（园林植物与观赏园艺专业论文）香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明友使用袅i 掣1 1 11 1 11 7 1 1 9 1 1 1 9 11 9 117ii i 必 学位论文 矗 如需保密，解密时间训年7 月，目 是否保密疋 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 面使用过的材料，指导教师对此迸行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 柱哦男 时阁：劢年 舌月p 日 学位论文使用授权书 本入完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的金 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文印涉及技术秘密。商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 丧解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：桶晓身 导师签名：名虔、卫 签名日期：lo o 年，月劲日 签名b 期：必f p 年 占月幽日 注：请将本表赢接装订在学位论文的扉页和目录之闻 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 目录 摘要1 a b s t r a c t ：； 缩略词表：5 第一部分文献综述6 弓i 言6 l 植物基因工程7 1 1 转基因物种7 1 2 转化效率和转化方法8 1 3 基因转化方法8 1 3 1 农杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) 介导的基因转化方法8 1 3 2 基因枪法9 1 3 3 农杆菌介导法与基因枪轰击法结合1 0 1 4 外源基因1 0 2 香石竹基因工程的研究进展。1 1 2 1 外植体选择上的研究l l 2 2 香石竹愈伤组织诱导及体胚发生途径的研究1 1 2 3 香石竹遗传转化的研究进展。1 2 3 香石竹转基因研究的前景与展望1 3 4 本研究的目的与意义。l3 第二部分香石竹愈伤组织的诱导及植株再生1 5 1 材料与方法1 5 1 1 实验材料15 1 2 1 实验材料的消毒处理及培养条件1 5 1 2 2 香石竹愈伤组织的诱导1 5 1 2 2 1 不同浓度的2 ，4 d 与6 - b a 对愈伤组织诱导的影响1 5 1 2 2 1 不同的香石竹品种在同种培养基上诱导愈伤组织的差异1 6 1 2 2 3 花蕾的大小对香石竹愈伤组织诱导率的影响1 6 1 2 3 1 蔗糖浓度对愈伤组织分化的影响1 6 1 3 数据统计与分析l6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 结果与分析1 6 2 1 愈伤组织的诱导1 6 2 1 1 不同浓度的2 ，4 d 与6 - b a 对香石竹花蕾愈伤组织诱导的影响1 6 2 1 2 不同的香石竹品种在同种培养基上诱导愈伤组织的差异1 7 2 1 3 花蕾的大小对香石竹愈伤组织诱导率的影响1 7 2 2 愈伤组织的分化19 2 2 1 蔗糖浓度对愈伤组织分化的影响1 9 3 讨论：! ( ) 3 1 不同基因型对愈伤组织诱导的影响2 l 3 2 不同外植体对愈伤组织诱导及体细胞胚的影响2 1 3 3 同一外植体在不同发育时期对愈伤组织诱导的影响2 1 3 4 激素对诱导愈伤组织及体胚发生的影响2 2 3 5 胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织。2 2 3 6 蔗糖浓度对愈伤组织诱导及分化的影响2 3 第三部分香石竹的遗传转化2 4 1 材料和方法2 4 1 1 材料2 4 1 1 1 植物材料2 4 1 1 2 供试菌株与供试质粒2 4 1 2 试验药品2 4 1 3 试验技术路线2 6 1 4 培养条件2 6 1 5 无菌体系的建立一2 6 1 6 根癌农杆菌的培养2 7 1 6 1 菌株的活化2 7 1 6 2 菌株的保存2 7 1 7 转化方法2 7 1 7 1 农杆菌的培养和活化2 7 1 7 2 植株再生体系的建立2 7 1 7 3 转化条件及转化率的研究2 8 1 7 3 1 不同品种再生选择压力的确定。2 8 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 1 7 3 2 不同品种之间的分化率比较2 8 1 7 3 3n h 4 n 0 3 对遗传转化率的影响2 8 1 8 数据统计与分析。2 9 1 9 转化植株鉴定2 9 1 9 1 潮霉素抗性鉴定2 9 1 9 2 抗性芽生根培养2 9 1 9 3 植物总d n a 的提取2 9 1 9 3 1 植物总d n a 的提取方法2 9 1 9 3 2 检测d n a 浓度及纯度3 0 1 9 4p c r 反应3 0 1 1 0 转基因植株的下地栽培3 0 2 结果与分析3 0 2 1 再生体系的建立3 0 2 2 潮霉素选择压力的确定3 1 2 3 选择培养基上不同品种间不定芽在的分化率比较3 2 2 4 硝酸铵对遗传转化率的影响3 3 2 5 转化植株的检测3 4 2 5 1 抗性检测3 4 2 5 2p c r 检测3 4 ：；讨论3 5 3 1高频再生体系的建立3 5 3 2 抗生素选择压的筛选3 6 3 3 影响香石竹转化率的因素3 6 3 4 香石竹的玻璃化现象3 6 参考文献3 8 致 射4 9 i i i 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 摘要 香石竹是多年生的草本花卉，作为世界四大切花品种之一，具有很高的观赏价 值。由于一般的香石竹瓶插寿命相对较短，影响了其观赏价值。而传统的保鲜方法 多会造成环境污染，且成本较高。而将利用基因工程技术，能从根本上改变它的瓶 插寿命。本研究从两方面进行：一方面初步探讨了以香石竹的花蕾为外植体的愈伤 组织的诱导及植株再生体系的建立，从而为以此为受体的香石竹遗传转化奠定了基 础；另一方面将两个不同t d n a 结构的a c o 基因转入到射散香石竹内，从而获得p c r 阳性植株。研究结果如下： ( 1 ) 愈伤组织的诱导及分化 本研究采用多头红色品种和多头粉色品种为实验材料，以香石竹的花蕾为外植 体，就影响愈伤组织诱导的有关因子，包括不同香石竹品种、激素的浓度及种类、 蔗糖的浓度、外植体的大小等方面进行了探讨，从而诱导出了香石竹的愈伤组织， 并进一步分化成植株。结果表明：不同植物生长调节剂的浓度及其组合对香石竹愈 伤组织的诱导率不同，在m s + 2 o m g l2 ，4 - d + o 2 m g l6 一b a + 9 蔗糖+ 7 5 9 l 琼脂 的培养基中的诱导率最高，达到8 5 1 。外植体的大小对愈伤组织的诱导也有很大 的影响，花蕾大小长度为1 0 - - - 1 5 c m 时的诱导率最高。蔗糖浓度在一定程度上影 响着愈伤组织的分化能力，蔗糖的最佳浓度为3 。 ( 2 ) 遗传转化 建立高效的再生体系是提高香石竹遗传转化率的基础。以香石竹的叶片为外植 体，建立起了安静、想向、华尔兹、火星和苔丝5 个香石竹品种的再 生体系。不同品种间再生率存在显著差异，其中苔丝叶片的再生率最高可以达 至u 5 9 以上，是叶片再生率最高的品种，而火星的叶片再生率最高只有3 6 。以 香石竹安静、想向、华尔兹、火星和苔丝5 个品种的叶片作为外植体， 利用农杆菌介导法将反义重复a c o 和正义重复a c o 基因转入到上述5 个品种内。实验中 以在分化培养基上预培养2 d ，菌液中浸泡8 - 1 2m i n ，a s 浓度为1 0 0p m o l l ，共培养 时间为3 天，筛选培养基为m s + b a1 0m g l + n a a0 3m g l + h y g4m g l + c e f4 0 0m g l 为转化条件进行遗传转化。结果表明：不同品种香石竹抗性芽分化率在选择培养基 上存在显著差异，苔丝分化率最高达8 4 ，其次是华尔兹( 5 4 ) ，而火星 没有得到抗性芽；1 1 5 株抗性苗经p c r 检测后得到了2 3 株p c r g d 性转化苗。此外，通 1 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 过提高选择培养中硝酸铵的浓度，可以提高香石竹的遗传转化率。 关键词：香石竹；愈伤组织；分化；遗传转化 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 a b s 仃a c t c a r n a t i o ni sa p e r e n n i a lh e r bf l o w e rw h i c hh a sah i 【g ho r n a m e n t a lv a l u ea n dn o w i so n e o ff o u rm a j o rv a r i e t i e so fc u tf l o w e r si nt h ew o r l d r e l a t i v e l ys h o nv a s el i f ea f f e c t e di t s o r n a m e n t a lv a l u e t r a d i t i o n a lp r e s e r v a t i o nm e t h o d sw i t hah i g h e rc o s tc a l lp r o l o n gt h e v a s el i f e ，b u tc a u s em o r ep r o b l e m sa b o u tt h ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n t h ea p p l i c a t i o no f g e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g yi n c a r n a t i o nw i l le x t e n dt h el o n g e v i t yo fc u tf l o w e r f u n d a m e n t a l l y t w oe x p e r i m e n t sh a v eb e e nc o n d u c t e d f i r s t ，p r e l i m i n a r ys t u d yo nt h e i n d u c t i o no fc a l l u sa n dt h ep l a n tr e g e n e r a t i o nw i t ht h ef l o w e rb u d sa se x p l a n t sw a s p e r f o r m e d s e c o n d ，t h ea c og e n ew i t hd i f f e r e n tt - d n a s t r u c t u r e sw a st r a n s f e r r e dt o s p r a yc a r n a t i o nc u l t i v a r sv i aa g r o b a c t e r i u mt u m e f i c i e n t t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) t h ei n d u c t i o no fc a l l u sa n dd i f f e r e n t i a t i o n u s i n gt w oc u l t i v a r so fp o t t e ds p r a yc a m p i o nw i t hr e da n dp i n kf l o w e ra sm a t e r i a l s ， t h ef a c t o r st h a ta f f e c tt h e g e n e r a t i o n o fc a l l u s ，i n c l u d i n gd i f f e r e n t v a r i e t i e s ， c o n c e n t r a t i o n sa n d t y p e so fh o r m o n e ，c o n c e n t r a t i o n so fs u c r o s e ，t h es i z e so fe x p l a n t s ，a r e a n a l y z e d t h ec a l l u so fc a r n a t i o ni si n d u c e da n df u r t h e rp l a n t l e ti sa p p e a r e d t h er e s u l t s s h o wt h a tt h ed i f f e r e n c ec o n c e n t r a t i o n so fp l a n tg r o w t hr e g u l a t o r sa n dt h e i rc o m b i n a t i o n s m a k et h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ei n d u c t i o nr a t eo fc a l l u s t h eh i i g j r e s ti n d u c t i o nr a t e o fc a l l u so b t a i n e do nt h em e d i u mo fm s + 2 0 m g l2 ，4 - d + o 2m g l6 - b a + 9 s u c r o s e + 7 5 9 la g a r , u pt o8 5 1 ；t h es i z eo fe x p l a n t sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo nt h e i n d u c t i o no fc a l l u s w h e nt h ed i a m e t e ro ft h eb u d si sa b o u t1 0 - 1 5 c m ，t h ei n d u c t i o nr a t e i sh i g h e s t ；t oac e r t a i ne x t e n t ，s u c r o s ec o n c e n t r a t i o na f f e c t st h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h e c a l l u sa n dt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o ni s3 ( 2 ) g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n t h er e g e n e r a t i o ns y s t e mo ff i v ec a m a t i o nv a r i e t i e s ，s u c ha s a n j i n g ，h u a e r z i ， h u o x i n g ，x i a n g x i a n g a n d t a i s i ，i se s t a b l i s h e d t h e r ei ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo ft h e r e g e n e r a t i o nr a t e sb e t w e e nc u l t i v a r s ，a n d t a i s i o w n st h eh i l g h e s tr a t eo fr e g e n e r a t i o n ，u p t o5 9 ，t h er e g e n e r a t i o nr a t eo f h u o x i n g i st h el o w e s t ( 3 6 ) t h ea g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s - m e d i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m o fc a r n a t i o nw a se s t a b l i s h e d f o l l o w e dt h ep r o c e d u r e ，l e a fe x p l a n t sa r ep r e - c u l t u r e do ns h o o t i n d u c i n gm e d i u mf o r2 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 d a y s ，i m m e r s e di na g r o b a c t e r i u ms u s p e n s i o nf o ra b o u t8 12m i n , a n d c o c u l t u r e do n r e g e n e r a t i o nm e d i u mc o n t a i n i n g lo o g m o l la c e t o s y r i n g o n e ( a s ) f o r3d a y s ，t h e nt h e t r a n s g e n i cs h o o t sa r es e l e c t e do ns e l e c t i o nm e d i u mw i t h4m g lh y g r o m y c i n ( h y 曲a n d 4 0 0 m g lc e f o t a x i m e ( c e 0 t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e d i f f e r e n t i a t i o nf r e q u e n c yo f a d v e n t i t i o u ss h o o t se x i s t ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nc u l t i v a r s ，t h eh i g h e s tr a t eo f d i f f e r e n t i a t i o ni s8 4 o b t a i n e df r o m t a i s i ，t h es e c o n di s5 4 f r o m h u a e r z i ，a n dn o p l a n t l e tw a sp r o d u c e df r o m h u o x i n g ；2 3o f115p l a n t l e t s ( 2 0 ) w a sp o s i t i v ef o rp c r i na d d i t i o n , t h ei m p a c to fa m m o n i u mn i t r a t eo nt h ec o n v e r s i o nr a t ei se x p l o r e d ，a n dt h e r a t eo fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fc a r n a t i o ni si n c r e a s e dt h r o u g hi n c r e a s i n gt h ea m o u n to f a m m o n i u mn i t r a t e k e yw o r d s ：c a r n a t i o n ( d i a n t h u sc a r y o p h y l l u sl ) ：c a l l u s ；d i f f e r e n t i a t i o n ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n 4 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 第一部分文献综述 引言 香石竹，即康乃馨，又名荷兰石竹、大花石竹， 英名c a r n a t i o n ，属于石竹科石竹属。 香石竹属于多年生宿根草本花卉。基本的形态特征为株高3 0 - - 一7 0 厘米。茎丛 生，具分枝，基部呈木质，节明显，具白粉。叶厚线形，两面具白粉，对生。花大， 具香味，单生，或2 , - 一3 朵呈聚伞状花序，径8 , - 一9 厘米；花梗长；花萼绿色，5 裂； 花瓣5 ，连生，倒卵形，先端有不规则齿裂，单瓣或重瓣，具白、粉紫色。蒴果卵 形。自然花期4 - - 9 月，保护地栽培可四季开花。果期5 - - 7 月，极少结果。 香石竹原产于欧洲南部、地中海沿岸至印度，在欧洲已有2 0 0 0 多年的栽培历 史，为西方名花，在我国也是一种最常见的草花。1 0 6 6 年诺尔曼人把康乃馨的种苗 引入到了英国，至1 7 世纪英国就记载有8 0 0 多个品种。目前香石竹主要产区为意 大利、西班牙、荷兰、波兰、美国、土耳其、哥伦比亚及以色列等。在国外1 6 7 0 1 6 7 6 年就有人开始进行香石竹的育种工作，随后育出植株高、花梗挺拔、花朵较大的优 良切花品种，在世界各国广泛栽培。1 8 4 2 年，法国的达尔梅( m d a l m i a s ) 通过将香 石竹原种与石竹杂交，首例得到了大花的和四季开花的香石竹，到1 8 4 6 年又获得 了各种不同颜色的香石竹。1 9 1 3 年英国也育出可四季开花的香石竹。随后法国、英 国、德国、日本、意大利等国也都纷纷进行育种工作。1 9 9 0 年，我国北京林业大学 园林系花卉教研组开始了香石竹的育种科研工作。 香石竹作为世界四大切花之一，具有相当高的观赏和应用价值，主要应用于切 花。由于色彩丰富，可用作艺术插花的材料，或制作花篮、花束、胸花等。1 9 0 7 年 开始以粉红色康乃馨作为慈母之爱的象征，被誉为“母亲节 之花，代表慈祥、温 馨、真挚的母爱，受到人们广泛喜爱。 我国香石竹的大规模切花生产说是从上世纪八十年代中期开始的，起步相对较 晚，但是进展很迅速。目前香石竹的主要产地有云南、上海、广州等地，专业生产 香石竹切花种苗的有：缤纷园艺有限公司，上海种业、云南农科院等专业种苗供应 商。 6 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 1 植物基因工程 上世纪八十年代以来，随着基因分离，载体的构建，以及植物遗传转化系统的 完善和外源基因在植物体中的表达等各方面研究的不断深入，使得植物基因工程得 到蓬勃开展，许多重要农作物的转基因研究有了很大的突破，获得了大量高产优质、 抗病、抗虫、抗除草剂等的转基因植物。1 9 8 3 年，转基因植物首次获得( z a m b r y s k i e ta 1 ，1 9 8 3 ) ，自此转化技术日渐走向成熟，在几十年中植物遗传转化研究得到了 异常迅速的发展。 1 1 转基因物种 “ 植物基因工程发展的基础和关键是建立高频离体培养植株的再生系统。自上世 纪六十年代以来，随着以m s 基本培养基为基础的几十种培养基的逐渐出现，从固 体培养到液体培养、悬浮培养等培养方式的多样化，以及从原生质体到各种细胞、 组织等各种外植体受体范围的不断增加和培养设备的逐步改良等，培养物种的不断 增多，使得成功进行转基因植物种的数目也相应的增加。国际农业生物技术应用服 务组织( i s a a a ) 在2 0 0 4 年1 月中旬发表的一份统计资料中表明，2 0 0 3 年转基因作 物全球种植总面积连续七年保持2 位数增长，高达6 7 7 0 万公顷，占全世界玉米、 大豆、卡诺拉油菜籽和棉花育种总面积2 6 。全球转基因作物的种植面积比1 9 9 6 年增加了近4 0 倍，世界上共有1 8 个国家的几将7 0 0 万农民在种植转基因作物( 尹 红，2 0 0 4 ；李宏伟，2 0 0 5 ) 。转基因植物品种以番茄、烟草、矮牵牛等模式植物为 代表不断的扩增，其中主要有多数的农作物、蔬菜作物、果树、花卉以及林木等如 小麦、水稻、玉米、棉花、郁金香、安祖花、大豆、葡萄、柑橘、杏、核桃花生、 番茄、拟南芥、油菜、辣椒、黄瓜、茄子、甘蓝、马铃薯、胡萝b 、板栗、百合、 非洲菊、菊花、月季、香石竹、矮牵牛、金鱼草、仙客来、桉树、松树、杨树等， 另还涉及一些其他饲料植物、药用作物等，大豆、玉米、棉花和油菜是全球主要的 转基因作物( a h u j ae ta 1 ，1 9 9 9 ；j a m e s ，2 0 0 0 ) 。 随着花卉市场的逐年扩大，花卉业已逐渐的成为全球性的产业之一。目前在我 国也已成为一种新型的产业，虽然我国花卉种类和品种相对丰富，但在产品的数量 和质量上，却仍然落后于世界领先水平。近年来，分子育种已成为花卉育种的研究 热点，最早被应用于转化研究的转基因花卉是矮牵牛。随着遗传转化技术的不断改 进，用于遗传转化研究的花卉品种数量也逐渐的加大，如唐菖蒲、金鱼草、月季、 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 石竹、百合等花卉都有相关的研究报道，但由于世界花卉种类比较丰富，相对而言， 应用于遗传转化的花卉品种还是比较少( m a s a h i r oe ta 1 ，2 0 1 0 ) 。 1 2 转化效率和转化方法 转化效率的增高和可重复性的增高转化效率是将植物遗传转化技术逐步应用于 生产，逐步提高利用价值的前提。近年来在通过对各种转化条件进行改变，分析各 种影响转基因效率的因素，在许多植物物种中，如烟草、矮牵牛、油菜、胡萝卜、 马铃薯、番茄、黄瓜、菊花、柑橘、甜菜、香石竹等，已形成了较高的转化效率和 重复性较高的遗传转化体系。 近年来植物基因的转化手段，经过不断创新取得了快速的发展和进步。应用于 转基因的手段有很多，从遗传转化系统方面来说可分为两大类，一类是通过构建载 体进行的遗传转化，另一类是对外源目的基因的直接转化。d n a 直接遗传转化系统 的方法主要包括基因枪法、p e g 法显微注射法、超声波法、激光法、脂质体法、电 激法、碳硅纤维介导法、真空浸润法以及花粉管通道法等( 王关林和方宏筠，1 9 9 8 ) 。 目前农杆菌介导法与基因枪法两种转化技术已经基本成熟，日渐成为应用于植物遗 传转化的模式技术。研究发现，利用后一类转化方法获得的转基因植株多拷贝居多， 转基因中的多拷贝出现基因沉默现象比较容易，而较易获得的转基因植株单拷贝的 是通过农杆菌介导的转化方法。 1 3 基因转化方法 随着植物基因工程的不断发展，基因转化的手段也随之得到了不断的发展和完 善，近些年建立了一些简易、高效、快速、适应性广和重复性高的基因遗传转化系 统。植物基因工程，又叫做植物遗传工程或植物遗传转化等，是指利用重组d n a 技术、细胞组培技术，将外源基因转入植物体内，进而获得转基因植株的研究方法 ( 傅荣昭等，1 9 9 4 ) 。以下主要叙述常用的三种方法：农杆菌介导转化法、基因枪 法以及农杆菌介导法与基因枪轰击法结合。 1 3 1 农杆菌( a g r o b a c t e r ，t i m ) 介导的基因转化方法 早在1 9 7 4 年，利用根癌农杆菌感染植物时，可将其中环状t i 质粒上的一段基因 插入到植物的基因组的研究方法被人们发现，从而引起植物相应的植物遗传特征的 改变。从此，人们开始使用这种天然的载体系统，将外源基因导入植物细胞，并通 过利用植物细胞的全能性，借助于细胞培养或组织培养技术，利用将转化细胞培养 形成完整的转基因植株，从而实现外源基因对植物的遗传转化。 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，大量存在于土壤中。现已发现，应用于植 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 物基因转化两种类型的农杆菌：一为根癌农杆菌，二为发根农杆菌。前者含有t i 质 粒，能使被侵染的植物细胞形成肿瘤( 诱发冠瘿瘤) ，后者它含有础质粒，能诱导被 侵染的植物细胞产生毛发状根。t i 质粒上面有一段可以的转移基因( 即t d n a ) ，在 农杆菌侵染植物细胞形成肿瘤的过程中，t - d n a 可以被移动到植物细胞并插入到相 应的染色体基因中。在农杆菌浸染植物时，这段d n a 可以插入到基因组的序列中， 使其携带的基因得到表达。由于t - d n a 可以进行高频率的移动，而且t i 质粒和鼬质 粒上都可移入达到5 0 k b 的外源基因片段( s u j a t h aa n dk u m a r ，2 0 0 8 ) 。因此，进行植物 基因遗传转化的十分理想的载体转化系统就是t i 质粒和黜质粒。而根癌农杆菌t i 质 粒基因转化载体系统是现今研究应用最多、理论机理最清楚、技术方法最为成熟的 基因转化途径。 根癌农杆菌介导的植物遗传转化已成为当今植物遗传转化的主流，是双子叶植 物遗传转化的常用方法。此种转化方法存在着显著的优势，主要表现为：移入的外 源基因多是低拷贝或单拷贝数，并且先插入转系活性区域；宿主范围比较广；整合 的外源基因变异率小；转化效率高，方法简单、有效等。因此，随着转基因植物的 数量不断增加，农杆菌介导的转化方法已得到广泛应用，技术已日渐成熟。 1 3 2 基因枪法 基因枪法是现代一种新型的遗传转化手段，又叫微粒枪法或微粒轰击法，是依 赖高速度的金属微粒将外源基因引入到活细胞的一种转化技术。是继农杆菌介导的 遗传转化方法后又一应用相对广泛的转化技术。用基因枪法进行转化时，将d n a 吸 附于微细的固体微粒表面，然后再将它导入到活细胞体内( 杨奇志等，2 0 0 3 ) 。1 9 8 7 年美国康奈尔大学生物学家s a n f o r d 与该校的工程技术专家k a l l e n 及w o l 晗作研究了 此方法，并证明了基因枪法的可行性。他们是以洋葱的表皮细胞为实验材料，钨粉 作为微弹，将r n a 或d n a 导入细胞里面，并且观察到了外源基因能够表达。基因枪 根据其加速装置分为火药式、气动式和电动式。目前通过基因枪技术，大豆、水稻、 玉米、小麦、棉花等很多植物都得到转化。 基因枪技术作为转移基因的一种重要的手段，总结以下的5 方面的优点：( 1 ) 该方法对受体材料、靶细胞来源不受限制，细胞、组织、器官等都可作为受体进行 转化。扩大了受体的范围，没有分明的宿主限制。( 2 ) 技术操作简捷，能够方便的， 较快的进行基因转移。( 3 ) 只需要利用组织培养技术，不需要经过繁琐的原生质体 的制备及培养阶段，外源基因可以直接插入致密的可再生细胞团，进而减少了由于 原生质体长期的继代培养而形成的再生的植株的变异。( 4 ) 能够使瞬间表达的时间 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 持续加长。( 5 ) 很高的安全性。整个的操作过程中，没有利用感染性的试剂，而且 靶细胞基因组与被移动的基因发生重组的可能性很小，引起插入突变的可能很小。 但是由于基因枪转化法存在很多的应用缺点，如：设备要求高、成本高、多拷贝比 率高、外源基因整合位点多且易出现共抑制和基因沉默等( 于娅等，2 0 0 3 ；李松等， 2 0 0 4 ) ，使得越来越多的学者应用农杆菌介导法进行遗传转化。 1 3 3 农杆菌介导法与基因枪轰击法结合 用于植物遗传转化的方法主要有根癌农杆菌介导法和基因枪轰击法。这两种方 法各有优缺点。农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化技术，遗传稳定性较好， 外源基因在转基因植物中的拷贝数较低；而基因枪的转化技术则具有不易受到材料 的基因型的限制的优点。通过结合两种方法的优点，研究出了三种方法农杆菌介导 和基因枪轰击法相结合的遗传转化方法，分别为农杆枪法，基因枪轰击农杆菌感染 法和金粉或钨粉包裹菌体细胞做为微弹轰击法( s u j a t h aa n dk u m a r ，2 0 0 8 ) 。 随着转基因植物的数量不断扩增，农杆菌介导的植物遗传转化技术也已有很大 发展和进步。许多转基因植物都已经或正在进入田间试验阶段，转基因抗虫玉米、 抗虫棉、抗虫小麦等已经在进行商业化生产，使用基因工程技术解决农业相关的难 题已为时不远。随着国际上农业转基因技术的快速进步与发展以及有关的法律法规 的日渐完善，转基因育种在农业生产上会发挥重要的作用。相信随着我们的不断努 力，基因工程将会为农业进步做出应有的贡献。 1 4 外源基因 用于植物基因工程的基因已经不断扩展，基因的种类和数量日渐增多，研究过 程中不仅向植物体内导入报告基因和选择性标记基因g f p 、g u s 、月p 八胛聊等， 而且还研究了有关植物的抗逆境、抗除草剂、抗虫、抗病、作物的高产优质、谷物 或者延长作物的果蔬贮藏时间、促进氮的使用效率( s h r a w a te ta 1 ，2 0 0 8 ) 、药物的 使用、环境的改善以及改变植物花期、株型、花形以及花色等相关基因。用于植物 基因工程的载体系统的构建发展也很快，以组成型n o s 启动子及c a m v 3 5 s 启动子 为典型的植物基因工程启动子的研究和使用，以及其他特异启动子的研究和应用， 如a c t - i 等启动子在植物中的使用，使得转入的外源基因在植物体中的表达效率有 很大的增强( s e 关林和方宏筠，1 9 9 8 ) 。 1 0 香石竹愈伤组织的诱导及遗传转化的研究 2 香石竹基因工程的研究进展 2 1 外植体选择上的研究 以不同的植物器官为外植体诱导出不定芽途径，这方面的报道很多，研究也很 广泛，所用的外植体类型主要有叶片、茎段、花瓣、花丝、腋芽和茎尖等，其中以 茎段和叶片的诱导不定芽的再生率最高，再生途径也最为成熟。1 9 9 1 年，f r e y 和j a n i c k 利用花瓣为外植体分化出不定芽，且只有在花瓣与花托相连接的部位才能分化出不 定芽，具有分化能力，这一研究与本研究结果相同。1 9 9 1 年，m i l l e r 等利用腋芽为外 植体，从腋芽基部伤口处分化出了不定芽。1 9 9 2 年，v a n a l t v o s t 等报道了利用叶片 为外植体，在叶片基部伤口处直接分化出不定芽。1 9 9 5 年，z u k e r 等用撕掉叶片的茎 段作为外植体，诱导不定芽，诱导率达到8 6 。2 0 0 2 年，n o n t a s w a t s f i 等对不同品种 间的叶片和茎段的分化能力做了比较，结果显示了分化能力和品种有很大的关系。 以叶片为外植体直接再生不定芽的诱导率高，所以近年来以香石竹的叶片为受体进 行的遗传转化的研究取得了很大的进展。 2 2 香石竹愈伤组织诱导及体胚发生途径的研究 植物进行遗传转化的前提和基础是建立一个良好的转化受体系统。香石竹的组 织培养历史相对早，有着比较成熟的组织培养体系。自1 9 6 2 年，b a k e r 等利用茎尖培 养得到脱毒的香石竹苗，从而开创了香石竹组织培养的历史。 利用植物组织培养技术进行植株快速繁殖时，繁殖中间体的培养方法可以通过 三种方式( 尹丽蓉等，2 0 0 5 ) ：一是器宫发生途径，即通过外植体腋芽的萌发和不定 芽的生成途径；二是愈伤组织诱导及再分化途径。即外植体首先经诱导形成愈伤组 织，然后再经诱导分化成不定芽的过程；三是胚状体发生途径。即通过外植体先形 成愈伤组织，再经愈伤组织形成胚状体或直接诱导产生胚状体的过程。目前为止， 香石竹的植株再生体系以器官直接再生不定芽为主，并在此基础上进行遗传转化的 研究，而通过愈伤组织和体细胞胚途径再生报道较少，利用此途径进行遗传转化的 报道也较少。 通过愈伤组织诱导不定芽的途径，优点是容易扩繁，因此在转化过程中就能获 得较多的转化植株，但是不同植物品种通过愈伤组织途径获得再生芽的难易程度不 一样，香石竹就比较困难，相关的报道也很少。1 9 9 0 年，r a d o j e v i c 等通过利用茎段 为外植体诱导出愈伤组织，然后再诱导出不定芽，诱导率可达8 0 ，但是愈伤组织 经过多次继代培养以后，便失去了分化能力。1 9 9 0 年，r u f f o n i 等以茎尖的分生组织 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 为外植体诱导出了愈伤组织，进而获得了不定芽，不定芽的再生率达8 2 。1 9 9 2 年 f r e y 等诱导出香石竹的体胚，并建立起低频率的植株再生体系。1 9 9 3 年，n a k a n oa n d m i i ，通过不经过愈伤组织阶段的直接的体胚再生途径，在含有低浓度的抗生素的培 养基上，用叶片诱导出体胚。1 9 9 8 年，y a n t c h e v a 等在含有b a 和2 ，4 一d 的m s 基本培 养基上高频率诱导出了体胚，并再生出植株。2 0 0 3 年，p a r e e k 和k o t h a r i 以叶片为外 植体采用液体悬浮培养的方式，在含有2 ，4 - d 的m s 基本培养基上通过直接的体胚再 生途径诱导出体胚。2 0 0 7 年，s e o 等以根为外植体，在含有t d z 和n 从的m s 基本培养基 上诱导出胚性愈伤组织，进而在含有2 ，4 - d 的m s 基本培养基上诱导出体细胞胚，建 立起高频率的体细胞胚及植株再生体系。2 0 0 7 年，k a r a m i 等以花蕾为外植体在含有2 ， 4 一d 和b a 的m s 基本培养基上诱导出了体胚，诱导过程中用到了毒莠定。2 0 0 8 年他们又 在n e l s o n 和s p i r i t 这两个香石竹品种中实验，诱导出次生胚。近年来也有不 少关于香石竹体胚诱导的报道，但是关于次生胚方面的研究还非常少，k a r a m i 等在 影响次生胚产生的各方面做了实验研究，比如2 ，4 d 、b a 、蔗糖及甘露醇的含量等。 2 3 香石竹遗传转化的研究进展 随着基因工程的不断发展和完善，