（神经生物学专业论文）牛蛙视网膜视锥细胞甘氨酸受体的表达与功能.pdf

缩略语及符号 g q h e p e s h r h z 玳l 口l m n l l n m v m q n 缩略语及符号 英文名称 b i p o l a rc c u c o n ep h o t o r e c e p t o r c 它n t r a ln e r v o u ss y s t e m 5 ，7 - d i c h l o r o k y n u r e n i ea c i d d i m e t h y ls u l f o x i d e c o n c e n t r a t i o no f h a l f - m a x i m a lr e s p o n s e e q u i l i b r i u mp o t e n t i a lo f c h l o r i d e r e v e r s a lp o t e n t i a l e t h y l e n e b i s ( o x y e t h y l e n e n i t r i l o ) t e t r a a e e t i ca c i d g a n g l i o nc e l ll a y e r g i g a o h m n - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - n 【2 一e t h a n e s u l f o n i c a c i d 】 h o u r h e r t z i n n e rn u c l e a rl a y e r i n n e rp l e x i f o r m l a y e r m 0 1 1 m i n u t e m i l l i v o l t m e g a o h m h i l lc f f i c i e n t 中文名称 双极细胞 视锥细胞 中枢神经系 统 5 ，7 一二氯犬 尿烯酸 二甲基亚砜 半反应浓度 氯离子平衡 电位 翻转电位 神经节细胞 层 千兆欧姆 小时 赫兹 内核层 i p l 摩尔每升 分钟 毫伏 兆欧姆 h i l l 系数 4 躺陇 吣 一 一 勋 k 一眦 缩略语及符号 n u m b e ro f c e l l s n - m e t h y l - d - a s p a r t a t e o u t e rn u c l e a rl a y e r o u t e rp l e x i f o r ml a y e r r o d p h o t o r e c e p t o r s e c o n d s t a n d a r de r r o ro f t h em e a n m i c r o l i t e r t t m o t l 细胞例数 卜甲基一d 天冬氨酸 0 n l o p l 视杆细胞 秒 标准误 微升 微摩尔每升 5 n 一 眦吼砌 。一m 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作r 明确的声明 并表示的谢意。 作者签名：日期 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：导师签名：l a 期 中文摘要 一、中文摘要 牛蛙视网膜视锥细胞甘氨酸受体的表达与功能 甘氨酸是脊椎动物视网膜中一种重要的抑制性神经递质，通过激活其特异的 受体而起作用。甘氨酸受体是配体门控的氯通道，主要由配体结合的a 亚基m 1 ， 以，a n d 和结构性的1 3 亚基组成。 本工作运用免疫细胞化学和全细胞膜片钳技术，研究了甘氨酸受体在牛蛙视 网膜视锥细胞上的表达。在视网膜垂直切片和分离视锥细胞上的免疫双标结果显 示，视锥细胞终末和内段有甘氨酸受体a 1 和p 亚基的免疫阳性反应。进而， 在分离的视锥细胞上，施加甘氨酸可以诱导持续的内向电流，该电流的幅度与甘 氨酸浓度呈明显的剂量依赖关系，其半反应浓度为6 7 3 4 - 4 9t t m 。该电流可被甘 氨酸受体拮抗剂士的宁( s t r y c h n i n e ) 完全压抑，但是不能被2 0 0 “mn 一甲基一 d 一天冬氨酸( n m d a ) 受体甘氨酸位点阻断剂5 ，7 一二氯犬尿酸( d c k a ) 所压 抑。甘氨酸诱导电流的翻转电位接近氯平衡电位，且与胞外氯浓度相关。以上结 果显示，士的宁敏感的甘氨酸受体在牛蛙视网膜视锥细胞上有功能性表达，可能 在视网膜外层接受内层反馈信号的过程中起重要的作用。 关键词：甘氨酸受体；视锥细胞；视网膜；免疫荧光双标；全细胞膜片钳 中图分类号：q 4 2 6 英文摘要 二、英文摘要 g l y c i n el 佻e p t o 体a r ef u n c t i o n a l l ye x p r e s s e do nb u l l f r o gr e t i n a lc o n e p h o t o r e c e p t o r s l i - h a ng e ( n e u r o b i o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f x i o n g - l iy a n g a b s t r a c t g l y c i n ei sam a j o ri n h i b i t o r yn e u r o t r a n s m i t t e ri nt h ev e r t e b r a t en 嚏he x e r t i n g i t sa c t i o nt h r o u g ht h eg l y c i n er e c e p t o r ( g l y r ) o y ri sal i g a n d - g a t e dc h l o r i d e c h a n n e l ，w h i c hi sc o m p o s e do fl i g a n db i n d i n ga - s u b u n i t s l ，a 2 ，略a n da 4 ) a n da s t r u c t u r a lp - s u b u n i t u s i n gi m m u n o c y t o c h e m i c a la n dw h o l ec e l lr e c o r d i n gt e c h n i q u e s ， w ee x a m i n e de x p r e s s i o no fg l y c i n er e c e p t o r so nb u l l f r o gr e t i n a lc o n ep h o t o r e c e p t o r s i m m u n o f l u o r e s c e n c ed o u b l el a b e l i n ge x p e r i m e n t sc o n d u c t e do nr e t i n a ls e c t i o n sa n d i s o l a t e dc e l lp r e p a r a t i o n ss h o w e dt h a tt e r m i n a l sa n di n n e rs e g m e n t so fc o n e sw e r e i m m u n o r e a c t i v et ob e t ha la n dbs u b u n i t so fg l y c i n e r e c e p t o r s m o r e o v e r , a p p l i c a t i o n o f g l y c i n ei n d u c e das u s t a i n e di n w a r dc u r r e n tf r o mi s o l a t e dc o n 豁, w h i c hi n c r e a s e di n a m p l i t u d ei nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r , w i t ha ne c s 0o f6 7 3 士4 9 肛m ，a n dt h e c u n c n tw a sb l o c k e db yt h eg l y c i n e 舱c 印t o fa n t a g o n i s ts t r y c h n i n e ，b u tn o t 5 ， 7 - d i c h l o r o k y n u r e n i ca c i d ( d c k a ) o f2 0 0 脚，ab l o c k e ro ft h eg l y c i n er e c o g n i t i o n s i t ea tt h en - m e t h y l - d - a s p a r t a t e ( n m d a ) r e c e p t o r t h eg l y c i n e i n d u c e dc u r r e n t r e v e r s e di np o l a r i t ya ta p o t e n t i a lc l o s et ot h ec a l c u l a t e dc h l o r i d ee x l u l l i b f i u mp o t e n t i a l ， 7 英文摘要 a n dt h er e v e r s a lp o t e n t i a lw a sc h a n g e da saf i m c t i o no ft h ee x t r a c e l l u l a rc h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ts t r y c h n i n e - s e n s i t i v eg l y c i n er e c e p t o r sa r e f u n c t i o n a l l ye x p r e s s e di nb u l l f r o gc o n e s w h i c hm a ym e d i a t es i g n a l d b a d 【f r o m g l y c i n e r g i ci n t e r p l e x i f o r mc e l l st oc o n e si nt h eo u t e rr e f i 舰 k e y w o r d s ：g l y c i n er e c e p t o r , c o n ep h o t o r e c e p t o r , r e t i n a , i m m u n o f l u o r c s c c n c cd o u b l e l a b e l i n g ，w h o l ec e l lr e c o r d i n g 中图分类号：q 4 2 8 三、正文 ( 一) 、前言 视觉系统对于脊椎动物而言，在所有的感觉系统中具有举足轻重的作用。至 少有7 0 以上的外界信息由视觉系统接受、处理和感知 4 5 1 。所有脊椎动物的视 网膜均按同一基本模式组织起来( 图1 ) ：大体上由外网状层( o u t e rp l e x i f o n nl a y e r , o p l ) 、内网状层( i n n e rp l e x i f o r ml a y e r ，i p l ) 两个突触层，和外核层( o u t e r 远端 近端 外核层 外罔层 内被层 内用层 神经节细j i g , t i t - 图1 视网膜神经元的组构模式图。光信号由光感受器细胞转变成分级电位形式 的电信号，经过视网膜中各级神经元的加工和处理，最后由神经节细胞将分级电 位转化成动作电位向视觉中枢传递。注意由网间细胞伸向外网层的突起。h e ，水 平细胞；b e ，双极细胞；a c ，无长突细胞；c , - c ，神经节细胞；i p c ，网问细胞。 包裹神经元的胶质细胞( 主要为m i l l e r 细胞) 未显示 n u c l e a rl a y e r , o n l ) 、内核层( i n n e rn u c l e a rl a y e r , i n l ) 和神经节细胞层( g a n g l i o n 9 ，l，tj、i，fj，iljll，ili，lfkfj，i，j c e l ll a y e r , g c l ) 三个细胞层组成。 图2 甘氨酸受体的结构。甘氨酸受体由3 个皿亚基和2 个b 亚基组成， n 亚基是配体结合亚基，b 亚基是结构性亚基，与突触后膜蛋白g e p h y r i n 结合将受体固定在细胞骨架上。内源性激动剂g l y c n e 结合在甘氨酸受体的 a 1 亚基上，而s t r y c h n i n e 是甘氨酸受体的竞争性拮抗剂。受体激活时，氯 离子内流，细胞膜超极化。 光线进入眼球后，被最远端的光感受器外段吸收，触发整个视觉过程。除光 感受器外，视网膜还有双极细胞o i p o l 越c e l l ，b c ) 、水平细胞( h o r i z o n t a lc e l l ，h c ) 、 无长突细胞( a m a c r i n e c e l l ，a c ) 、神经节细胞( g a n g l i o n c e l l ，g c ) 和网间细胞 ( i n t e r p l e x i f o r mc e l l ，口c ) 等神经元。光感受器与水平细胞、双极细胞的突起组成 o p l ；而双极细胞、无长突细胞与神经节细胞形成的突起组成i p l ，而m u l l e r 细胞则贯穿整个视网膜。视觉信息传递的纵向通路是：光感受器一双极细胞一神 经节细胞，而水平细胞和无长突细胞则分别在o p l 和i p l 起横向的信号调制和 1 0 前言 整合作用。值得注意的是，网间细胞除了在i p l 有大量的突起外，还有少量的突 起延伸至o p l ，为视觉信息的逆向传输提供了可能。 甘氨酸是脊椎动物视网膜中一种重要的抑制性神经递质，能通过激活其相应 的受体而起到重要的生理作用。甘氨酸受体是配体门控的氯离子通道，主要由配 体结合的a 亚基 l ，以，a 3a n d a 4 ) 和结构性的p 亚基组成 2 7 】。a 亚基单独表 达能形成有功能的同聚体，说明a 亚基是能与配体结合的亚基；p 亚基单独表达 时受体无活性，其第二胞内环和突触后膜蛋白g e p h y r i n ( 9 3k d ) 连接，后者将甘 氨酸受体锚定在胞内微管和微丝上，对受体的功能特性和突触传递效能有显著影 响。成年动物的甘氨酸受体通常由3 个a 亚基和2 个b 亚基组成( 图2 ) 。 视锥细胞是视觉通路的第一级神经元，它能在o p l 与双极细胞和水平细胞 等形成突触连接。在两栖动物中，以爪蟾为例，其视锥细胞分为紫外光敏感的小 单视锥细胞( m i n i a t u r es i n g l e c o n e ) ，约占3 6 - 4 1 ；蓝光敏感的中等大小的单视 锥细胞( m e d i u ms i n g l ec o n e ) ，约占9 1 0 2 ；红光敏感的大单视锥细胞( 1 a r g e s i n g l ec o n e ) 和红光敏感的双视锥细胞( d o u b l ec o n e ) ，二者一共约占8 6 - - 8 8 在两栖动物视网膜中，有甘氨酸能的网间细胞和无长突细胞【5 ，3 5 ，3 6 ，4 3 。 网间细胞有突起延伸到外层视网膜，从而形成视网膜内层到外层的反馈通路( 参 见图1 中i p c ) 3 5 ，3 6 b 而无长突细胞主要通过交互型突触与双极细胞进行信 息交换 2 8 ，4 3 。低等脊椎动物甘氨酸受体广泛分布在内层视网膜o p 3 6 ，4 0 ，4 1 ， 4 6 ，4 7 ，5 2 ，这与哺乳动物视网膜类似 1 0 ，1 2 ，1 3 ，2 4 ，4 2 。甘氨酸可以在多 种神经元上诱导电流：包括双极细胞、无长突细胞和神经节细胞【6 ，7 ，1 1 ，2 3 ， 3 7 ，这同免疫组化的结果相吻合。另外，在牛蛙视网膜上，甘氨酸可以分别在 前言 双极细胞的树突和轴突上诱导电流，其甘氨酸可能分别来源于甘氨酸能的网问细 胞和无长突细胞【6 ，7 】。在哺乳动物和非哺乳动物的外层视网膜中，同样可以观 察到甘氨酸受体的免疫荧光标记 1 0 ，1 9 ，3 3 ，3 6 ，加，4 1 ，4 6 。在牛蛙视网膜 o p l 中，可以观察到甘氨酸受体a 1 和b 亚基的免疫标j _ 己 1 9 1 。一般认为这些标 记是光感受器突触后成份，如双极细胞和水平细胞。已有免疫标记结果显示，金 鱼视网膜视锥细胞某个亚型的连接轴胞质中有甘氨酸受体的免疫反应，但其质膜 上却没有 4 6 】。在短尾猴视网膜视锥细胞内段，可以观察到点状的甘氨酸受体免 疫标记 1 0 1 。最近，在猪的少部分视锥细胞中观察到甘氨酸受体免疫阳性反应， 而在同一群视锥细胞中，r t - p c r 方法也检测到了甘氨酸受体b 亚基的表达，施 加甘氨酸也确实能诱导较大的电流【l 】。本文主要运用免疫双标和全细胞膜片钳 技术，证明了在牛蛙视网膜视锥细胞上表达有功能性的甘氨酸受体。我们的结果 显示，在牛蛙视网膜的视锥细胞上能标记出甘氨酸受体a 1 和p 亚基，施加甘氨 酸能在大多数的视锥细胞中诱导出电流。 材料和方法 1 免疫荧光组织化学 1 1 标本的制备 ( 二) 、材料和方法 牛蛙( r a n ac a t e s b e i a n a ) 从市场购得，在自然光照和室温下饲养不超过3 天，其问一般不需喂食，但需每天换水清洁。实验用牛蛙选择成年雄性个体，体 长1 0 2 0c m ( 1 5 0g 至2 0 0g ) 。牛蛙成年雄性个体与雌性个体可以通过如下方 法加以区分；l 、成年雄性个体的鼓膜较眼球大，而雌性个体的鼓膜和眼球大小 接近；2 、在生殖季节，雄性个体的下颌有深绿色或黄绿色的色斑，而雌性个体 没有。 1 5 ，1 6 在暗红光及室温( 2 3o c ) 条件下，用针锥经枕骨大孔迅速插入脊髓并搅动损 毁下行通路，稍微回针，在针尖不退出枕骨大孔的情况下，迅速转向脑部，捣毁 脑组织；通过角膜反射消失确认牛蛙死亡后，尽快将眼球取出，用刀片沿眼球最 大直径处横向切开眼球，弃去含角膜的上半部，将底部的眼杯倒扣，将视网膜粘 附于滤纸上，置于含o 1m 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r , p b ，p a7 4 ) 和4 多聚甲醛固定液中固定1 0r a i n ，将已固定的视网膜分别浸入1 0 、2 0 蔗糖磷 酸盐缓冲液( 质量体积比，w v ) 4o c 各两个小时，3 0 蔗糖磷酸盐缓冲液4o c 过夜进行脱水处理。然后将视网膜用o c t ( m i l e si n c ，e l k h a r t , i n ，u s a ) 包埋，用 低温切片机( l e i c a , n u s s l o c h , g e r m a n y ) 垂直切片，片厚1 4t t m ，裱于涂明胶的载 玻片上。沿切片周围用d a k o 笔画圈以免后续滴加的液体外溢。贮存于- 2 0o c 冰箱内备用。 1 2 免疫荧光组织化学反应 免疫荧光标记应用片染法。用0 0 1m p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e d - s a l i n e ，p h7 4 ) 漂洗组织3 次，每次1 0m i n 。将视网膜切片浸入含o 2 t r i t o nx - 1 0 0 的p b s 中 过夜，以增加其对抗体的通透性。将视网膜切片浸入含6 正常驴血清和0 2 1 3 材料和方法 t r i t o nx - 1 0 0 的p b s 中于4o c 过夜以降低非特异性背底染色，然后分别移入含 6 正常驴血清、1 正常牛血清白蛋白、0 2 t r i t o nx - 1 0 0 的p b s 稀释的抗g l y r 旺1 山羊多克隆抗体( c 1 5 ，稀释度1 ：2 5 0 ) ，抗g i y rp 山羊多克隆抗体( n - 2 0 ，稀释 度1 ：2 5 0 ) ( s a n t ac r u zb i o t h n o l o g y , s a n t ac r u z , c 八u s a ) 于4o c 孵育7 2l l r 。为 了双重免疫荧光标记，一组一抗用抗g i y ra l 山羊多克隆抗体免疫标记于4o c 孵育7 2h r ，用p b s 漂洗3 x 1 0r a i n 后用1 ：2 0 0 德克萨斯红偶联的驴抗山羊i g g ( t e x a sr e dd y e - c o n j u g a t e dd o n k e ya n t i - r a b b i ti g gj a c k s o ni m m u n o r e s e a r c h l a b o r a t o r i e s ，u s a ) 的二抗于4o c 孵育2h r 。另一组一抗用抗r e c o v e r i n 兔多克隆 抗体( 稀释度1 ：1 0 0 0 ，c h e m i c o n , t e m e c u l a , c a ，u s a ) 特异性标记光感受器【3 0 】， 4o c 孵育7 2l l r ，用p b s 漂洗3 x 1 0m i n ，然后用1 ：2 0 0 稀释的f i t c ( f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ，j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c hl a b o r a t o r i e s , u s a ) 偶联的驴抗兔i g g 于 4o c 孵育2l l r ，再以p b s 漂洗3 x 1 0m i l l 。然后将己充分反应好的视网膜垂直切 片用甘油封片。已充分反应好的切片先在荧光显微镜下观察，挑选出标记较好的 切片，然后用共聚焦激光扫描显微镜观察。 为了进一步观察g l y r 在不同类型的视锥细胞上的分布，我们亦在分离的牛 蛙视网膜视锥细胞上标记了o y ra l 和b 。牛蛙视网膜视锥细胞的分离的详细步 骤可参考( 二) 3 部分。将分离好的牛蛙视网膜细胞滴种于盖玻片上约2 3m l ， 过2 0 2 5r a i n 后待分离的细胞充分沉淀并贴壁，用玻璃吸管尽可能地将上部溶 液吸取，并保证贴壁细胞的完整。细胞先在4 多聚甲醛固定液中固定1 0r a m , 用p b s 洗3 次，在常温下封闭非特异性反应3 0m i n ，加一抗反应2l l r ，用p b s 洗3 次，再加二抗反应3 0r a i n ，用p b s 洗3 次。待反应完全后，用甘油封片， 并进一步用共聚焦激光显微镜观察。 1 3 共聚焦激光扫描显微镜观察 免疫荧光反应的视网膜切片和分离细胞样本在t c s - n t 共聚焦激光扫描显 微镜( l e i c a , g e r m a n y ) 下观察，使用4 0 倍物镜。光学扫描间隔为o 5t u n ，数据 用p h o t o s h o p7 0 处理。 1 4 材料和方法 将牛蛙视网膜剥离并放置于5n l l 的离心管内，一般1 0 个牛蛙视网膜加1 2 “ 裂解液及2 4 儿蛋白质抑制剂。在冰水环境中匀浆3 4 次每次1 0s ，每次匀 浆间隔l om i n 。匀浆完毕后，在离心机中离心3r a i n ，转速为3 1 0 0r m 。吸取上 清液在7d o c 低温冰箱贮存待用。将2 0 山的提取样本( 2 0m g m l ，2 0 此) 上 样到己制备好的1 2 s d s p a g e 胶上，电泳分离蛋白。然后利用m i m i - p r o t c i n3 e l e c t r o r e s i ss y s t e m 和m i m it r a n s - b l o te l e t r o p h o r e t i ct r a n s f e rs y s t e m ( b i o - r a d ； h e r c u l e s ，c a , u s a ) ，在5 0v 电压下将提取样本蛋白电泳至s d s o p a g e 胶上， 再从s d s p a g e 胶上转到p v d f 膜上，3 0 0m a 恒流转膜，转膜时间为2l l r 。将 已转膜完毕的p v d f 膜用封闭缓冲溶液( 2 0m mt r i s h c i ，p h7 4 ，1 3 7m mn a c i ， 0 1 t w e e n2 0 ，2 0 脱脂奶粉) 封闭2h r 。将g 1 y rn l 和p 的抗体皆以1 ：5 0 0 稀释于5 的脱脂奶粉中，然后将封闭好的p v d f 膜分别放入含g l y ra 1 和b 抗体的溶液中，在4o c 的环境下反应7 8 h r 。当反应充分以后，用t b s t 溶液 洗脱三次，每次1 0m i n 。加入辣根过氧化物酶驴抗山羊i g g ( 1 ：5 0 0 0 ，s a n t ac r u z b i o t e c h n o l o g y , u s a ) 4o c 条件下反应2l l r 。当充分反应以后，用t b s t 溶液洗 脱三次，每次1 0r a i n 。最后用e c l 显色，压片。 3 酶解分离大鼠网膜神经元 我们采用木瓜蛋白酶酶解和机械分离相结合的方法制备分离的视网膜神经 元，这种方法改进自t a e h i b a n a 的工作【3 9 】，同时也借鉴了本实验室和其他实验 室的经验【3 】。 实验前，动物暗适应至少2 0r a i n ，在暗红光及室温( 2 3o c ) 条件下毁髓后，用 弯头眼科剪环切眼肌，迅速摘出两侧眼球，剪净眼球外壁的肌肉并置于正常的牛 蛙r i n g e r s 中。在普通滤纸上将眼球上半部分切除，将眼杯剪成边长2 3n l l n 的小片。之后，用镊子夹住视网膜一角揭下视网膜，并迅速放入用r i n g e r s 配制 的酶消化液中，并在恒温箱( 3 0o c ) 内消化3 0r a i n ，期间每隔1 0r a i n 轻轻振荡组 1 5 材料和方法 织块，以便均匀消化。消化液配方为；5 m lr i n g e r s 中加入2 5m g 木瓜蛋白酶 ( p a p a i n ，活性为3 0 ，0 0 0 u s pu m g ，购白美国的c a l b i o c h e m - n o v a b i o c h e m 公司) 、 5m gl - 半胱氨酸，新鲜配制，并在加入视网膜组织块之前预置于3 0o c 恒温箱中。 组织块消化好后，用纯净的r i n g e r s 进行充分清洗( 耗约1 0 0m lr i n g e r s ) ，以便 终止木瓜蛋白酶的作用。洗净的组织块置于r i n g e r s 中，4o c 冰箱保存长达8 1 1 r 。 实验时取出1 至2 个组织块放入盛有约1 0m lr i n g e r s 的玻璃离心管中，用数根 管口已在火上烧熔变得圆滑、内径自3i n n l 到0 5i y l r n 依次递减的滴管轻轻吹打， 直至离心管内液体稍显混浊、组织块基本消失为止。机械分离时，特别注意轻柔 吹打，掌握好力度，以免细胞突起成分过度丢失。吹打好后静置3 5m i n ，轻取 上悬浮液接种于塑料培养皿中( 注意不带入组织碎片，以防组织块在快速施药时 吹掉细胞，或在皿中附着于细胞) ，放置在相差显微镜的载物台上，再静置1 0 1 5m i n 后进行实验。 4 全细胞膜片钳记录 4 1 旌药系统 本工作采用的快速施药系统( r a p i ds o l u t i o nc h a n g e r ，r s c 1 0 0 ，购白法国 的b i o l o g i cs c i e n c ei n s t r u m e n t s 公司) 是由一个精确平稳转动、可程控的步进电机 与1 4 根平行排列的毛细玻璃管( 直径1m m ) 组成。图3 显示了r s c 1 0 0 施药系统 的装置图和施药原理。毛细玻璃管排列在圆柱形的转头上，相邻毛细管间隔约 7 2 0 ，分别充以r i n g e r s 或含有药物的溶液。管间切换速度最快可设为5h i s ，最 慢8 0 0m s 。在我们的实验条件下，溶液的切换速度最快可达3m s 。毛细玻璃管 后通过塑料软管接到由注射器制成的储液瓶中，并排架在高出实验槽约3 0c n l 的 储液架上。细胞距管口约1 5 0 2 0 0g m ，当管内溶液外流时可使细胞完全浸浴于 其中。在毛细玻璃管开口处，溶液运动的速度可达1 0 0i m p m s 。为了得到平稳的 实验记录，实验时相邻玻璃管的换位时间设为1 0m s 。 实验时，将形成全细胞膜片钳记录模式的电极连同细胞从培养皿底部提起， 然后轻轻打开注射器上的三通开关，使溶液缓缓流下：当三通开关开到最大时， 1 6 材料和方法 整个细胞就被毛细玻璃管出口溶液完全浸浴。同时，打开相邻的药液注射器上的 三通开关。由电脑通过膜片钳放大器给出的模拟信号触发马达的转动，从而精确 控制快速施药的时程。 4 2 膜片钳实验装置 膜片钳记录电极由电极毛坯( 购自美国的s u t t e r 公司，货号b f l 5 0 8 6 1 0 ，外 径1 5h i m ，内径0 8 6 衄，长度1 0e r a ) 在电极拉制仪( 购自美国的s u t t e r 公司， 货号p - 9 7 ) 上经多步拉制( 5 9 步) 而成。电极尖端的v i 径为1 2i t r n ，冲灌记录 氯电流的电极内液时阻抗为5 7m q 。 我们采用e p c 9 2 及配套软件p u l s e8 5 2o t e k a ，g e r m a n y ) 来实施膜片钳记录。 图4 显示了实验装置和数据流程示意图。在电极入溶液前，先通过加压系统给电 极内部约1 0i n m 水柱的正压以保证在溶液中的电极尖端不粘附异物。电极入溶 液后，施加测试脉冲检验电极阻抗是否合适，打开声音监控电极阻抗变化，并迅 速接近细胞。然后将放大器设置到o n - c e l l 模式，按事先通过p c l a m p e x8 0 ( 购自 美国的a x o n 公司) 计算所得的数值自动补偿液接电位。然后将电极尖端贴近细胞 的外三分之一处，一般选择细胞膜平整而无异物附着的部分。通过声音监听到电 极阻抗的变化后，撤掉电极内的正压，同时用玻璃注射器( 1 0 h a ) 轻轻施加短促的 负压。这时就会形成g q 高阻封接，此时通过加压系统给电极内部一个约6 0f r i l l 水柱负压。然后进行快电容补偿( 主要是补偿电极电容) ，施加瞬时强脉冲( 8 0 0 m v ，1 0 0 旧打破电极尖端的膜片，将放大器设置到w h o l e - c e l l 模式，进行慢电 容补偿( 主要是补偿细胞膜电容) 。慢电容补偿后的串联阻抗一般为1 0 2 0m q ； 当大于2 0m q 时，细胞则弃之不用。最后将串联电容补偿至6 0 。对于电压钳 记录，将电极连同细胞提起靠近旋药管口进行实验。 1 7 材料和方法 bc 图3 r s c 一1 0 0 施药系统。a ，r s c - - 1 0 0 各组成部分示意图。b ，施 药转头的实物图。c 。施药过程示意图，记录电极及细胞的位置不变， 通过施药转头的转动带动毛细玻璃管换位来改变细胞浸浴的溶液，以 施加1 m m g l y 为例。 放大器记录到的电流或电压模拟信号经两次滤波( 1 0k h z ，b e s s e l ：2k h z ， b e s s e l ) 后转换成数字信号( 1 0k i - i z ) 存储在计算机硬盘上待实验后分析。计算机内 材料和方法 的数字信号( 刺激参数或波形) 可转换成模拟信号，并通过放大器旌加到记录电极 上给细胞相应的刺激，或施加到r s c 1 0 0 上从而精确控制加药时程。 4 3 溶液和药品 分离细胞和组织保存时采用的r i n g e r s 溶液配方为( 单位为m h d ：1 2 0n a c i ， 2k c i ，1m g c h ，2c a c l 2 , 1 0h e p e sa n d1 0g l u c o s e ，加入酚红( o 0 0 1 v v ) 作为指 示剂，用n a o h 将p 8 调至7 4 ，渗透压约为2 5 0m o s m 。配制好的溶液用5 0 0m l 的 生理盐水瓶分装并冷冻( - 2 0o c ) 保存，实验前用微波炉小火解冻供使用。在胞外 氯浓度改变的实验中，n a g l c 被用来替换n a c i 。 图4 实验装置和数据流程示意图。记录电极记录到的模拟信号经 e p c 9 放大后转换成数字信号存储在计算机上。而计算机给出数值信 号经e p c 9 转变成模拟信号后或者输入到r s c 一1 0 0 上控制给药时程， 或者施加到记录电极上给细胞适当的刺激。 进行全细胞电流钳记录的电极内液配方为( 单位为m h q ：1 2 8c s c i ，2m g c h ， 1 9 材料和方法 lc a c l 2 1 0e g t a ，用c s o h 将溶液的p h 调至7 2 ，渗透压约为2 6 0m o s m 。在 室温( 2 39 回下，该溶液相对于r i n g e r s 溶液的液接电位用p c l a m p e x8 1 计算约为 3 9 m v 。用这种溶液对应于r i n g e r s 溶液记录氯电流时，c i 的平衡电位经n e r n s t 方程( 室温2 5o c 下) 计算为1 2m v ，当细胞钳位在- 6 0m v 时所记录到的氯电流表 现为内向电流( 电压驱动力为- 6 1 2 m v ) 。电极内液用0 2 i x m 微孔滤膜过滤，分装 到o 51 1 1 l 的塑料管内冷冻( - 2 0o c ) 保存，每次实验前取出放置在室温下解冻后使 用。为了防止记录记录电流的 r u n d o w n 现象，在每次融解o 5m l 的电极内液后， 现加入“a r p 和g t p 混合液”( a t pr e g e n e r a t i n gc o c k t a i l ”) ，包括5m m a t p ，0 5 m mg t p ，2 0m mp h o s p h o e r e a t i n e 和5 0u n i t s m le r e a t i n ep h o s p h o k i n a s e 。加入这 a t p 和g t p 循环物质可以很好抑制r u n d o w n 现象的发生。 使用的工具药物如无特别注明均购于s i g m a 公司。d c k a 先溶解于d m s o 中以母液( 1 0 0m m ) 的形式保存，实验前稀释到r i n g e r s 中。d m s o 在溶液的 终浓度均低于o 1 ，这个浓度的d m s o 不会影响细胞的活性和所记录电流的大 小。其他药品均在实验前溶解于r i n g e r s 中。 4 4 数据处理 数据处理主要是在p u l s e f i t ( h e k a 公司，德国) 、p c l a m p f i t ( a x o n 公司，美国) 和i g o r4 0 ( w a v e r a e t r i c s 公司，美国) 上完成。在p u l s e f i t 上选取有代表性的实验 记录，逐个存储成i g o rt e x t 文件，导入到i g o r 内进行分析和作图。对于要进行 数字滤波或f o u r i e r 转换的记录，则从p u l s e f i t 里存储成a s c i i 文件，再导入到 p c l a m p f i t8 0 内进行分析。所有统计数据都表示成为平均值士标准误( m e a n - t - s t a n d a r de r r o r ) 。 通过n e m s t 方程可以计算出所录单一通道的理论翻转电位，其公式为： e a ；限t z 。f ) i n ( 【a 】o ，【a 】i ) 一【e l 】 其中r 是气体常数( 8 3 1 4v c k m 0 1 ) ，t 是绝对温度( 2 7 3 + o c ) ，z 是所 材料和方法 测电流的带电荷数，f 是法拉第常数( 9 6 4 8 1 0 4c m 0 1 ) ，【a 】i 和【a 】。分别是所测 离子的胞内外离子浓度。 g l y c i n e 的剂量一效应曲线由以下方程拟合得到： i l m “= 1 1 + ( e c s o a ) 郾】 其中，i 是不同g l y 浓度时的反应最大值，i 姒是在饱和浓度( 通常是1r a m ) 下得到反应最大值，e c 是反应到达最大值的一半时所需g l y 浓度，【a 】是所施 加的g l y 的浓度，行是h i l l 常数。e c 5 0 常用来衡量激动剂的亲和力，而疗常用 来估算受体上激动剂结合位点的数量。 2 1 实验结果 ( 三) 、实验结果 1 牛蛙视网膜视锥细胞的鉴定 在牛蛙视网膜薄片标本上( 图5 ) ，视锥细胞的胞体处于视网膜的o n l ，与 视杆细胞相比，其胞体所处层次稍显凌乱，并更靠近o p l 。视杆细胞外段为典 型的杆状，而视锥细胞的外段为较小的锥形部分，其内段和胞体之间有一狭长的 连接轴相连：视锥细胞的轴突长短不一，在中央凹附近的视锥细胞轴突很短，而 在远离中央凹区域的细胞则较长。牛蛙视网膜中的单视锥细胞( 图8 a 和b ) 上， 内段和外段之间有一个明亮的油滴( o i l - d r o p l e t ) ；双视锥细胞包括两个部分：主 要成员( p r i n c i p a lm e m b e r ) 和附属成员( a c c e s s o r ym e m b e r ) ，前者也有同样的油 滴，后者则阙如( 图8 c 和d ) 。 图5 牛蛙视网膜薄片标本的 d i c 图片( 6 3 0 x ) 。图中星号 标记的细胞为光感受器视锥 细胞。o s ，o u t e rs e g m e n t , 外 段；i s ，i n n e r s e g m e n t , 内段； o n l ，o u t e rn u c l e a rl a y e r , 外核层；o p l ，o u t e r p l e x i f o r ml a y e r ，外网层； i n l ，i n n e rn u c l e a rl a y e r , 内核层；i p l ，i n n e r p l e x i f o r m l a y e r 。1 p l ；图中标尺为1 0 t t m o 实验结果 2 g l y ro1 和p 亚基在牛蛙视网膜上的分布 2 1g 1 y rq1 和b 在牛蛙视网膜上抗体特异性分析 在标记g i y ra l 和b 之前，我们首先运用w e s t e r nb l o t 技术检测两种购买的 抗体在牛蛙视网膜上的抗体特异性。图6 显示了w e s t e mb l o t 的实验结果，实验 表明，g i y r a l 抗体在1 0 0 k d a ( 图6 a ) 附近有一单条带，这接近于大鼠脊髓g l y r n l 蛋白分子量( 4 8 k d a ) 的两倍 1 8 】。图6 b 显示g i y r b 的抗体在1 1 2k d a 附近 有一单条带，是大鼠g l y rb 蛋白分子量 ( 5 6k d a ) 的两倍【1 8 】。这些结果提示， g l y r a l 和b 亚基在牛蛙视网膜内可能以 二聚体形式存在。当用相应的免疫抗原 分别预吸附g l y ra l ( 图6 a ) 和p ( 图 6 b ) 抗体后，则无条带出现。由此推论， 实验中使用的两种多克隆抗体能特异地 图6 抗g l y r a l ( a ) 和抗g l y rp 识别牛蛙视网膜上的甘氨酸受体 多克隆抗体w e s t e r nb l o t 的实 验。a ，和b 分别为预吸附实验。 2 2g l y ro1 和1 3 在牛蛙视网膜垂直切片上的分布 为了研究g l y r l 和p 在牛蛙视网膜上的表达以及在视锥细胞上的亚细胞分 布，我们应用了抗g l y r a l ，b 抗体和光感受器特异性标记物抗r e c o v e r i n 抗体， 在视网膜垂直切片上进行免疫荧光双标。图7 显示在牛蛙视网膜垂直切片上的激 光共聚焦显微镜照片。如图7 a l 红色部分所示，与实验室以前的工作类似【1 9 】， 实验结果 g l y ra l 在整个i p l 和o p l 均有表达。此外，i n l 的细胞胞膜上也有表达。 圈7 g l y ra l 与o l y rb 在视网膜垂直切片上的分布。a 1 - a 3 ，b l - b 3 g i y r a 1 与g 1 y rb 的抗体与光感受器特异性标记物r e c o v e r i n 免疫双标的激光 共聚焦显微镜照片。其中