加】在s t s 1 0 8 飞行任务中对大鼠进行了1 1 天1 9 小时的空间飞行处理，并与地 面对照组比较分析，发现空间飞行会导致m i c r o r n a 2 0 6 水平明显的下降，说明微 k 模拟微重力对斑马鱼胚胎发育及m i c r o r n a 表达的影响 重力确实能够引起m i c r o r n a 表达的变化，但是微重力对m i c r o r n a 表达的作用机 制尚有待于进一步研究。 1 2 1m i c r o r n a 的生物学机理 众所周知，一个成熟的m i c r o r n a 是一条长度约为2 2 个核苷酸的非编码小 r n a ，在真核细胞中能够在转录后水平调