（神经生物学专业论文）cobratoxin对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析.pdf

c i h a l o x m 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析摘要 c o b r a t o x i n 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制 及其机制的初步分析 摘要 为了研究泰国眼镜蛇神经毒素c o b m t o x i i i 对丘脑束旁核( t 1 1 a l 锄i cp a r a 胁c i c u l a r 彻c l e l l s ，p f ) 神经元痛放电的影响及其作用机制，本实验通过侧脑室注射 ( i n t r a c e r e b r o v e r 蚵c u l a ri n i e c t i o n ，i c v ) 不同剂量的c o b 倒c o x i i l ，以细胞外记录p f 神经元的痛放电的频率和持续时间为指标，研究c o b r a t o x i n 对p f 神经元痛放电的影 响，并观察其剂量效应关系。用i 矗v 生理盐水作为阴性对照，i c v 吗啡作为阳性对 照。然后，分别i c v - 阿托品、纳洛酮观察其对c o b r a l o x i n 的效应有无影响，从而推断 脑内胆碱能系统、阿片能系统是否参与c o b m t o x i i l 的作用。最后，腹腔注射 ( i 岬r i t o n e a li i ! j e c t i o n ，i p ) 对氯苯丙氨酸( p a r a - c l l l o r o p h e n y l a l 肌i n c ，p c p a ) 抑制脑 内5 一羟色胺( 5 h y d r o x 扣蝴i n e ，5 - h t ) 合成，研究5 h t 能系统是否参与c o b r a t o x i n 的作用。 实验结果显示：( 1 ) p f 神经元自发放电主要有单脉冲和簇状放电两种类型。( 2 ) p f 神经元对伤害性刺激的反应类型有痛兴奋型、痛抑制型和痛无反应型。( 3 ) c o b r a t o x i l l 能剂量依赖地抑制p f 痛兴奋神经元的痛放电，表现为放电频率降低和持 续时间缩短。( 4 ) c o b r a t o x i l l 的抑制时间随剂量的降低而缩短，但三个剂量c o k 们x i i l 对p f 神经元痛放电的抑制作用时间较长，且均强于吗啡。( 5 ) i c v 阿托品能够完全 翻转c o b r a t o 】( i n 所致的p f 神经元痛放电的抑制作用，i c v 纳洛酮对c o b r a t o x i n 所致 的p f 神经元痛放电的抑制作用无明显影响。( 6 ) p c p a 预处理能部分翻转c o b r a t o x i i l 对p f 神经元痛放电的抑制作用。 结果表明：( 1 ) c o b r a t o x i i l 对p f 神经元痛放电有抑制作用，这种作用具有剂量相关 性。( 2 ) c o b m t o x i n 对p f 神经元痛放电的抑制作用比吗啡强而持久。( 3 ) 脑内的阿片能 系统可能与c o b r a t o ) 【i n 对p f 神经元痛放电的抑制作用无关。( 4 ) 脑内的胆碱能系统可能 参与c o b r a t o x i l l 对p f 神经元痛放电的抑制。( 5 ) 5 h t 能系统可能部分参与c o b r a t o x i n c o b 咖“i n 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析摘要 对p f 神经元痛放电的抑制。 关键词：泰国眼镜蛇神经毒素( c o b m t o x i l l ) ；丘脑束旁核( t h a l 锄i cp 舷i c l l l 盯 删c l e l l s ，p f ) ；痛放电( p a i n - e v o k e dd i s c h a f g e ) ；阿托品( a 的p i ) ；纳洛酮( n a l o x o ) ； 对氯苯丙氨酸( p a r a c l l l o r o p h 锄y l a l 锄j n e ，p c p a ) i i 作者：程勃超 指导教师：周希平 t h eh h i b i t i 佃o fc o b r a t o x i no np a i n e v o k e dd i s c h a r g e o fn e u m n si nt h a l a m i cp a r a f a s c i c u l a rn u c l e u sa n dt h e p r e l i m i n a r ya n a l y s i so ni t sm e c h a n i s m a b s t r a c t t ba i l a l y s i st l l ee f f c c to fc o b r a t o x i i lo np a i n _ e v o k e dd i s c l l a r g eo fm u r o n si nm a l a l 】 1 i c p a r a f 如c i c u l a rn u c l e l l s ( p f ) a n di t sm e c h 趾i s m ，t l l ep a i n - e v o k e dd i s c h a r g e 、a sr e c o r d e d e x 仃a c c l l u l a d y 、v i t l lg l 螂m i c r o e l e c 仃o d e 舶mp d i 雎r e md o s e so fc o b m t o x i nw c r c i n j e c t e di i l t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r l y ( i c v ) n o m a l s “i n ea n dm o r p l l i n ew e r cu s e d 私 n e g a t i v e 觚dp i t i v ec o n t r o l ，r e s p e c t i v e l y t o 她a l y z e 也em e c h a l l i s mo fe f f e c t s0 f c o b r a t o x i i lo np a h 卜m k e dd i s c h a 唱eo fn e u r o 璐i i lp f i c v 竭e c t i o no fa 仃叩m e 锄d n a l o x o n e ，勰w e u i i l 饥唧。r i t o n e a li n j e c t i o n ( i p ) p a m - c h l o r o p h e n y l a l p n i i l e ( p c p a ) w e r c p r e f 0 姗e d t h ee x p e d m e f i a lr c s u l t si n d i c a t e dt l l a t ：( 1 ) t h es p o i l t 锄e o u su l l i td i s c h a r g e sh a dt 、o t y p e s ：s i i l g l ei m l “s ed i s c l l a r g ea i l d b u r s td i s c h a r g e ( 2 ) t h e r e 咣t l l l 优t y p e so f r c s p o n s e s a f k rn o x i o l l ss t i m u l a t i ：p a i ne x c i 协t o r yt 圯，p a i ni t l l l i b i t o r yt y p ea n dn op a i nr e s p o l l s e t y p e ( 3 ) 1 1 1 e 舶q u e n c y ，m ed u r a t i o no f p a i n e v o k e dd i s c l l a r g eo f p f n e 砒o i l s w c r e i n h i b i t e d m e ri c v i n j e c t i o no f 圭l i g h ，m i d d l e 孤dl o wd o s e so fc o b r a t o x i n t h ee 矗e c t 、椒s d o 一d e p e n d e n t ( 4 ) t ki l l l l i b i t o 叮e 僚c to fc o b m t o x i i l 啪ss n d n g e ra 1 1 dl 勰t c dl o n g e r m 孤m o r p l l i ( 5 ) 皿ei n l l i b i t o r ye 腩c to fc o b r a t o x i i lo np a n c v o k e dd i s c h a r g eo fp f n e 0 i l sw 私r c v e 璐c db yi c v i n j e c t i o no f 却妇，b u tn o tb yn a l o x o m ( 6 ) t h ei l l ：i l i b i t o r y e 仃c c to fc o b ra _ t o x i n p a i n e v o k c dd i s c h a r g eo fp fn e u r o 璐w 船p a n i a l l yf e v e r s e db y p c p ap r c t r e a 恤e n t 皿er e s u l t s 踟g g e s t e dt l m t ：( 1 ) c o b r a t o x i i lh 嬲锄i i l l l i b i t o r ye 侬c t p a n e v o k e d d i s c t l a r g co fp fn e u r o i l sw h i c hi sd o s e - d e p e n d e m ( 2 ) t h ei i l l l i b i t o r ye f r c c to fc o b m t o x i n h 鹪al o n gd u r a t i o n ，锄d 蛐r o n g e rt h a nm o r p l l i n e ( 3 ) c e n 仃a lo p i o i d e r g i cs y s t e mm a yn o t p 硎c i p a t ei i l m ci 1 1 l l i b i t o r ye 行e c to fc o b m t o x i n ( 4 ) c e m m lc h o l i n e r g i cs y s t e mm a y p a r t i c i p a t ei i ln l ei n l l i b i t o r ye f 诧c to fc o b r a t o x i n ( 5 ) c e n t m l 辩r o t o n e 哂cs y s t e mm a yb e p 删a l l yi n v o l v e d ，i nm ci l l l l i b 搿e 虢c to fc o b r a t o x i no np a i n e v o k e dd i s c h a r e g eo fp f i u 堡堂堕! 塑堕竺墅竺型垡塑! 堕! 堕竺! 燮墅! 生坚! 堕竺型些型型塑塑垒竺坐坐塑| 竺! 塑 n e u f o 船 k e yw o r d s ：c o b m t o x i n ：t h a l 锄i cp 蹦l 触i c u l a rn u c l e u s ( p f ) ；p a i n e v o k c dd i s c h 盯g e ； a n d p i n e ：1 l a l o x o n ；p a m - 删o r o p h e n y l a l a n i i l e 廿c p a ) l v w n e n b y c h e n g b o c h s u p e n r 缸e db yz h o u x ip i n g c o b 哪础对丘脑柬旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析缩略词表 p f p e n p 呵 l p 1 c v c n s 缩略词表 丘脑束旁核 p a i n - e x c i t a t o i yn e 啪n痛兴奋性神经元 p a i n i n k b “o r yn e u r o n痛抑制性神经元 i n 仃a p e r i t o n e a li i l j e c t i o n腹腔注射 侧脑室注射 中枢神经系统 5 一羟色胺 对氯苯丙氨酸 n r m n u c l e 邯r a p h cm a g 肌s中缝大核 p a g p e r i a q u c d u c t a lg r a y中脑导水管周围灰质 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学 或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律 责任。 研究生签名：刍阻日 期： 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 期：上抖 期： w 1 3 p 1 飙串十 c o b r 蛳豳对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析引言 引言 疼痛是一种复合的感觉，临床上常与自主神经活动、运动反射、心理和情绪反应 交织在一起，还受个人过去生活经验的影响，伴有因人而异的一种令人不愉快的感觉 上和情绪上的感受。疼痛分浅表痛和深部痛两大类：前者定位明确，由强刺激皮肤引 起；后者定位模糊，源于肌肉、肌腱、骨骼、关节和内脏器官【l 】。 痛觉信号由感觉神经传入脊髓，首先在脊髓背角胶质区进行加工，然后沿着脊髓 丘脑束向上传递，到达丘脑，最后进入大脑皮层。在向上传递过程中，中枢神经系统 ( c e 曲f a ln e n ，o 懈s y s t c m ，c n s ) 每一个水平都有一定的整合作用，但是，最主要的痛 觉整合作用是在丘脑中进行的。丘脑束旁核( m a l 锄i cp 盯a 鲰i c u l a rn l l c l e i l s ，p f ) 在 髓板内，位于中央中核内侧，由于这两个核团的边界不清，被称为中旁复合体。中 旁复合体经被盖中央束接受脑干网状结构、大脑皮层和皮层下核、小脑和脊髓的传入， 发出的纤维主要投射到纹状体( 尾核和壳核) 、丘脑的其他核群和大脑皮层。现已公 认它和生理以及病理条件下的痛觉相关【2 】。现在认为p f 是丘脑水平参与痛觉调制的 重要结构，是痛觉感受信息上行通路的关键核团，p f 和中央外侧核内某些神经元对 于伤害性刺激能够产生特殊的放电，称为痛放电( p a i l l e v o k e dd i s c h a r g e ) 。这种放电 不仅可以被吗啡取消，而且已经证明和痛觉有关【3 】。现在以p f 痛放电为指标的电生 理方法已经成为研究痛觉的经典方法之一。 疼痛虽然引起不愉快的感受，但它可作为机体受到伤害性刺激的一种警告，产生 一系列防御性保护反应。同时，一些长期剧烈疼痛对机体造成不可忍受的折磨。虽然 现在有诸如药物、手术、针刺以及应激等镇痛方法，但都有其局限性，因此镇痛一直 是医务工作者面临的难题之一。 阿片类药物与非甾体类抗炎药( n s a i d s ) 都是经典的镇痛药，用于疼痛治疗历史 悠久。n s a i d s 对于神经性疼痛无效，而阿片类药物虽然有确切的镇痛效果，但是， 与其剂量相关的副作用如呼吸抑制、恶心、呕吐，以及长期应用极易成瘾并产生耐药 性。这些问题一直困扰着病人和临床工作者，因此寻找一种新的不成瘾镇痛药十分重 要。上世纪初，人们就开始探索蛇毒的药用价值【4 】。近年来，研究发现蛇毒还具有 c o b 哪慨i i l 对丘脑柬旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析引言 镇痛作用【5 ，6 】。 1 9 9 0 年c h c n r 和r 0 b i r i s o n s e 从眼镜蛇( n 旬a i m j a a 衄) 蛇毒中分离出的短链神 经毒素c d b r o t o x i i l 具有镇痛作用，应用于临床未出现成瘾性和耐药性、并且镇痛效果 比吗啡持久【6 】。目前眼镜蛇蛇毒的另一种成分长链神经毒素c o b m t o x i i l ( 提纯自泰 国眼镜蛇) 也已提纯，其是否具有相似或更好的镇痛效果就很有研究价值。 本院药理学实验室通过行为学实验发现，提纯自泰国眼镜蛇蛇毒的长链神经毒素 c o b m t o x i i l 有明确的镇痛效果【7 】，但是目前还没有用电生理的方法研究c o b m t o x i n 的 镇痛作用及其机制的相关文献。故本实验用电生理的方法，以大鼠作为实验对象，通 过侧脑室注射( i i l 仃a c e r e b r o v e n t r i c u l 盯i n j e c t i o n ，i c v ) 不同剂量c o b r a t o x i n 的方法， 以p f 神经元痛放电为指标，来验证c o b r a t o 虹n 的镇痛效应，并探讨其效应和剂量之 间的相关性。另外，通过i c v m 型胆碱受体拮抗剂阿托品、阿片受体拮抗剂纳洛酮、 腹腔注射( i 娜r i t o n e a ii n j e c t i o n ，i p ) 对氯苯丙氨酸( p 栅一c l l l o r o p h e n y l a l a i l i n e ，p c p a ) 抑制脑内5 一羟色胺( 5 h y d r o x ”r y l ) 诅i i l i 鹏，5 - h t ) 合成，来研究c o k 怕x i n 镇痛作用 和脑内胆碱能、阿片能及5 h t 能系统的关系。这不仅是对c o b m t o x i i l 镇痛作用及其 相关机制的初步探索，也为临床开发蛇毒作为新的镇痛药物提供实验依据。 2 c o b 哪嘶n 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析 实验材料及方法 一、实验材料 实验材料及方法 ( 一) 实验对象 成年雄性w i s t a r 大鼠，体重2 0 0 2 5 0 9 ，由苏州大学生命科学学院实验动物中心 提供。 ( 二) 试剂 1 c o b r a t o x i l l r e c e p t o g e ni n c ，美国( 由药理教研室秦正红教授提供) 2 水合氯醛一上海医药集团上海化学试剂公司 3 滂胺天蓝一s c h m i d g m b h & c o ( 德国) 4 吗啡一沈阳第一制药厂 5 生理盐水一国营张家港市制药厂 6 阿托品一无锡市第七制药有限公司 7 纳洛酮一北京四环医药科技股份有限公司 8 对氯苯丙氨酸一s i g m a 公司( 美国) 9 醋酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、多聚甲醛、蔗糖、明胶、双氧水、 无水乙醇、二甲苯、中性树脂等均购自国药集团化学试剂有限公司。 ( 三) 设备仪器 ( 1 )立体定位仪s n 一3 型 日本n a r i s h i g e 公司 ( 2 )台式牙钻车 3 0 7 4 型上海医疗器械六厂 ( 3 )声音指示器s z 2 型中国科学院上海生理研究所 ( 4 )分析天平t g 3 2 8 a 型上海分析天平厂 ( 5 )冰冻切片机k d 2 0 2 型 浙江金华市科迪仪器设备有限公司 ( 6 ) 光学显微镜c x - 4 0 型 日本o l y i i l p i l s 光学株式会社 ( 7 )数码相机 c - 4 1 0 0 型 日本o l y m p i l s 光学株式会社 c o b f ；1 1 0 x - m 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析 实验材料及方法 ( 8 )微电极放大器m e 乙8 2 0 1 型日本n i h k o h d 株式会社 ( 9 )双线记忆示波器 v c 1 0 型日本n i h o n k o h d e n 株式会社 ( 1 0 )电子刺激器 s e n 7 1 0 3日本n i l l k o h d e n 株式会社 ( 1 1 )隔离器s s 2 0 l j 型日本n i l l o nk o h d e n 株式会社 ( 1 2 )生物信号传递系统s m u p - p c上海医科大学生理教研室 ( 1 3 )步进马达p f 5 4 8 型日本n a r i s h i g e 公司 ( 1 4 )双路温控电源h k d y 2 型南京大学生理教研室 ( 1 5 ) 微电极拉制仪 m p 8 7 型中科院上海生理研究所 ( 1 6 )微量注射器 w 2 1l 型上海医用激光仪器厂 ( 1 7 )动物呼吸机a l c v 8上海奥尔科特生物科技有限公司 二、实验方法 ( ) 实验动物分组 实验分两部分进行，都以p 拜中经元痛放电作为观察指标。 第一部分：c o b n t o x i n 对p f 神经元痛放电的影响 本部分首先研究c o b r a c o x i n 对p f 神经元痛放电的影响。实验分为六组：( 1 ) 正常 对照组( n = 1 5 ) ：未作特殊处理；( 2 ) 阴性对照组( n = 1 5 ) ：i c v 生理盐水2 m ； ( 3 ) 阳性对照组( n = 1 5 ) ：i c v 吗啡4 0 “g 4 肛l ； ( 4 ) 大剂量c o b 舳x i n 组( n = 1 5 ) ：i c v 4 5 p g 瓜g ，2 山； ( 5 ) 中剂量c o b r a t o x i n 组( n - 1 5 ) ：i c v 1 1 2 肛g l 【g ，2 m ；( 1 6 ) 小剂量 c o b r a t o x i n 组( n = 1 5 ) ：i c v 0 5 6 p g m g ，2 p l 。 再观察c o b m t o x i n 对p f 神经元痛放电抑制作用的时程。实验分为三组：( 1 ) 大剂 量c o b r a t o x i n 组( n = 5 ) ：i c v 4 5 p g ，1 ( g ，2 山； ( 2 ) 中剂量c o b r a t o x i l l 组( n - 7 ) ：i c v 1 1 2 肛g k g ，2 p l ( 3 ) ，j 、剂量c o b r a t o x i n 组( n ：5 ) ：i c v o 5 6 i 耀卵k g ，2 山。 第二部分：c o b n t o x i n 对p f 神经元痛放电影响的机制 首先研究脑内胆碱能、阿片能系统和c o b r a t o x i l l 镇痛作用的关系。实验分为三组： ( 1 ) 对照组( n = 1 2 ) ：生理盐水+ 大剂量c o b r a t o x i n 组( i i c v 生理盐水1 0 m + i c v 4 c o b 舯x i i l 对丘脑柬旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析 实验材料及方法 c o b r g c o x i l l4 5 瑚肚g ，2 山) ；( 2 ) 阿托品组( n = 1 2 ) ：阿托品+ 大剂量c o b m m o x i i l 组 ( i c v 阿托品5 p 1 0 “l + i c v c c i b i a t o ) 【i i i4 5 鹏俺，2 m ) ； ( 3 ) 纳洛酮组( n = 1 2 ) ： 纳洛酮+ 大剂量c o b m t o x i i l 组( i c v 纳洛酮4 鸺，1 0 山+ i c v c o b m t o x i n 4 5 烬l ( g ，2 山) 再研究脑内5 h t 能系统和c o b 蝌t o x i n 镇痛作用的关系。实验分为两组( 1 ) 对照组 ( n = 1 2 ) ：三天前i p 生理盐水4 l n l + 试验中i c v 大剂量c o b m t o x i l l4 5 p g l ( g ，2 m 。( 2 ) p c p a 预处理组( n = 1 2 ) ：三天前i pp c p a3 0 0 m 眺g ，4 m l + 试验中i c v 大剂量c o b r a _ c o x i n 4 5 p g 瓜g ，2 m 。 ( 二) 丘脑束旁核( p f ) 神经元单位放电的记录 大鼠以4 水合氯醛( 4 0 0 m g 他函i p ) 麻醉，分离右侧坐骨神经，以电刺激坐骨神 经作为伤害性刺激。傲气管插管，并将动物固定在立体定位仪上。根据p a ) 【i i l o s & w a t s o n 大鼠脑图谢8 1 ，确定p 晰经元的记录部位( b r e g m a 点后4 2 4 3 i 啪，旁开 2 2 2 3 i 啪，深度为脑表面下4 8 7 5 n l i i l ，进针与横断面垂直) 。动物用三碘季铵酚 ( 6 0 m g k g ，i p ) 制动，并维持人工呼吸。刺激电极为镍铬丝制成的双极保护性电极， 刺激的参数为：双脉冲方波，间隔1 0 m s ，波宽o 5 m s ，强度2 0 2 5 v ，每5 5 s 刺激一次。 记录电极为玻璃微电极，内充2 滂胺天蓝和o 5 m 醋酸钠，尖端直径三1 岫，阻抗 1 0 一2 0 m 欧姆，用步进马达推进至脑表面下4 8 7 5 衄处进行细胞外记录，信号经微 电极放大器放大后，在双线示波器上显示，再经s 唧一p c 输入计算机做叠加l o 次的序 列密度直方图( 图1 ) 。 图l记录大鼠p f 神经元痛放电的实验安捧示意图 ( a m n 妒m 锄t o f e 工p e r i m e n t ) 5 c o b 瞰o x m 对丘脑柬旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析实验材料及方法 实验结束后，进行记录部位的形态学鉴定。玻璃微电极的末端接负极，动物头 皮接正极，通直流电( 2 0 “a ) 1 0 i i l i i l 后，在记录电极尖端泳出滂胺天蓝。大部分直接 断头取脑，在4 多聚甲醛中固定，次日做连续冰冻切片，观察蓝点是否在p f 内。必 要时在体视显微镜下拍照。 ( 三) 侧脑室注射 第一部分：大、中、小剂量c o k 炯x i i l 和生理盐水都以2 m 在1 分钟内注入侧 脑室，吗啡以4 斗1 在2 分钟内注入侧脑室。 第二部分：生理盐水、阿托品和纳洛酮都以1 0 m 于5 分钟内注入侧脑室，5 分 钟后再将大剂量c o b r a t o x i n 注入侧脑室。 侧脑室定位座标是b r e g m a 点后o 8 舢，旁开1 5 唧，深度为脑表面下3 5 咖。 实验结束后，侧脑室注入2 “l 滂胺天蓝溶液，然后直接断头取脑，在脑室注射的部位 作冠状切面，观察侧脑室有无蓝色残留。 ( 四) 对氯苯丙氨酸( p c p a ) 预处理 。 按本研究室沿用的方法，将p c p a 溶于生理盐水后，以3 0 0 m g l ( g ，4 i i l l 进行腹 腔注射，抑制色氨酸羟化酶，阻断5 h t 合成例。大鼠i p3 0 0 m g 瓜g 可以使脑内5 一h t 含量降低8 0 ，9 0 【1 0 1 。该作用发生较慢，2 3 天后到达最低点，7 天后开始恢复，2 周后基本恢复。抑制脑内5 h t 合成的作用较为可靠。本实验在用p c p a 预处理后三 天( 7 2 小时) 作p f 神经元痛放电的记录，观察大剂量c o b r a t o x i n ( i c v 4 5 峙l ( g ) 的效应。对照组用生理盐水替代p c p a 。 ( 五) 数据处理及统计 用伤害性刺激前后1 秒平均放电频率的差值为主要变量单位。兴奋性反应采用临界比 值标准【l l 】：c r j ( e s ) 、两( e 和s 分别为相同单位时间内的诱发放电数和自发放电 数，c r 1 9 6 为兴奋性单位) 。实验结果中的数据用均数标准差( x 士s d ) 表示。用 s p s s 软件和m i c r o 矗e x c e l 进行统计学处理。在多样本均数两两比较时用重复测量 数据的方差分析( r e p e a t e dm e u r e s ) ，尸 o 0 0 1 或尸 o 0 1 时为有显著差异。在两 样本均数比较时用卜t e s t ，尸 0 0 5 ，表2 、3 ) 。 各时间点与正常对照组相比亦无不同( 参见表1 ，与表2 、3 比较) ，表明i c v 生理盐 水对p f 神经元痛放电无明显影响。 与给药前自身相比和与注射生理盐水的阴性对照组相比较，i c v 吗啡( 4 叩舻p 1 ) 后5 分钟时，p f 神经元痛放电频率明显降低，持续时间明显缩短限e p e a t c dm e 船u r c s ，p 0 0 0 1 ，图6 ，表2 ，表3 ) ，后l o 分钟时痛放电频率降至最低，放电持续时间最短 ( p 0 0 0 l ，图6 ，表2 ，表3 ) ；后2 0 分钟时痛放电频率有所恢复( 卜t e s t ，p o 0 5 ) ， 痛放电持续时间基本恢复( 图6 ，表2 ，表3 ) ；后3 0 分钟时痛放电的频率和持续时间 基本恢复( 图6 ，表2 ，表3 ) 。 。h 一。j 柚h 州 j 一。 。儿l i i l 一。h ， 图6i 矗v 吗啡对p f 神经元痛放电的影响 c r h e i n h m i t o r ye 胁c t o f m o r p h i n e 蛐曲e p a i n - e v o k e d 咖i t d i s c h a r g 髂o f p f n e u m n s ) a e 分别是i c v 吗啡前、后5 分钟、1 0 分钟、2 0 分钟、3 0 分钟时的序列密度直方图。 c o b f a x i n 对丘脑束旁核神经元瘸放电的抑制及其机制的初步分析结果 与给药前自身相比和与注射生理盐水的阴性对照组相比较，i c v 大剂量 c 0 b 咖x i n ( 4 5 p 出) 后5 分钟，p f 神经元痛放电频率降低( 卜t e s t ，p 0 0 5 ，图7 ， 表2 ) ；1 0 分钟p f 神经元痛放电频率明显下降，痛放电持续时间明显缩短( r e p e a t c d 啪s u s ，p 0 0 0 l ，图7 ，表2 ，表3 ) ；2 0 和3 0 分钟痛放电频率进一步下降， 痛放电持续时间持续缩短( p 0 0 0 1 ，图7 ，表2 ，表3 ) 。 表明i c v 大剂量c o b m t o x i n 对p f 神经元的痛放电频率和持续时间均有明显的抑 制作用。这种抑制作用在给药5 分钟后起作用，在1 0 、2 0 、3 0 分钟作用进一步增强。 址。上一h m 、。l m ，j ，几 。m j 。 乱h h o 0 2。l l h 矾。m 一川t ：汛 图7i c v 大剂量c o b 豫t o x i n 对p f 神经元痛放电的影响 c n i ei l i h m n o r y 胡钒o fg d b r a t o 】【i i im i g hd o 辩，4 5 p g ，k 曲彻t h ep a i n - e v o k e d 蛐i td j s c h a r 霉蜉 o f p f n e m 口n 曲 a e 分别是i c _ v 大剂量c o b r a t o 姐n 前、后5 分钟、l o 分钟、2 0 分钟、3 0 分钟时的序 列密度直方图。 与给药前自身相比和与注射生理盐水的阴性对照组相比较，i c v 中剂量 c o b r a _ t o x i n ( 1 1 2 肛班曲后1 0 分钟，p f 神经元痛放电频率明显下降，痛放电持续时间明 显缩短( r e p e a t c dm e 硒u r c s ，p 0 0 0 l ，图8 ，表2 ，表3 ) ；在2 0 分钟时痛放电频率降 至最低，痛放电持续时间最短( p o 0 0 1 ，图8 ，表2 ，表3 ) ；3 0 分钟时痛放电频率和 c c 岫a 幻x i n 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析 结果 痛放电持续时间开始恢复( 图8 ，表2 。表3 ) 。 表明i c v 中剂量c o b m t o x i n 对p f 神经元痛放电的频率和持续时间亦有明显的抑 制作用。这种抑制作用在给药后1 0 分钟左右起作用，2 0 分钟为抑制作用最高峰，3 0 分钟时抑制作用开始减弱，痛放电开始恢复。 图8i c v 中剂量c o b r a t o x i n 对p f 神经元痛放电的影响 r r h e 劬m i t o r ye m no fc o b r a t o x i n ( m i d d l ed o s e ，1 1 2 - i 班由仰t kp a i l l - 盯o k e dm i 碓 d 妇h a 驴o f w n e u m n s ) a e 分别是i c v 中剂量c o b f a t o x i i i 前、后5 分钟、l o 分钟、2 0 分钟、3 0 分钟时的序列 密度直方图。 与给药前自身相比和与注射生理盐水的阴性对照组相比较，i - c v 小剂量 c 曲r a t o x i n ( o 5 6 嵋m g ) 后1 0 分钟，p f 神经元痛放电频率开始明显下降，痛放电持 续时间明显缩短( r e p e a t e d m e u r e s ，p o 0 0 1 ，图9 ，表2 ，表3 ) ；在2 0 n l i n 时痛放 电频率降至最低，痛放电持续时间最短( p 0 o o l ，图8 ，表2 ，表3 ) ；3 0 分钟时痛放 电频率，痛放电持续时间明显恢复( 图8 ，表2 ，表3 ) 。 表明i c v 小剂量c o b r a t o ) 【i n ( o 5 6p 眺g ) 对p f 神经元的痛放电频率和持续时间 均有抑制作用。这种抑制作用在给药后1 0 分左右开始起作用，2 0 分钟时达到抑制作用 c c 岫x i n 对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析结果 最高峰。给药后3 0 分钟抑制作用明显减弱，p f 神经元痛放电频率和持续时间明显恢复。 j k 。加“ ，。l “鼽k k 。 一l 扎n 。二一 图9l c v 小剂量c o b m t o x i n 对p f 神经元痛放电的影响 盯h ej l i h i b i t o r ye m ! c to fc o b r a t o x i no o w d 惦e ，o 5 6 p g ，l g ) o nt h ep a i l i 州o i e d 帅托d i 靶h a r g 髓 o f p f n a l m n 曲 a e 分别是i c v 小剂量c o b m t o x i l l 前、后5 分钟、1 0 分钟、2 0 分钟、3 0 分钟时的序列密 度直方图。 表21 c v c o b m 自o x i n 对p f 神经元痛放电频率( h z ) 的影响 皿h m n o r ye 讹c t so f l c v c o b r a 删n 仰t h el h ! q u e n c yo f 呻i 毗 k e d 蛐nd i s c h a r g 鼯o f p f n e u r o n s 1 细胞数注药前注药后5 i i i i n注药后1 0 l l l i n注药后2 0 i i l i n注药后3 0 向n 生理盐水组1 51 3 6 l 2 5 4 1 2 9 7 土2 7 21 2 ，9 2 2 9 71 3 2 3 31 21 2 7 7 士2 8 l 吗啡组1 51 3 8 l 3 6 99 1 5 1 2 扛址+4 1 7 1 3 4 柚1 2 4 3 5 2 1 61 3 2 8 4 6 0 查剂量， 1 51 3 舶2 6 5l o 5 2 2 2 垆7 跖1 9 妒十 5 4 5 1 3 严桦3 4 7 l 船址+ 耻 b m l o n 殂 安型量由 1 5 1 3 3 l 士3 4 71 1 6 3 3 5 4 8 9 8 3 1 4 址t 扯7 3 l 士2 4 6 脚8 2 7 2 3 4 柚t 蹦辨 当剂量 ，。 1 51 3 5 9 44 81 1 7 9 4 0 5 矗9 2 0 3 7 5 址 8 7 4 3 9 5 a 埘1 0 3 8 士3 8 6 甜 峄 o 0 5 ，“p o 0 1 与注药前比较：+ p 0 0 5 ，+ + p o 0 0 1 同一时间点与生理盐水组比较；4 p o 0 5 ， l p o 0 0 l 与吗啡比较； 0 0 5 。”p 0 0 0 1 与同时间上一剂量比较 1 4 c o b 咖曲对丘脑束旁核神经元痛放电的抑制及其机制的初步分析 结果 表3k v c 曲n 锨缸对p f 神经元痛放电持续时间( m 0 ) 的影响 皿h i b 咖r ye 钕bo f l 厶v c o b n 锄血蚰地ed u n 如o f p a i 肿v o h du 面td i s c h a 增曙o f h n e r o n l l 生理盐水 1 5 1 2 6 2 6 7 1 2 1 7 3 3 组 1 6 6 4 51 1 3 8 6 吗啡组 1 5 大剂量 c o b r a t o ) 【i n 组 中剂量 c o b r a t o x i n 组 小剂量 c o b m t o ) 【i n 组 1 2 8 0 2 3 2 7 5 1 2 3 69 2 1 3 3 7 4 6 6 7 士2 3 8 7 l士1 3 2 5 5 廿士1 0 7 3 5 “” 1 2 4 8 1 9 4 4 7 1 0 2 0 士2 0 9 4 9 1 2 1 8 6 7 1 5 0 3 3 1 2 2 6 士2 6 5 1 l 1 3 0 2 6 71 1 6 6 6 7 9 5 3 3 38 2 5 3 3 6 7 6 士1 8 0 7 7士1 9 9 3 8 舱士1 4 6 1 2 6 6 触 士1 8 4 7 7 a a 士2 0 8 4 2 6 6 盎 1 2 8 01 1 6 9 3 3 9 6 6 6 78 3 4 6 7 1 0 1 0 6 7 士2 9 0 4 2士2 2 3 8 5 触士1 9 7 5 1 肼始 士1 4 8 4 l 心士1 4 1 3 9 矗圳 1 2 0 1 3 3 1