（神经生物学专业论文）成年大鼠海马神经前体细胞表达功能性的l型钙通道.pdf

j 硪士学位论文c n ss v z玢gh p c sd m e m f 1 2d i vp b sd 。h a n k sb r d ue g fb f g fn e s t i nr u j lg f a pp o r n l a mb d n f【c a 2 + ih f缩赂词表c e n t r a ln e r v o u ss y s t e ms u b v e n t r i c u l a rz o n ed e n t a t eg y r l l sh i p p o c a m p a lp r o g e n i t o rc e l l sd u l b e c e o sm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m f 1 2n u t r i e n tm i x t u r e sd a y si nv i t r op h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nd - h a n k sb a l a n c e ds a l ts o l u t i o n5 - b r o m o d e o x y u r i d i n ee p i t h e l i a lg r o w t hf a c t o rb a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rn e u r o e p i t h e l i a ls t e mc e l lp r o t e i n1 3 - t u b u l i nl l ig l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i np o l y o m i t h i n e l a m i n i nb r a i n - d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o rc y t o p l a s m i cf r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o nh i p p o c a m p a lf o r m a t i o n成年大鼠海马神经前体细胞表速磅能性的0 一型钙通道成年大鼠海马神经前体细胞表达功能性的l 型钙通道硕士研究生：冯锦丽导师：高天明摘要成年哺乳劝物大腻可醣产生新的神经元，这一发蕊是神经科学领域的重大突破。非常有趣的是这种脑结构可塑性的新模式仅发生在一些离散的脑区，用前大多数的研究者都把潜光聚焦在脑室下区( s u b v e n t f i c u l a rz o n e ，s v z ) 和海马绦构中的齿状回( d e n t a t eg y r u s ，d g ) 。在过去的二十年问，该领域主要有两个研究方向：1 ) 稀经予缁胞祥缁脆( 和它们的予彳弋舞簏) 静生秘学蒋馁和薪，董事率经，i 如何整合到己存在的神经网络巾；2 ) 这些新生神经元在脑功能巾的作用。方法学蠲题阻褥了这个领域兹发展，但是氇取得了稳当大静落藤。强藩久稍浚瑷缀稳内在机制和外在因予麸同参与了成年神经再生的调节，而且环境和生理状况也哥鼓影鞫神经菇生，另舞，襻经再生也参与了些藏痰瘸静瘸理过程。目前人们大多使用b r d u 来研究体内的神经再生。照然用b r d u 有很多优点，但是磁存在不少缺点。因琵，研究成年神经再生必籁先歇细鼹( 分子) 水平开始，然后结合在体研究，从而提高研究结果的可靠性。而其中一个前提条件就是需要建立幸串缝蘸僖缀惹静钵外培养投术平台。成年大鼠宇申经前体细胞的体外培养一直以来是一件比较棘手的事情。目前国际l 培养成年神经前体缅施有两种方法：悬浮培养和贴壁培养。悬浮培养醴前还存在争议，一部分学者认为悬浮生长的细胞克隆并非神经球。贴壁培养围际 ：仅g a g e 小缱一家，同时也是舀前被广为认可的蹬舞方法。圈内氇矗没有实验室报导过用贴壁法培养成年大鼠的海马神经前体细胞。l ，型钙通道在神经发育过稔中具有重要作糟，并且有报道电压依赖性钙通道2硕士学位论文参与了胚胎h p c s 向神经元分化的调控。但在成年的h p c s 上是否表达l 一型钙通道目前尚未见报道。本研究的目的是在参照g a g e s 方法的基础上建立一种能够狭得高纯度成年w i s t a r 大鼠海马神经前体细胞( h p c s ) 的体外贴壁培养方法，并鉴定h p c s 上是_ 含存在功能性l 一型钙通道。本实验取w i s t a r 成年雌性大鼠海马组纵，制成单细胞悬液，利用无血清培养技术，在添加碱性成纤维细胞生长冈子( b f g f ) 、表皮生长因子( e g f ) 、n 2 和b 2 7s u p p l e m e n t 的d m e m f 1 2 培养液中进行培养。在培养过程中我们发现，前二代细胞形态主要呈多角型有粗大突起，似星形胶质细胞，部分细胞呈同形，有的呈分裂相。第四代时一种体积较小、呈圆形、周围长有细小突起的细胞逐步代替了原来的细胞。a l v a r e z b u y l l a 和k a p l a na n db e l l 研究证实，成年哺乳动物海马存在两种神经前体细胞，一种细胞相当于s v z 中的b 细胞，表达g f a p ：另一种细胞由b 细胞产生，体积较b 细胞小，称为d 细胞。以上表明我们体外培养的结果与上述报导是一致的。前四代细胞以b 细胞为主，随着传代的进行b 细胞逐渐生成了d 细胞。采用细胞免疫荧光法对原代和第六代细胞分别进行鉴定，呈巢蛋白( n e s t i n ) 阳性的细胞分别达6 6 7 和9 9 9 。在细胞培养液中加入5um o l l 的b r d u ，作用2 4 小时，b r d u 与n e s t i n 免疫荧光双标发现几乎所有的细胞都同时表达这两种抗原，说明细胞处于活跃的分裂增殖期。把培养的高纯度的细胞在分化培养基中诱导分化，分化第五天细胞就表现为神经元、星形胶质和少突胶质细胞的形态，分化第1 4 天细胞免疫荧光分别呈i i i 型b 微管蛋广 ( t u j l ) 阳性和胶质纤维酸性蛋白( g f a p ) 阳性。细胞来源丁成年神经组织的未分化细胞、具有自我复制能力、可分化为神经冗和胶质细胞，表明所培养的细胞为神经前体细胞。细胞免疫荧光和免疫 ：| j 迹结果显示h p c s 表达l 一型钙通道的c a v l 2 c 【l c 和g a y l 3 u i d 亚单位。共聚焦钙成像证明了h p c s 卜存在功能性l 一型钙通道。首先我们在细胞外液中加入2 0m m o l l 的k c l 后，观察到荧光强度显著增强( f f 0 = i 1 7 0 0 3 ，p 0 0 0 1 ，n = 3 7 ) ，表明去极化可诱导细胞内 c a z + ，增加。洗去k c l 加入l 一成年突鼠海马神经前体细胞表达功能蛙的l 一型钙通道型钙通道特异性阻断剂n i f e d i p i n e ( 1 0 h u n o f l ) ，这时荧光强度略有降低( p 0 0 5 ) 。用n i f e d i p i n e 的溶剂乙醇( 1 ) 处理h p c s ，k c l 仍呵诱导荧光强度鲑著增强( f f 0 = i 4 3 o 。0 6 ，p 0 0 5 ，n = l 国。黻土结聚表黉l + 鳘钙通遴介导了k c l 诱导豹钙离子内滚。( f f 0 均为加入k c l 后蒴8 0 秒) 。避步我们掰全细胞膜片钳技术记录到了l 型锈电流：当电压从一3 0 m v 照接去极化到1 0r 玎v ，平均电流为1 0 0p a 士1 2 3 5p a ；特昴性的l 。型钙通道激动剂b a y k 8 6 4 4 ( 1g m o l l ) 使该电流显著增加至1 5 0p a 士1 5 ，1 5p a ( 舻3 ) ，与正常对照组比，涟异显著( p o 0 5 ) ；而1p m o l 。的特异性阻断剂尼氟地平m i f e d i p i n e ) 可明显佼该电流降低翻正常对照缀的6 5 左右 p o 。0 5 ) ，1 0p m o f l 尼氯施平凡乎完全抑制了该电流。以t 结粟袋明成年w i s t a r 大鼠h p c s 表达功能性的l 一型钙通道。关键词：成年大鼠；海屿神经前体细胞；贴魅培养：l 。型钙通道；共聚焦钙成像；膜片钳4硕士学位论文a d u l tr a th i p p o c a m p a ln e u r a lp r o g e n i t o rc e l l se x p r e s sf u n c t i o n a ll t y p ec a l c i u mc h a n n e li nv i t r om s c a n d i d a t e ：f e n gj i n - l is u p e r v i s o r ：g a ot i a n - m i n ga b s t r a c tt h ed i s c o v e r yt h a tt h ea d u l tm a m m a l i a nb r a i nc r e a t e sn e wn e u r o n sw a sab r e a k t h r o u g hi nn e u r o s c i e n c e i n t e r e s t i n g l y , t h i sp a r t i c u l a rn e wf o r mo fs t r u c t u r a lb r a i np l a s t i c i t ys e e m ss p e c i f i ct od i s c r e t eb r a i nr e g i o n s ，a n dm o s ti n v e s t i g a t i o n sc o n c e r nt h es u b v e n t r i c u l a rz o n e ( s v z ) a n dt h ed e n t a t eg y r u s g ) o ft h eh i p p o c a m p a lf o r m a t i o n ( h f ) o v e r a l l ，t w om a i nl i n e so fr e s e a r c hh a v ee m e r g e do v e rt h el a s tt w od e c a d e s ：t h ef i r s ta i m st ou n d e r s t a n dt h ef u n d a m e n t a lb i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fn e u r a ls t e m l i k ec e l l s ( a n dt h e i rp r o g e n y ) a n dt h ei n t e g r a t i o no ft h en e w l yb o mn e u r o n si n t op r e e x i s t i n gn e t w o r k s ，w h i l et h es e c o n df o c u s e so nu n d e r s t a n d i n gi t sr e l e v a n c ei nb r a i nf u n c t i o n i n g ，w h i c hh a sb e e nm o r ee x t e n s i v e l ya p p r o a c h e di nt h ed gm e t h o d o l o g i c a li s s u e sh a v eh a m p e r e dp r o g r e s s ，b u tc o n s i d e r a b l ep r o g r e s sw a sa c h i e v e di nt h i sf i e l d n o ww ek n o wt h a ta d u l tn e u r o g e n e s i si sr e g u l a t e db yi n t r i n s i cp r o g r a m sa n de x t r i n s i cf a c t o r s e n v i r o n m e n ta n dp h y s i o l o g i c a li n f l u e n c eo nn e u r o g e n e s i s ，a n dn e u r o g e n e s i si n v o l v ei nt h ep r o g r e s so f p a t h o l o g i e s t o d a yb r d ua r eu s e di nm o s tv i v or e s e a r c h e s b r d u ，a na n a l o go ft h y m i d i n e ，c a nr e p l a c et h y m i d i n ei n t oc e l l sd u r i n gd n as y n t h e s i s b r d ur e v e a l e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yi sm o r ef r e q u e n t l yu s e da st h ec o s ti sl o w e r ，s e c t i o np r o c e s s i n gi sf a s t e r , a n ds t e r e o l o g i c a la n a l y s i si sp o s s i b l e i na d d i t i o n ，b r d ui se a s i e r成年走鼠海马神经前体细胞表速功畿柱的l 一壁钙通道t oc o m b i n ew i t ho t h e rc e l l u l a rm a r k e r s ，w h i c hm a k e si tp o s s i b l et op h e n o l y p et h en e w l yb o r nc e l l sb yd o u b l eo rt r i p l ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r y + b u tu s i n gb r d uh a v ep i t f a l l s 。f i r s t ，e m b r y o n i ca n dp o s t n a t a li n j e c t i o n so fb r d uh a v eb e e nr e p o r t e dt oi n d u c ep h y s i c a l ，m o r p h o l o g i c a l ，a n db e h a v i o r a la b n o r m a l i t i e s i na d u l t h o o d ，an e u r o t o x i ce f f e c th a sb e e nr e p o r t e di na g e dr a t t o g e t h e rw i t hi t se a r l yt e r a t o g e n i ce f f e c t s ，t h i ss u g g e s t st h a ti n c o r p o r a t i o no fb r d ui n t om i t o t i c a l l ya c t i v ec e l l sm a yi n h i b i tc e l lf o r m a t i o na n da f f e c ts t e ml i k ec e l lp o p u l a t i o n s e c o n d ，c h a n g e si nn e u r o g e n e s i sd e t e c t e db yv a r i a t i o n si nb r d us t a i n i n gm a yb er e l a t e dt oam o d i f i c a t i o ni nb r d ua v a i l a b i l i t yt h r o u g ha da l t e r a t i o ni nb l o o df l o wo ri nb l o o d b r a i nb a r r i e rp e r m e a b i l i t y t h i r d ，p h a r m a c o l o g i c a lt r e a t m e n t so rb e h a v i o r a la n de n v i r o n m e n t i n d u c e dc h a n g e si nn e u r o g e n e s i sm a ye x e r tt h e i re f f e c t sb ym o d i l y i n gt h el e n g t ho ft h ec e l lc y c l e ，t h en u m b e ro fp r o l i f e r a t i n gc e l l s ，o rb o t h 。f i n a l l y ，b r d ul a b e i n gm i g h tp r o d u c ef a l s en e g a t i v e sa n dp o s i t i v e s t h em o s tc o m m o n l yu s e dd o s eo fb r d u ( 5 0m g k g ) l a b e l so n l yaf r a c t i o no ft h ep r o l i f e r a t i n gc e l l s ，w h i c hm a yr e s u l ti na na p p a r e n ta b s e n c eo fe f f e c t so fag i v e ne x p e r i m e n t a ls e t t i n go nc e l lp r o l i f e r a t i o n o nt h eo t h e rh a n d ，h i g h e rd o s e so fb r d ua s s o c i a t e dw i t ha ne n h a n c e ds e n s i t i v i t yo fi m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d sm i g h tl e a dt ol a b e l i n ga p o p t o t i cc e l l so rn o n p r o l i f e r a t i n gc e l l st h a ts y n t h e s i z ed n af o rr e p a i r , a n dt h u st of a l s ep o s i t i v e s t h u st h es t u d yo na d u l tn e u r o g e n e s i sm u s tb es t a r t e df r o mm o l e c u l a rl e v e l ，t h e nt oc o m b i n er e s e a r c hi nv i v o ，a n dt oe n h a n c ep e r s u a s i o no f r e s u l t s 。t h ec u l t u r eo fa d u l tr a th p c si sn o ta l w a y se a s yt h i n g n o w ，t h e r ea r et w om e t h o d sa b o u tt h ec u l t u r eo fa d u l tr a th p c si nt h ew o r l d ：s u s p e n dc u l t u r ea n da t t a c h m e n tc u l t u r e + i ti sd i s p u t e d e do us u s p e n dc u l t u r e ，s o m es c h o l a r st h i n kt h a ts u s p e n d i n gc l o n eo fc e l l sa r en o tn e u r o n s p e r e s t h em e t h o do fa t t a c h m e n ti so n l yp o s s e s s e db yg a g e sg r o u p ，a n di ti sa c c e p t e db ym o s ts t u d e n t s ，l - t y p ev o l t a g e g a t e dc a 2 + c h a n n e l sh a v eac e n t r a lr o l ei nn e u r a ld e v e l o p m e n ta n di t si n v o l v e m e n ti nt h em o d u l a t i o no fn e u r a ld i f f e r e n t i a t i o nw a sr e p o r t e di ne m b r y o n i ch p c s h o w e v e r , t h e r ei sn od a t as h o w i n gt h ee x p r e s s i o no ff u n c t i o n a ll - t y p ec a c h a n n e l si na d u l th p c s t h ea i m so ft h ep r e s e n ts t u d ya r et oe s t a b l i s ha l li nv i t r oa t t a c h m e n tc u l t u r em e t h o df o ro b t a i n i n gh i g h l yp u r i f i e dh p c sf r o mt h eh i p p o c a m p u so fa d u l tw i s t a rr a t s6硕士学位论文a n dt oi d e n t i f yf i m c t i o n a ll t y p ec a l c i u mc h a n n e l si nt h o s ec e l l s t h ea d u l tr a th i p p o c a m p a lt i s s u ew a sd i s p e r s e di n t oas i n g l ec e l ls u s p e n s i o n ，a n dt h ed i s s o c i a t e dc e l l sw e r ec u l t u r e di ns e r u m f r e ed m e m f 1 2m e d i u mc o n t a i n i n ge p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ( e g f ) ，b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( b f g f ) ，n 一2a n db 2 7s u p p l e m e n t a tp a s s a g e0t o2 ，t h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fm a j o r i t yo fc u l t u r e dc e l l sw i t hl a r g et h i c kp r o c e s s e sa n dp o l y g o ni ss i m i l a rt ot h a to fa s t r o c y t e ，w h i l eas m a l ln u m b e ro f c e l l sa r er o n n da n ds o m eo f t h e s ec e l l sa r ed i v i d i n g ，a tf o u r t hp a s s a g e ，s m a l lr o u n dc e l l sw i t hm i np r o c e s s e sg r a d u a l l yr e p l a c e dt h ep r i m a r yc e l l si nt h ec u l t u r e i th a sb e e ns h o w nb ya l v a r e z b u y l l aa n dk a p l a na n db e l lt h a tt h e r ea r et w ot y p e so fs t e m l i k ec e l l si nt h ea d u l tm a m m a l i a nh i p p o c a m p u s ，o n ee x p r e s s e sg f a f , e q u i v a l e n tt ot h et y p ebc e l l si nt h es v z a n o t h e ro n ei sn a m e ddc e l l ，w h i c hi sd e r i v e df r o mbc e l l sa n di t ss i z ei ss m a l l e rt h a nbc e l l s w es u g g e s tt h a ta tp a s s a g e0t o3 ，t h em a j o r i t yo fc u l t u r e dc e l l sm a yb et h ebc e l l sa n dt h e r e a f t e rdc e l l sa r ep r o d u c e db ybc e l l sa n df i n a l l yb e c o m ed o m i n a n tp o p u l a t i o n a f t e rs i xp a s s a g e s ，t h ep r o p o r t i o no fn e s t i n p o s i t i v ec e l l sr e a c h e dt o9 9 9 w h i c hw e r eu s e di nt h ef o l l o w i n gs t u d i e s a f t e ra d d i t i o no fb r d ut oc u l t u r em e d i u mf o r2 4h o u r s ，i m m u n o f l u o r e s c e n td o u b l el a b e l i n gs h o w e dt h a ta l m o s ta l lc e l l se x p r e s s e db o t hb r d ua n dn e s t i n ，i n d i c a t i n gt h a tn e s t i n p o s i t i v ec e l l sa r ei nt h ea c t i v ep r o l i f e r a t i o ns t a t e f o l l o w i n gf i v e d a y sc u l t u r ei nd i f f e r e n t i a t i o nm e d i u m ，n e u r o n - l i k ea n da s t r o c y t e c e l l s l i k ea n do l i g o d e n d r o c y t e l i k ew e r eo b s e r v e d a n da tf o u r t e e n d a y s ，e x p r e s s i o no fb t u b u l i ni i i ( t u j1 ) a n dg l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ( g f a p ) w a sd e t e c t e di nt h e s ec e l l s ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t st h a tc u l t u r e dc e l l sa r ed i s s o c i a t e df r o ma d u l th i p p o c a m p u s ，h a v ea b i l i t yo fp r o l i f e r a t i o n ，a n da r ei n d u c e dt op r o d u c en e u r o n so ra s t r o c y t e si n d i c a t et h a tt h e s ec e l l sa r ea d u l th p c s i m m u n o f l u o r e s c e n td o u b l el a b e l i n gs h o w e da ne x p r e s s i o no fc a v l 2 n l ca n dc a v l 3 a i ds u b u n i t si nh p c s ，a n df u n c t i o n a ll t y p ec a l c i u mc h a n n e l sw e r ec o n f i r m e db yc o n f o c a lm i c r o s c o p i cc a “i m a g i n g f i r s t ，t h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t yi nh p c sw a se n h a n c e ds i g n i f i c a n t l ya f t e ra d d i t i o no f2 0m m o l lk c li n t oe x t r a c e l l u l a rm e d i u m ( f f 0 2 1 1 7 4 - 0 0 3 ，p 0 0 5 ) h o w e v e r ，p r e t r e a t m e n to fe t h a n o l ( m e n s t r u u mo fn i f e d i p i n e ) f o r2 0 ss h o w e dn oo b v i o u se f f e c to nt h ei n c r e a s ei nt h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t ) i n d u c e db yd e p o l a r i z a t i o n ，i n d i c a t i n gt h a tt h eb l o c k i n ga c t i o no fn i f e d i p i n ei sn o td u et oe t h a n 0 1 i na d d i t i o n ，k c ld i dn o tp r o d u c ea n yc h a n g e si nf l u o r e s c e n ti n t e n s i 每i ne x t r a c e l l u a rm e d i u mw i t h o u tc a l c i u m ( f f o = 1 0 1 士0 0 1 p 0 0 5 n = 1 0 ) t h ea b o v er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tl - t y p ec a l c i u mc h a n n e l si n v o l v ei nk c i i n d u c e dc a l c i u mi n f l u x 。m o r e o v e ll t y p ec a l c i u mc h a n n e lc u r r e n t sw e r er e c o r d e di nt h o s ec e l l sb yu s i n gw h o l e c e l lp a t c hc l a m pt e c h n i q u e s 1m m o lb a y k 8 6 4 4 ，as p e c i f i cl t y p ec a l c i u mc h a n n e la g o n i s t ，m a d et h i sc u r r e n te n l a r g es i g n i f i c a n t l yd 0 0 5 ) w h e r e a s1m m o l ln i f e d i p i n ei n h i b i t e dt h ec u r r e n tb y3 5 ( p l o ”q ，朝形成全缀匏盼记录方式。全细胞的记录方式有以下优点：可观察。个完整细胞的电活瀵，测擞中有较好的信噤比。在电流钳铜条件下，可沁录单细施动作魄位；在电压钳制条件下，可记慕通过细胞膜所有离子电流的总和。如将膜电位钳制在菜一程度，即可选择往的捧翻菜塑通道的活动，丽只汜渌菜些通道宅流的总和。在全细胞记录中，由于细胞体积的麓异，同一通道电流有时差别很大，凶此通常用单须士擎梭论文位西积的电流密度来袁示。本研究中采用了目前豳际上常用的单位屯容中电流大小的方法来表示电流密度。可在同一细胞蕊祭多种通道的情况。尤其是对于三维结构的心肌细胞，做普通哇土压钳实验很困难，全细胞膜片钳实验完全可隘替代常簸的电琏谮实验。对细胞的损伤小，蘩本绦待了细麓的功状态，有利于观祭某些通道的变化或药物对某类通道的影响。并可把可兴奋细胞的电活动与菲兜活动联系超来逶行研究。已j “泛翊予许多壹经较枣豹缩胞。骈究细胞内环境对离子通道的影响。i 姻于全细胞记录的电极内液与细胞内液直接相道，改变l 鬯稷滚成分或穆羧蕊察静药秘翻在龟板液中，遥过扩散，它销 辱缀浃与细胞内液达到平衡h 现效应，戏相当细胞内注药。6 7 2l 。鳖钙电流电裰肉液和矫液的配稍电极波渡组成( r e t o o l l ) ：c e s i u mm e t h a n e s u l f o h a t e1 4 5 ，h e p e s1 0 ，e g t a1 l ，c a c l 2 - 2 h 2 01 ，m g c l 2 6 h 2 05 ，a t p m g5 ，l e u p i t i nh e m i s u l f a t e0 1 。毫稷努滚缝袋( m m o l & ) c h o l i n ec h l o r i d e7 5 ，t e a a5 0 ，m g c h - 6 魄o2 ，c s c l5 ，b a c l 25 ，g l u c o s e1 0 ，t e t r o d o t o x i n0 0 0 1 和1 0 h e p e s 。b 矿( 5 m m o l l ) 是俸为载瘸子。嚣蠢溶滚均爝直径是o 。2 2 艄l 黪滤袋过滤，p h 援t e a - o h 调节n 7 3 。6 7 - 3 全细胞膜片钳记录 2 2 , 2 3 将生长有h p c s 的盖玻片置于含有细胞外液的记录稽中，记录稽盖于倒篱显微镜( o l y m p u si x 2 7 0 ，日本) 工作爵一卜，在显微镜下找到细胞，利用三维操纵器( n a r i s h i g e ，e t 本) 将充灌细胞内液的玻璃微电裰( 入水阻抗2 5 3 。5m r 2 ) 移近细胞并轻压在细胞表丽，用负压使电极尖端与细胞膜表面形成高阻抗封接( a n 级) ，孬戬较大的受压啜破细胞貘，奉 偿电容电流及电极串联隧辘形成全绥施谴激。钳制电压为一5 0m v , 从一3 0m v 至l j + 4 0m v 给予去极化脉冲，步距为1 0m v ，并用特舞往l 一型钙逶遥激动7 f i b a y k 8 6 4 4 及窿断弃r j n i f e d i p i n e 予 = l l ，记录电流懿变纯。实验过程p c l a m p 5 5 0 ( a x o ni n s t r u m e n t ，美国) 控制，通过c e z + 2 3 0 0 膜片钳放大器( n i h o nk o h d e n ) 及薯0 。1 2 5 数篌转换嚣( s c i e n t i f i cs o l u t i o n s ) 羧翱摇令瞧挂、信号采集，并将倩号存储于计算机硬盘中。p c l a m p 8 0 软件对数据分析。7 撬计方法试验均重复3 次，所有数据焉m e a n 圭s e 表示。缱阕眈铰采溺o n e 。w a ya n o v a 分析，以p o 0 5 作为显著性差异的临界值。成年太鼠海马神经前体垂时胞表达功能性的l 一型钙通道1 。h p c s 羚体多 壤葬旋鉴定结果1 1h p c s 的分离和贴蹙培养为了提高h p c s 的成活率，第。天接种用含有1 0 f b s 的d m e m f 1 2 培养繁。接穆蓐镜下双察可冕大量有突起兹攀令享孛经缨蔻零少霪强影缨麓，嚣形缨黪沉于培养瓶的底部。2 4 小时后弃上清换干细胞培养基，观察可见非常稀疏的细胞贴于糕底，长至筵七天菇次鼹察发琨缨腿数量明显增多，鼗时羧滚l 忍，以后每三天换液3 5 。换液时镜下观察细胞状态及密度，随着时问的推移，可见细胞数最逐濒增多，第1 4 天，缨骢密艘进一步增大，缀胞几乎镳满整个瓶底，形成一个个的细胞克隆，克隆中心细胞密度大，细胞不停向周围扩展。为了细胞更好的增殖存活，这时应及时传代。以后每8 1 0 天传代次。前三代细臌形态兰要呈多角型有粗大突起，似星形胶质细胞( 囝1 a ) ，密度大对缅施交织成溺，韶分细胞呈圆形，有的璺分裂棚。第四代时一种体积较小、呈圆形、周围长有细小突起的细胞逐步代澄了原采的细胞( 阿1 b ) 。生长至第六代，视野下几乎全部是这种新生细胞( 图1 c ) 。1 2 h p c s 的箍定分裂取黢幸窝传代珐养豹缨燕徽免疫焚光鉴定，发瑗珑袁鲴怒袭达n e s t i n抗原。n e s t i n 抗原属筛类巾间丝，在神经板上皮细胞即开始表达，当神经细照懿迂移基本完成之蜃n e s t i n 兹表达最开始下蹲，并隧害枣经缨羹蛏分化豹完成霜停止表达。n e s t i n 系早期原始神经细胞的标志物，已被广泛用丁 神缝干细胞的鉴定。我们发现踉代n e s t i n 阳性黪纲胞比铡仪有6 6 。7 ，但燕题代n e s t i n 娲性的细胞比例已达到9 2 o ，而到第六代时，n e s t i n 阳性的细胞可达到9 9 9 ( 图2 a ) ，这表明纲胞培养传代的过程同时也是h p c s 的个逐步纯化的过稷。以下实验均取用第六代以后的细胞。程缨魅培葵滚申攘入5g m o l 尼懿b r d u ，作用2 4 小时，灸疫荧光双撂b r d u与n e s f i n ，发现几乎所有的细胞都同时表达这两种抗原，说明细胞处于活跃的分裂增聚款( 匿2 b ) 。1 3h p c s 的诱导分化和鉴定硕士学位论文恕予缨腿壤羚基换域分化塔莠基( d i f f e r a t i a t i o nm e d i u m ) ，诱导h p c s 麴分化。分纯第五天凌下蕊察发貔缡鼹均长良突起，已秘步具骞糖经元秘黢矮缨豫影态。具有一个妓两个长突起，魁体呈嗣形或糖魁形的乎枣经元梯缨腿( 图3 a ，a ) ；具有多个粳长突起秘多角形魁钵兹攫形胶痰样缨骢( 圈3 a 毒) ；具有多令缨长突起且不断分拨的少突胶质样细胞( 闼3 a ，c ) 。分化麓1 4 天细胞免疫荧光i i ：见t u j l ( 阁3 b ) 和g f a p 圈3 c ) 晌鳓性纫熙。分离培养的细胞表达n e s l i n 抗原，能逑行自我复制并分化成神经元和胶质细胞，从丽证明了所培养细胞为神经前体细胞。2 。h p c s 上表达功1 & 性l - 型钙通道2 1l - 裂钙遵遴蛋是戆浚达自予描l 亚擎佼是缀成功麓经。型锈遥暹魏一个登鬻秘噩单位；程，叉分爻多种蓝鍪搿1 ，在稀缀元中主蟹为c a v l 2 伐l c 和c a v l 3 c 1 d 。闳藏，我 f 】搀l 型钙邋逶鞠这薄，莘孛驻零应与n e s t i n 淑括，缝祭袭鞠h p c s 呈c a r l 2 a c 窝c a v l 。3 毯l d鞠性。鬻4 a 为c a r l 2 c t l c 移n e s t i n 共瓣标记。c a r l ，3 锄d 与n e s t i n 双梅鬻像泰绘是。w e s t e r n b l o t 结累也表骥“r 缨腿有c a v l 2 c t l c 和c a r l 3 程l d 强是的袭达( 躁4 b )2 0 锈藏豫为证明h p c s 上存在功能性l 型钙通道，我们通过麸聚焦显微镜，对已负载f i u o 一3 的h p c s 进行荧光扫描。首先我们在鲡胞外液中加入2 0m m o l 懿k c l后，观察到荧光强度显著增强( p 0 0 0 1 ，n = 3 7 ) ( 闺5 a ，b ) ，表明基极化叮诱导细腿r 勾 c a z j i 璜稍。洗去k c i 加入l 一攀钙遂邋特异往辩断韵n i f e d i p i n e ( 1 0 p m o l l ) ，这时荧光强度略有降低 o 0 5 ) ( 窝5 b ) 。髑n i f e d i p i n e 翁溶涮己醇( 1 ) 楚壤h p c s ，k c l 仍可诱导荧光强魔整箸蹭强( p o 0 5 ，n = l ( 圈7 ) 。以上结聚袭疆己翟