（生理学专业论文）雌激素对nrf2活化及ho1cuznsod表达的影响.pdf

独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作 所取得的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中作了明确的说明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 辱幺堑篷 日期：矽矽、6 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权东：l k n 范大学可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段 保存、汇编本学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：二巡 日期：纠口6 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名： 日期： 电话： 邮编： 厂 氧自 n r f 2 a r e 的多效应 硫氧还蛋 胞内的氧 护方面具有重要的生理学意义，但其作用机制各不相同，也不十分明确，尤其对于作用 通路方面的理论仍值得研究。本实验利用原代培养的心肌细胞，通过建立缺氧复氧 ( h r ) 模型来模拟心肌缺血再灌注损伤，外源加以一定剂量雌激素( 5hm ) 来研究在 缺氧复氧的过程中其抗氧化作用是否与n r f 2 a r e 抗氧化系统有关联。实验发现，与对 照组比较，缺氧复氧损伤组心肌细胞的存活率下降，c a s p a s e 一3 水平、凋亡中晚期细胞 数量和r o s 产生量显著升高，细胞处于氧化损伤状态。在缺氧复氧过程中加入雌激素 后，可以改善细胞受损伤程度，r o s 产生量明显降低。而细胞内核转录因子n r f 2 的入核 量，血红素加氧酶和超氧化物歧化酶的m r n a 和蛋白表达量均较损伤组的高。在加入雌 激素受体抑制剂后，e 。的这种作用被抑制。结论：在缺氧复氧过程中，雌激素能够促 进核转录因子n r f 2 入核，使其下游两种保护酶h o - l 和c u z n s o d 的表达量增加，胞内 r o s 量降低，细胞凋亡率下降，活性增加，从而保护心肌细胞免受氧自由基的攻击，降 低缺氧复氧过程造成的损伤。 关键词：雌激素；n r f 2 ：h o - 1 ；缺氧复氧；c u z n s o d a b s t r a c t o x y g e nf r e er a d i c a l s ( r o s ) c a u s eo fm y o c a r d i a li s c h e m i a - r e p e r f u s i o ni n j u r y - i n d u c e d a p o p t o s i si so n eo ft h ei m p o r t a n tm a t e r i a l ，b u tn r f 2 | a r ea n t i o x i d a n ts y s t e mi nt h ep r o c e s s o fs c a v e n g i n go x y g e nf r e er a d i c a l sp l a ya l li m p o r t a n tr o l e t h ea c t i v a t e dn r f 2c a l lt r a n s p o r t i n t ot h en u c l e u s ，a n db i n dw i t ht h ee f f e c to ft h ed o w n s t r e a mt a r g e tg e n e so fam u l t i a r eb ，i t s t r a n s c r i p t si n c l u ds u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) ，h e m eo x y g e n a s e ( h o 1 ) ，t h i o r e d o x i n ( t h i o r e d o x i n ) a n dp h a s ei id e t o x i f i e a t i o ne n z y m e s ，s u c ha sg l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ( g s t ) ： t h e s ee n z y m e sc a ne f f e c t i v e l yr e m o v eo x y g e nf r e er a d i c a l sw i t h i nc e l l st om a i n t a i n i n t r a c e l l u l a rs t e a d y - s t a t es i t u a t i o n e s t r o g e nh a s aw i d er a n g eo fa n t i - o x i d a n tr o l ei n c a r d i o v a s c u l a rp r o t e c t i o na n da i li m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e ，w h i l ei t sm e c h a n i s mi s d i f f e r e n t , n o tv e r yc l e a r , e s p e c i a l l yf o rt h er o l eo fp a t h w a y si nt h et h e o r yi s s t i l lw o r t h s t u d y i n g i nt h i ss t u d y , u s i n gp r i m a r yc u l t u r eo fc a r d i a cc e l l s ，t h r o u g ht h ee s t a b l i s h m e n to f h y p o x i a | r e o x y g e n a t i o n 娥| nm o d e lt os i m u l a t em y o c a r d i a li s c h e r n i a | r e p e r f u s i o ni n j u r y m o d e l ，t oac e r t a i nd o s eo fe x o g e n o u se s t r o g e n ( 5p m ) t os t u d yw h e t h e rt h ee f f e c to fi nt h e c o u r s eo fi t sa n t i - o x i d a t i o ni nt h eh y p o x i a r e o x y g e n a t i o ni sa s s o c i a t e d 、历mn r f 2 a r e a n t i o x i d a n ts y s t e m e x p e r i m e n tf o u n dt h a tt h es u r v i v a lr a t eo fd e c l i n ei nm y o c a r d i a lc e l l s ， c a s p a s e - 3l e v e l s ，t h en u m b e ro fc e l l si nl a t ea p o p t o s i sa n dr o sg e n e r a t i o no fh y p o x i a r e o x y g e n a t i o nm o d e lg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p t h ec e l l sa r ei na s t a t eo fo x i d a t i v ed a m a g e i nt h ep r o c e s so fh y p o x i a | r e o x y g e n a t i o n 。t h ec e l l sw h i c ha d d e d e s t r o g e n , t h ed e g r e eo fi n j u r yw a si m p r o v e d r o sw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d t h ea m o u n to f t r a n s c r i p t i o nf a c t o rn r f 2i nt h en u c l e a ra n dt h ee x p r e s s i o no fm r n ao rp r o t e i no fh e m e o x y g e n a s ea n ds u p e r o x i d ed i s m u t a s ea r eh i g h e rt h a nt h o s ei nt h ei n j u r yg r o u p p r i o rt oj o i n i n g e s t r o g e ni n h i b i t o r , t h ee f f e c to fe s t r o g e ng o e sa w a y c o n c l u s i o n ：i nt h ep r o c e s so fh y p o x i a | r e o x y g e n a t i o n ，e s t r o g e n c a np r o m o t et h en u c l e a rt r a n s c r i p t i o nf a c t o rn 咆i n t ot h en u c l e u s ，s o t h a tt h ee x p r e s s i o no ft h ed o w n s t r e a mc l e a rt w ok i n d so fp r o t e c t i v ee n z y m eh o - 1a n dc u z n - s o di n c r e a s e d ，al a r g en u m b e ro fo x y g e nf r e er a d i c a l sh a v eb e e nr e m o v e d ，s ot h a tt h e r a t eo f a p o p t o s i sw e r ed e c l i n e da n dt h ea c t i v i t yw a si n c r e a s e d ，t h e r e b yp r o t e c t i n gm y o c a r d i a l c e l l sf r o mo x y g e nf r e er a d i c a l sa t t a c k s r e d u c e di n j u r yi nt h e p r o c e s so fh y p o x i a | r e o x y g e n a t i o n k e yw o r d s ：e s t r o g e n ；n f - e 2 一r e l a t e df a c t o r2 ；h e m e - o x y g e n a s e - 1 ；h y p o x i a r e o x y g e n a t i o n ； c u z n s u p e r o x i d ed i s m u t a s e， i i 目录 中文摘要i 英文摘要i i 目录i i i 1 弓l言：1 2 实验材料与方法5 2 1 实验材料5 2 1 1 实验动物5 2 1 2 实验试剂与耗材5 2 1 3 实验仪器。5 2 2 实验方法6 2 2 1 心肌细胞分离培养6 2 2 2 心肌细胞缺氧复氧损伤模型建立。6 2 2 3 实验分组。6 2 2 4 心肌细胞活性检测j 7 2 2 5 心肌细胞凋亡检测7 2 2 6 心肌细胞r o s 的检测7 2 2 7 核转录因子n r 也的检测8 2 2 8h o 1 和c u z n s o d 的检测1 0 3 结果1 2 3 1 雌激素提高心肌细胞存活率1 2 3 2 雌激素降低心肌细胞凋亡率1 2 3 3 雌激素抑制心肌细胞c a s p a s e 3 活化。13 3 4 雌激素抑制心肌细胞产生r o s 1 4 3 5 雌激素促进心肌细胞核因子n r f 2 入核1 5 3 6 雌激素促进心肌细胞h o 1 和c u z n s o dm r n a 表达量增加1 8 3 7 雌激素促进h o 1 和c u z n s o d 蛋白表达量增加1 9 3 8 核转录因子n r f 2 与h o 1 和c u z n s o d m r n a 及蛋白表达的相关性分析2 0 讨论：2 2 结论2 7 创新点2 8 参考文献一2 9 英文缩写3 5 致谢3 6 i i i 东北师范大学硕士学位论文 1 引言 心血管系统对于机体维持正常生理活动起着至关重要的作用。它能够运输养分和废 物，维持内环境的稳态，营养各个组织器官。多年来对于心血管保护的研究水平随着物 质生活水平的提高也有了较大的提高，尤其近几年心脏病死亡率的增加，使人们认识到 心脏保护的重要性。饮食结构的调整，保健品的开发，治疗药物的增多，多方面的发展 使心脏得到了有效的保护，但由于遗传因素和环境因素使得发病率呈现种族、区域等差 异。流行病学调查发现，在同等条件下，心脏病的发生率具有性别和年龄的差异，调查 显示绝经期前女性的发病率要远低于同龄的男性，但绝经期后女性的发病率与同龄男性 比并没有太大差别n 卫3 ，这说明雌激素在降低心脏病发生方面发挥着重要作用。近几十年 的研究也证实雌激素对心血管系统的许多作用确实有助于防止或延缓心脏病的发生，它 具有降低低密度脂蛋白( l d l ) 、升高高密度脂蛋白( h d l ) 的作用。临床上常对绝经期的女 性施以雌激素替代疗法n _ 1 ，来缓解绝经对女性造成的不良影响，尤其在降低心脏病发生 方面起着显著作用。b a r r e t t - c o n n o r 的研究已经证实雌激素具有心血管保护作用，可以 降低冠心病的患病率h 1 。在k o l o d g i e 等的实验中也发现1 7b 一雌二醇能够减少急性缺血 再灌注( i s c h e m i a r e p e r f u s i o n ，i r ) 后的心肌梗死面积拍3 。同样在给绝经期女性静脉 注射1 7b 一雌二醇后，低密度脂蛋白发生过氧化的程度和超氧化物产生的量都较未注射 前低，雌激素表现出了抗氧化作用旧，说明雌激素的这种抗氧化作用与其心血管保护作 用有着某种内在的联系。本文是基于e ：在心血管系统中的抗氧化保护作用，通过离体培 养心肌细胞，模拟缺血再灌注模型建立心肌缺氧复氧模型，来研究e 。在心肌细胞中抗 氧化作用的机理。 雌激素是一种具有多效应的脂溶性类固醇激素，在人体内包括雌二醇、雌三醇和雌 酮三种，其中雌二醇的生物学效应最强，是天然抗氧化剂，在女性体内主要由卵巢合成， 男性体则是由脂肪、毛囊等组织合成。雌激素在女性的生殖发育、第二性征维持以及其 他的生理过程中发挥着重要的作用。在对雌激素的大量研究中，发现雌激素作用的靶器 官很多，除了生长发育方面的生理作用外，其他方面的生理学效应逐渐显现，使人们越 来越重视对它的研究，尤其是在分子水平上的信号调控机制。 s t u m p f 在心脏中发现了雌激素受体，证实了雌激素受体的存在盯1 后，对雌激素在心 脑血管中作用的研究也逐渐增多。k r i e g 和m c g i l l 等人相继证实了雄激素受体的存在并 同时提出了心脏是性激素作用靶器官的假说阳9 3 。更多的研究又发现雌激素受体不仅存在 于心肌细胞还存在于冠状动脉的内皮细胞中，这就说明在整个心血管系统中均存在雌激 素受体。而g r o h e 等人又证实大鼠心肌细胞的雌激素受体是有功能的，能在雌激素的刺 激下表达量增加n 训，具有生理学效应。而雌激素的生理学效应与雌激素受体分不开，这 一雌激素一受体调控机制是最经典也是最早被发现的：雌激素通过与雌激素受体结合形 成激素一受体复合体，进入胞核后与雌激素效应元件( e s t r o g e nr e a c t i v ee l e m e n t ，e r e ) 1 东北师范大学硕士学位论文 结合，调控靶基因的转录，这一作用模式被称为基因组作用模式1 。这一模式是在转录 水平调控基因表达，作用缓慢，数小时或数天不等n 射。在发现雌激素膜结合位点后，雌 激素这种新的作用模式很快得到了普遍证实：雌激素与细胞膜上的受体结合后，复合体 并不入核，就可以通过激活一系列信号通路，控制核内靶基因表达，这一过程被称作非 基因组作用模式。这一模式是一个级联放大过程，激活一些非转录信号，作用迅速，仅 在几分钟内就可产生效应n 3 1 钔。无论什么作用模式，雌激素所发挥的生理学效应都与雌激 素受体分不开，大多数生理学效应都是由雌激素受体介导n 副。但也有研究发现，雌激素 在体内经代谢后的产物并非所有都是与雌激素受体作用后发挥生理学效应，也就是说雌 激素可以通过多条途径发挥生理学效应n 6 l 。 局部缺血是心血管疾病发生的一个诱因，缺血过程导致器官缺氧，功能障碍，严重 时细胞发生凋亡并最终坏死n 7 1 。但在这一过程施予抗氧化剂，大量r o s 被清除，无论在 体还是离体器官或细胞都得到有效保护n 射。这说明r o s 是导致器官损伤的主要因子n 7 1 钔， 找到有效清除r o s 的方法可能对临床治疗以及理论研究有巨大的帮助。 活性氧簇( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 是由氧衍生出来的自由基及其产物，主 要包括0 2 一、o h 、h ：o ：、h o c l 、0 3 和单线态氧等。r o s 可以启动一个链式反应，与细胞 膜上的不饱和脂肪酸及胆固醇反应，使细胞受到氧化损伤，最后发生细胞凋亡，是氧化 损伤过程的起始因素。 在稳态环境中，r o s 主要是由线粒体、过氧化物酶体和细胞色素p 4 5 0 系统产生啪1j 而线粒体是产生r o s 的主要场所乜，电子传递或催化氧化过程会产生r o s 陇1 。r o s 被认 为是细胞呼吸产能过程中的有害副产物，对生物系统有毒害作用1 ，会引发多种疾病瞳引。 但r o s 并不是一无是处，许多研究都发现，在稳态环境中，r o s 在一些生物应答过程中 起着重要的信号调节作用乜5 ，绷，主要对那些依赖于氧化还原的转录子活化乜7 驯、离子转 运嘲1 、蛋白磷酸化等瑚1 过程均有调节作用。 细胞受到外界刺激后，r o s 产生增多而机体清除r o s 能力相对下降，这时机体就会处 于氧化应激( o x i d a t i v es t r e s s ) 状态。细胞处于氧化应激状态时，r o s 量相对升高，超过 其清除能力，导致脂质过氧化水平升高，引起d n a 氧化损伤，线粒体功能失调口门和蛋白质 表达异常。如果机体长期处于剧烈的氧化应激状态则引起心脏病，高血压，动脉硬化， 恶性肿瘤和一些退行性疾病，对机体造成巨大损害口船。但生物体产生的抗氧化剂能够直 接或间接的清除细胞内的r o s ，减少疾病的发生，降低氧化应激造成的损伤。在这其中， 抗氧化酶、i i 相解毒酶家族的抗氧化效率比较高，能够有效的提高细胞清除r o s 的能力， 在维持细胞氧化一还原稳态和降低细胞所受的氧化损伤中起着关键作用扫3 捌3 。这些抗氧化 酶、i i 相解毒酶的基因都是通过5 端启动子内被称为抗氧化应激顺式作用元件 ( a n t i o x i d a n tr e s p o n s i v ee l e m e n t s ，a r e ) 调控的1 ，而启动这一过程的核转录因子是 n r f 2 。因此核转录因子n r f 2 在机体抗氧化损伤中起着重要的转录调控作用b 5 砥3 7 1 。 n r f 2 ( n f e 2 一r e l a t e df a c t o r2 弱，3o rc h i c k e ne r y t h r o i d - d e r i v e dc n c h o m o l o g y f a c t o r 啪1 ) 是一个氧化还原敏感转录因子，能调控氧化应激元件a r e 上的抗氧化酶和l i 相解毒酶的表达啪j “4 2 1 ，属于c n c ( c a p n c o l l a r ) 转录因子亚家族h 驯。无论是哺乳动 2 东北师范大学硕士学位论文 物还是家禽或是斑马鱼，n r f 2 的结构序列都高度保守，具有结构序列相似的n e h ( n r f 2 一 e c hh o m o l o g y ) 1 到n e h 6 六个结构域h 引。n e h l 结构域包含c n c - 碱性亮氨酸拉链( b z i p ) 结构域，与n r f 2 形成二聚体有关，并且在识别并专一结合d n a 序列过程中起着重要作 用。n e h 4 和n e h 5 两结构域相互作用与c r e b 结合蛋白c b p ( c y c li ca m p r e s p o n s ee l e m e m b b i n d i n gp r o t e i n ) 结合来激活转录h 朝。在稳态环境中，与以上三个结构域的作用不同 的是n e h 2 结构域，它起着一个负向调节作用，n r f 2 抑制蛋白k e a p l 能够与这一结构 域内特异序列结合从而抑制n r f 2 的活性h 7 1 。 静息状态下，n r f 2 与胞浆中细胞骨架结合蛋白k e a p l ( k e l c h l i k ee c h a s s o c i a t e d p r o t e i n1 ，i n r f 2 ，k l h l l 9 ) 结合，处于失活状态。但n r f 2 的失活并不仅是由于与 k e a p l 的结合，而是由于k e a p l 被e 3 泛素连接酶复合体( 由c u l l i n 一3 和r i n g b o x l 构成) 识别，两者结合后使k e a p l 发生遍在泛素化，被2 6 s 蛋白酶体降解1 ，这样当n r f 2 与k e a p l 结合后就会不断被降解，n r f 2 在胞浆中处于一个动态平衡状态。 早在1 9 9 9 年，i t o h 等人就提出，k e a p l 通过控制n r f 2 在细胞内的分布来调节n r f 2 的功能啪1 。基于这种理论，在稳态环境中由于k e a p l 与n r f 2 的结合使a r e 相关基因表 达量极低，在氧化应激状态下，由于两者的解离使得n r f 2 入核，a r e 相关基因表达量增 加。m c m a h o n 等人又提出k e a p l 不仅调控n r f 2 的亚细胞定位还通过控制胞内n r f 2 蛋白 总量来影响a r e 基因的表达量，n r f 2 的降解即包括依赖k e a p l 的快速降解途径又包括不 依赖k e a p l 的慢降解途径m 3 。所以k e a p l 在n r f 2 的调控中起着重要作用，它是抑制n r f 2 发挥作用的关键因子。 k e a p l 是一种富含半胱氨酸的胞浆蛋白 4 9 9 受到外界刺激时，胞内r o s 能够调节k e a p l 上特有的半胱氨酸残基，使n r f 2 与k e a p l 解离，这样n r f 2 不会很快被蛋白酶体降解。n r f 2 的活化是启动抗氧化系统中抗氧化酶和i i 相解毒酶表达的第一步咖1 。n r f 2 活化后快速进 入胞核，与d 、m a f 蛋白( s m a f ) 结合成二聚体脚一，在c b p 的共同作用下与a r e 启动子区的 核酸序列( 5 一g t g a c n n n g c n 一3 ) 结合晦，启动多种抗氧化酶和i i 相解毒酶表达，包 括n a d ( p ) h ：醌氧化还原酶( n a d ( p ) h - q u i n o n eo x i d o r e d u c t a s e ，n 0 0 1 ) 嗽。，血红素加 氧酶( h e m e o x y g e n a s e ，h o ) 嘞朋3 ，超氧化物歧化酶( s u p e r o x id ed is m u t a s e ，s o d ) 汹3 ，硫 氧还蛋白( t h i o r e d o x i n ) 嘞3 ，谷胱甘肽s 转移酶( g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e ，g s t ) 崎引， y 一谷氨酰半胱氨酸合成酶( y g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ，y g c s ) 嘞靼1 等。这 些酶能够有效的清除细胞内的r o s ，使细胞内环境恢复到稳态环境。 在n r f 2 a r e 众多转录产物中，s o d 能够有效的清除细胞内的r o s ，它是机体内广泛 存在的金属抗氧化酶，主要有三个亚型：含铜锌的超氧化物歧化酶( c u z n s o d ) ，含锰 的超氧化物歧化酶( m n - s o d ) ，胞外超氧化物歧化酶( e c s o d ) 删。其中c u z n s o d 的 含量较多，占s o d 总量的8 0 ，活性较强障，广泛的存在于各种细胞中，是一个较好的 抗氧化剂。在一些研究中发现它还与卵巢和听觉功能有着密切联系眦1 。 而对于心血管的保护并不全在于清除细胞内的氧自由基，对器官整体调节也十分重 要。h 旷1 在这一过程中起着关键作用。h o 一1 是一种微粒体酶，是血红素加氧酶的一 个亚型，能够催化血红素产生铁离子、胆绿素和一氧化碳。胆绿素在胆绿素还原酶的催 3 东北师范大学硕士学位论文 化下转变成胆红素，能够清除脂质过氧化物4 l 。c o 具有n 0 样作用嗡1 ，具有抗凋亡和抗 炎的双重特性呻1 ，当血管内皮产生n o 受限时阳 ，它能使冠脉平滑肌舒张，起到扩张血 管的作用，还可抑制血小板聚集和血管平滑肌增生。另外在氧化应激条件下，h o - 1 能够 通过增加胞内铁离子的输出量来调节铁离子的水平以保证细胞活性侧。因此，h 沪1 对心 血管的保护作用不容忽视。 n r f 2 a r e 的转录产物很多，其作用也具有多样性，但都对心血管系统起着保护作用， 因此，如何能够有效的活化核转录因子n r f 2 是实现细胞保护的关键。e ：具有抗氧化作用， 而n r f 2 a r e 系统能够产生高效的抗氧化酶，当细胞处于氧化应激状态时，e ：所发挥的抗 氧化作用是否是通过调节n r f 2 a r e 系统实现的，既在e ：存在的条件下，能否增强n r f 2 a r e 系统的抗氧化和心肌保护作用，影响核转录因子n r f 2 ，这是本文要讨论的中心问题。 4 东北师范大学硕士学位论文 实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验动物 1 - 3 天s p r a g u e - d a w l e y ( s d ) 大鼠，雌雄随机吉林大学实验动物中心提供 2 1 2 实验试剂与耗材 雌激素、i c l l 8 2 ，7 8 0 、5 一溴脱氧尿苷( b r d u ) d m e m 高糖培养基、胰蛋白酶 新生牛血清 c a s p a s e - 3 凋亡检测试剂盒、 a n n e x i nv - f i t c 凋亡检测试剂盒 兔抗大鼠n r f 2 一抗 二抗羊抗兔i g g 、 兔抗大鼠t u b l i no 、h 3 、s o d a 、h 沪1 p v d f 膜 噻唑兰、甘氨酸等生化试剂 化学发光试剂盒( e c l k i t ) r t - p c r 试剂盒 d h e 染料 其余生化常规药品 培养板 2 1 3 实验仪器 流式细胞仪 低温高速离心机 酶标仪，电泳凝胶成像系统 p c r 仪 二氧化碳培养箱 超净工作台 恒温摇床 激光共聚焦显微镜 电泳仪、垂直电泳槽、水平电泳槽 s i g m a 公司 g i b c o 公司 天津t b d 公司 南京凯基生物公司 s a n t ac r u z 公司 博奥森生物技术公司 m i l l p o r e 公司 北京鼎国公司 博士德生物公司 t a k a r a 公司 碧云天生物研究所 北京化工厂 c o s t a r 公司 b e c k m a n 公司 s i g m a 公司 b i o - r a d 公司 a p p li e db i o s y s t e m s 公司 日本三洋公司 北京东联哈尔仪器制造公司 江苏金坛市京达仪器制造厂 o l m p u s 公司 北京君意公司 东北师范大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 心肌细胞分离培养 取卜3 天龄s d 大鼠的乳鼠1 0 只，用乙醇对其表面皮肤消毒；在超净工作台中将心 脏快速取出，放在预冷的d - h a n k s 中，修剪掉多余的心房和血管，洗去血污；将修剪好 的心脏剪成lm m 3 大小的碎块，加入5m lo 2 5 的胰酶移至消化瓶中，3 7 于摇床中 7 5r p m 消化1 0m i n ，弃去第一次的消化液，再加5m 1 胰酶消化5m i n ，将消化液移至含 血清的培养基中，终止胰酶的消化作用。接下来重复以上过程，依次加入5m l ，4m 1 递减至3m l 胰酶，分别消化5m i n 两次，4m i n 两次，3m i n 多次消化，直至组织块开始 变白松散，停止消化。将装有消化液的培养基吹打均匀，1 2 0 0r p m ，离心6m i n 两次，弃 去上清，再加入培养基重悬细胞，尽量吹打均匀，加到培养瓶中，差速lh ；进行细胞 计数，根据各个实验对细胞密度的不同要求，进行稀释接种，并加入b r d u 抑制成纤维 细胞的生长。置于3 7 ，5 c 0 2 条件的培养箱中培养，2 4h 后观察，换含有血清的 培养基，大约7 2h 后，换无血清培养基培养1 6h 以上后培养的心肌细胞就可以进行下 步实验。 2 2 2 心肌细胞缺氧复氧损伤模型建立 参考k o y a m a 等人油1 的方法按照表1 的成分配制缺氧液、复氧液。实验前，3 7 条 件下在缺氧液中充入高纯度氮气( 9 5 n 2 + 5 c 0 2 ) 至饱和，将处理好的细胞加入预先 氯液，放入恒温( 3 7 ) 缺氧装置中，缺氧两个小时取出，换上预先充纯 民液，放入普通培养箱中再培养两个小时复氧。缺氧复氧模型建立完成。 表1 缺氧液、复氧液成分 缺氧液成分( p h 6 8 )复氧液成分( d h 7 4 ) n a h 2 p 0 40 9m i ln a h ：p o 0 9i 玎m n a h c 0 ：l6 0 删n a h c 0 32 0m m c a c l 21 0m mc a c l 21 0 删 m g s 0 4 1 2m m m g s 0 4 1 2m m 乳酸钠 4 0 删 葡萄糖 5 5 栅 h e p e s2 0m mh e p e s2 0m m n a c l9 8 5m mn a c l1 2 9 5 脚m k c i1 0 0 mk c l5 0m m 乓验分组 子成5 组，分别是对照组( c o n ) ；缺氧复氧组( h r ) ；缺氧复氧加e 。处理 ；缺氧复氧加e ：和雌激素抑制剂处理组( h r + e ：+ i c i ) ；对照加e 。处理组 ：的终浓度为5pm ，预孵1 6h ；i c i 的终浓度为5 | im ，在加e ：前两小时 奠型组均采用缺氧2h ，复氧2h 。 6 东北师范大学硕士学位论文 2 2 4 心肌细胞活性检测 以2 x1 0 5 m l 的密度将分离的心肌细胞接种到9 6 孔细胞培养板中，用含2 0 胎牛 血清的培养基培养7 2h ，更换无血清培养基后继续培养1 6h ，建立模型，在各孔的培 养基中加入2 0ulm t t 溶液，再培养4h ，弃去培养上清液，每孔加1 5 0 1 1l 二甲基亚 砜( d m s o ) ，室温振荡1 5m i n ，用酶标仪在4 9 0n m 处检测读取吸光值。实验结果用心肌 细胞存活率来表示，细胞存活率= ( 试验组光吸收值一空白对照孔) ( 对照组光吸收值 一空白对照孔) 1 0 0 。 2 2 5 心肌细胞凋亡检测 2 2 5 1a n n e x i nv - f i t c 流式细胞仪法检测心肌细胞凋亡 ( 1 ) 3 1 0 5 m l 密度接种的心肌细胞处理建模后，用0 2 5 胰酶消化收集，用p b s 清洗细胞两次，离心( 2 0 0 0r p m ， 5m i n ) 收集1 5 1 0 5 个细胞 ( 2 ) 加1 0 0l j1b i n d i n gb u f f e r 悬浮细胞，适宜力度吹打均匀 ( 3 ) 加5 0i i1a n n e x i n v - f i t c 混匀后再加入5 0l l1p i ，吹打混匀，室温避光， 反应1 5m i n ( 4 ) 在lh 内利用流式细胞仪进行观察和检测 2 2 5 2c a s p a s e - 3 分光光度法检测心肌细胞凋亡 1 细胞裂解 ( 1 ) 以3 1 0 5 m l 密度接种心肌细胞于培养瓶中，处理后建立缺氧复氧模型 ( 2 ) 用预冷p b s 清洗细胞，0 2 5 胰酶将细胞从培养瓶上消化下来，含血清培养基 中和后2 0 0 0r p m 离心5m i n ，收集细胞，尽量除去p b s ( 3 ) 在收集的沉淀细胞中加入5 0u1 预冷l y s i sb u f f e r ( 使用前每5 0p1l y s i s b u f f e r 加入0 5p1d t t ) ，吹打均匀 ( 4 ) 置冰上裂解3 0m i n ，其间涡旋振荡3 次，每次l o s ( 5 ) 4 ，1 0 0 0 0r p m 离心1m i n ( 6 ) 小心吸取上清转移至新管中，置于冰上待用。吸取1l ll 上清，用b r a f o r d 法 测定其中的蛋白浓度，其余备用 2 c a s p a s e 一3 检测 ( 1 ) 在5 0i i1 的上清中加入5 0l l1 的2 r e a c t i o nb u f f e r ( 使用前每2 r e a c t i o n b u f f e r 加入0 5u1d t t ) 混匀 ( 2 ) 每个样加入5i l1c a s p a s e - 3s u b s t r a t e ，3 7 避光孵育4h ( 3 ) 用酶标仪在4 0 5r i m 处测其吸光值。通过计算o d 模型组o d 阴性对熙的倍数来确定各组 c a s p a s e - 3 的活化程度。 2 2 6 心肌细胞r o s 的检测 3x1 0 5 m l 密度接种心肌细胞，处理建模后用o 2 5 胰酶消化收集于含血清培养基 7 东北师范大学硕士学位论文 的离心管中，1 5 0 0r p m 离心，5m i n 。预冷的p b s 清洗两次，尽量除去残留的p b s 。加 入0 1 | lm 的d h e 染料5 0 0i jl ，吹打均匀，室温避光孵育3 0m i n ，过滤收集，利用流 式细胞仪进行检测。实验结果以荧光强度来表示。 2 2 7 核转录因子n r f 2 的检测 2 2 7 1w e s t e r nb l o t 法检测 1 核蛋白提取 3 1 0 5 m l 密度接种心肌细胞于培养瓶中，处理建模后，用预冷p b s 冲洗一次。每 瓶加2m l 的0 2 5 胰酶消化，在倒置显微镜下观察，当大部分细胞变形后开始吹打， 将消化液移至含血清的培养基中，并观察瓶中剩余细胞的量，尽量消化干净。细胞悬液 1 5 0 0r p m 离心5m i n ，弃上清，加1m lp b s 重悬移至1 5m l 离心管中，1 5 0 0r p m 离心 5m i n 弃上清，加4 0 0l al 预冷的胞浆裂解液，冰上裂解2 0m i n ，加2 5 | i1 ，1 0 n p - 4 0 ， 继续在冰上裂解2 0m i n 。1 0 0 0 0r p m 离心1m i n ，弃上清，加5 0 | j1 预冷的胞核裂解液， 重悬细胞，冰上裂解1 5m i n ，1 3 5 0 0r p m 离心1 5m i n ，上清中含有核蛋白，移至新的管中， 于- 8 0 保存，测定蛋白含量，待用。 表2 胞浆裂解液、胞核裂解液组成( p h 7 9 ) i 胞浆裂解液il o m mk c ，0 1 m me d ta ，0 1 m me g t a ，0 1 m md t t ，0 5 m mp m s f ，l o m m 脏p e sl 2 胞浆蛋白提取 与核蛋白提取一样将各组处理好的细胞分别收集于1 5m 1 离心管中，离心后弃去 上清，加上预先配制好的胞浆蛋白裂解液1 5 0l al ，同时加入1 0p1 ，1 0 n p - 4 0 ，冰 上裂解2 0m i n ，1 2 0 0 0r p m 离心2 0m i n ，将上清转移至新管中保存，测蛋白含量备用。 3 蛋白含量测定 标准蛋白溶液配制：1 0 0 0ug 牛血清白蛋白，溶于1m 1 蒸馏水中，配成1ug m l 标准蛋白原液。按表3 配制标准蛋白b s a 溶液( 0 - 6 0 | lg 1 0 0u1 ) ： 表3b s a 蛋白标准曲线溶液配比 0123456 标准品液( u1 ) o1 02 0 3 04 05 0 6 0 n a c l 溶液( u1 ) 1 0 09 08 07 06 05 04 0 蛋白含量( i ag ) o1 0 2 03 04 05 06 0 制作标准曲线：在一组1 5 m le p 管中分别加入上述7 组不同浓度的标准蛋白液， 再加入1m l 考马斯亮兰g - 2 5 0 染液，在酶标仪5 9 5f l m 处进行测o d 值，以浓度为横坐 标，o d 值为纵坐标( 各组o d 值一空白对照o d 值) ，作 8 东北师范大学硕士学位论文 0 4 o 3 5 o 3 捌0 2 5 蓄0 2 。0 1 5 0 1 o 0 5 o y = 0 0 0 5 9 x + 0 0 0 3 3 1 02 03 04 05 06 07 0 蛋白浓度( i l1 ) b s a 蛋白标准曲线 样品蛋白含量测定：取样品2p1 ，加入9 8 0l ll 的0 1 5mn a c l ( 稀释5 0 倍) ，再 加入1m 1 考马斯亮兰g - 2 5 0 染液，在酶标仪5 9 5 n m 处进行测o d 值，根据标准曲线计算 样品蛋白终浓度。根据稀释倍数再换算成每孔心肌细胞总蛋白含量，以pg m 1 表示蛋白 质含量。 4 s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 取约含2 0 垤蛋白的样本4 0l l1 ，加入5 上样缓冲溶液1 0 | i1 ，于1 0 0 煮沸 1 0m i n ，用梯度s d s 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，其中沉积胶浓度5 ，分离胶浓1 2 ，采 用恒压分离，电泳电压分别为：沉积胶8 0v 约6 0m i n ，分离胶1 3 0v 约1 5 0m i n ，直 到溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳。 5 蛋白免疫印迹 根据蛋白分子量标准切割凝胶并将胶上的蛋白转移至p v d f 膜上，转膜条件：横流 1 0 0m