（运动人体科学专业论文）蜂胶、维生素c的合剂对延缓小鼠运动疲劳的实验研究.pdf

摘要 目的：通过建立实验模型，研究蜂胶+ 维生素c 合剂对运动小鼠的抗疲劳作用，说明蜂 胶+ 维生素c 合剂营养促力效果是明显优于单一补充蜂胶、维生素c 的，两者在 抗运动疲劳方面有良好的协同性。 方法：采用健康雄性小鼠3 2 只，经l 周适应性训练后，将其分为四组，即运动对照组 ( t 组) ，运动+ 蜂胶提取液组( t 1 组) ，运动+ 维生素c 组( t 2 组) ，运动+ 蜂胶提 取液+ 维生素c 组( t m 组) ，适应性饲养1 周后开始实验。除t 组外，其余3 组小 鼠每天按3 0 mg 灌服相应的药液；t 组灌服相同体积的生理盐水。每日上午相同 时间喂药，给药时间从适应性饲养结束至取材日。3 周后，根据测定的各组小鼠 的体重变化情况、力竭游泳时间、血糖( g l u e ) 浓度、血乳酸( b l a ) 、血尿素氮 ( b u n ) 含量、肝糖原( l g ) 含量变化，观察蜂胶+ 维生素c 合剂对于游泳小鼠运动 能力的影响。 结果：连续喂药3 周后： ( 1 ) 补充蜂胶+ 维生素c 混合液的t m 组体重增幅最大。但是，实验开始和结束时小 鼠体重不存在显著性差异( p 0 0 5 ) 。 ( 2 ) t m 实验组与t 组，t 1 组，t 2 组，存在极其显著性差异( p o 0 1 ) ，这说明蜂胶提 取液+ 维生素c 组小鼠的力竭游泳时间是明显延长。 ( 3 ) 补充蜂胶和维生素c 合剂小鼠的血糖( g l u e ) ，肝糖原( l g ) 也显著高于t 1 ，t 2 组( p o 0 5 ) 。 ( 4 ) 补充蜂胶或维生素c 的t 1 ，t 2 ，蜂胶+ 维生素c 合剂t m 实验组比较游泳对照组小 鼠的血乳酸( b l a ) ，血尿素氮( b u n ) 含量都有下降，差异均有显著( p 0 0 5 ) 。 而t m 组，补充蜂胶和维生素c 合剂小鼠的血乳酸( b l a ) ，血尿素氮( b u n ) 含 量也显著少于t 1 ，t 2 组( p 0 0 5 ) ( 2 ) a c c o r d i n gt ot h et mg r o u pa n dt ，t1 ，t 2g r o u p s ，t h e r ei se x t r e m e l ys i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( p o 01 ) ，i ts h o w st h a tm i c e se x h a u s t i v es w i m m i n gt i m eo fp r o p o l i s + v k a m i ncg r o u pi sa no b v i o u se x t e n s i o n ， ( 3 ) a d d e dv i t a m i nc a n dp r o p o l i sm i x t u r em i c eg l u c o s e ( g l u c ) ，t h eg l y c o g e ni nl i v e r ( l g ) i ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to f t l ，t 2 ( p 0 0 5 ) ( 4 ) a d d e dp r o p o l i so rv i t a m i nc t 1 ，t 2 ，v i t a m i nc + p r o p o l i s ( t i n ) ，t h e i rb l o o d l a c t a t e ( b l a ) ，b l o o du r e an i t r o g e n ( b u n ) l e v e l sh a v ed r o p p e dc o m p a r e d e x e r c i s eg r o u pi f ) t h e r ei ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t e n to fti ，t 2 伊 0 0 5 ) c o n c l u s i o n ： ( 1 ) p r o p o l i s + v i t a m i ncw o n tc a u s eo b v i o u s l yi n f l u e n c eo nn o r m a lm e t a b o l i s m ( 2 ) al a r g en u m b e ro fp r o p o l i sf l a v o n o i d sc a ng u a r a n t e et h ef u n c t i o no fv i t a m i nc ， p r o m o t i n gt h ef a tm e t a b o l i s m , t h e r e b ys a v i n gg l y c o g e na n da c c e l e r a t e dg l y c o g e n s y n t h e s i s ( 3 ) a d d e dp r o p o l i so rv i t a m i ncc a nr e d u c eb l o o dl a c t a t e ( b l a ) c o n c e n t r a t i o n s ， w h i c hm a yb er e l a t e dt oi n c r e a s e dt h el d h a c t i v i t y ，t oa c c e l e r a t et h ee l i m i n a t i o n o fb l a b u nd r o p p e ds h o w st h a tt h ep r o t e i nc a t a b o l i s mi sr e d u c i n g t h i sa l s o l e a dt ot h em i c e ss p o r tf a t i g u ew i l la p p e a rl a t e r k e yw o r d s ：p r o p o l i s ；v i t a m i nc ；s p o r tf a t i g u e ；m i c e i v 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名：z 衫移 日期：加毋年归哆e l 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印 刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字 化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位 论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：z 彬彩 指导教师签名：植丸乡弛 日期：砂矿、髟7 日期：础、y 、i ) 1 前言 1 前言 随着竞技运动水平的提高和比赛的日趋激烈，运动员在运动训练过程中出现运动 性疲劳的现象时有发生，这直接影响到运动能力的提高。通过使用合理的营养手段，有利 于延缓运动性疲劳的发生，加快消除疲劳，促进机能恢复等。 大量的科学研究表明，蜂胶已经作为大运动量、大强度训练期间运动员运动性疲劳 预防和消除的营养补剂【1 1 。其中富含多种黄酮类化合物，它所具有的抗氧化功能也早已 被人们所证实。维生素c 在长期的临床使用中，其良好的抗自由基，抗氧化功能也得到 了充分的映证，且安全系数大，能够保护生物大分子和生物膜效应。 自由基反应和脂质过氧化反应在人体的新陈代谢中均起着重要的作用【2 1 。长时间剧 烈运动中，机体内0 2 不完全还原反应的产物超氧阴离子生成量增加，引发其它自由基产 生和脂质过氧化，从而使生物膜的膜蛋白发生交连并使膜不饱和脂肪酸减少，造成运动 能力下降。黄酮类化合物和维生素c - - - 者的抗氧化作用在食品中的应用已有报道1 3 j ，但 在运动人体科学中，二者在延缓运动疲劳方面的研究还比较少。 本实验试图通过实验建立游泳训练模型，灌服蜂胶+ 维生素c 合剂，测定小鼠的血糖， 肝糖原，血乳酸，血尿素氮等生化指标，比较研究蜂胶+ 维生素c 合剂与单一服用蜂胶， 维生素c 在延缓运动疲劳方面的优越性，由此得出，蜂胶+ 维生素c 混合液在抗运动疲劳 方面所具有的良好协同性。 本文结论部分对蜂胶+ 维生素c 混合液抗疲劳作用的可能机制做了一定的阐述，本作 者认为可能是由于蜂胶中含有大量的黄酮类化合物本身就具有抗氧化性，能够促进体内 脱氢氧化型维生素c 再度变成还原型维生素c ，可以快速清除运动时因氧化代谢增加产 生的大量超氧自由基，降低组织脂质过氧化的发生率，从而减少对细胞的损伤。而蜂胶 中有效成分含酚羟基，运动过程中产生自由基氧化这种较不稳定的因素，减少对细胞膜 的氧化损伤，而该成分又能够保证维生素c 发挥正常作用清除过多的自由基。还原性维 生素c 可以促进糖原合成，而且蜂胶自身含有大量的糖脂类物质也可能参与糖原的合成， 两者协同作用，大大提高运动能力，延缓运动疲劳的产生和发展。 湖北大学硕士学位论文 2 1 运动性疲劳研究的概况 2 1 1 运动性疲劳的概念 2 文献综述 1 8 8 0 年，莫桑( m o s s o ) 就开始了对人类疲劳的研究，他在1 9 1 5 年就提出了疲劳是 细胞内化学变化衍生物导致的一种中毒现象；1 9 8 0 年k a r l s s o n 提出，疲劳是丧失保持所 需或预想的输出功率。在1 9 8 2 年的第5 届国际运动生物化学会议上将疲劳定义为： “机 体生理不能保持其机能在一特定水平上和不能维持预定的运动强度。这个定义把运动性 疲劳解释为由于运动或训练所引起的机体机能水平下降，从而难以维持一定的运动强 度，经过适当休息又能得到恢复的现象。 大量的研究也证实了这一点，从运动生理学角度讲，疲劳产生后，机体很快可以产 生适应，经过适当休息，疲劳可自行消失，随之是运动能力的提高。从训练学角度分析， 身体只有承受疲劳，并随着身体对疲劳适应能力的提高，才能提高运动能力。一个多世 纪以来，运动性疲劳及其消除一直是体育科学研究中重要的研究课题。随着运动生理学的 发展，对于运动疲劳产生机制的认识，已经从单纯的能量消耗或代谢产物堆积，向着多因 素、多层次、多环节、综合作用的认识发展。 2 1 2 运动性中枢疲劳机制 1 9 7 8 年，e d w a r d s 将疲劳从起因上区分为中枢性疲劳( 定位于中枢神经系统) 和周围性 疲劳( 定位于骨骼肌内部或神经肌肉联结的部位) 中枢疲劳发生的解剖部位从大脑到脊 髓运动神经元为止。近几十年来的大量研究证实，中枢神经系统递质5 羟色胺( 5 h t ) 、 多巴胺( d a ) 、去甲肾上腺素( n e ) 、乙酰胆碱( a c h ) 以及代谢产物氨和细胞介素 等可能是导致运动性疲劳的神经生物学因素。 脑5 - h t 浓度升高对唤醒、嗜眠、失眠和心境具有重要的调节作用，可能与运动性疲 劳的产生有密切关系。色氨酸( t r p ) 是合成5 - h t 的前体，它以结合和游离的形式存在 于血中，其血中的浓度受其结合蛋白清蛋白的控制。长时间的耐力运动会导致血浆 中支链氨基酸b c a a ，与f t 印( 游离色氨酸竞争通过血脑屏障) 不断被工作肌摄取和氧 化，其浓度会有所下降；同时血浆游离脂肪酸( f f a ) 浓度增高，使色氨酸与清蛋白结 合量减少，血浆g t r p ( 仅此形式可通过血脑屏障) 浓度升高。结果，t r p b c a a 比值升 2 2 文献综述 高，通过血脑屏障的t r p 增加，脑合成5 h t 增多。5 - h t 浓度升高可能通过抑制多巴能神 经元系统而诱发疲劳，也可能降低唤醒和动力产生疲劳。此外，5 一h t 能神经元的活动可 能影响下丘脑垂体肾上腺轴的机能。f 4 王斌等在力竭大鼠纹状体和下丘脑中发现5 h t 浓度的升高和d a 浓度的下降有良好的关系，支持了上述的观点。 d a 是脑内的一种重要的单胺类神经递质，在对d a 的早期研究中，c a r l s s o n 发现纹 状体是脑组织中d a 含量最高的组织，占全脑的7 0 。【4 l 王斌等实验也证实在纹状体和中 脑中d a 的含量较高。 5 1 李倩茗等发现大鼠尾核d a 代谢随运动强度增大而增加。王斌等 实验中发现，大鼠下丘脑d a 在力竭性跑台运动后有逐渐下降的趋势，实验同时发现下 丘脑n e 持续下降的趋势与下丘脑d a 的持续下降的趋势相一致。n e 是多巴胺p 羟化酶催 化d a 生成的，神经中枢内的d a 代谢会影响n e 的代谢。n e 和d a 下降共同作用于下丘脑， 抑制下丘脑的活动，这是中枢疲劳产生的可能原因。 a c h 是人体内最普遍存在的神经递质。a c h 的合成、释放和再摄取对于肌肉的力量 生成是必需的。a c h 也是一种重要的神经递质，在中枢神经系统的神经元和交感神经的节 前纤维起作用。其水平变化与记忆、意识、感觉及内脏功能调节密切相关。 6 c o n l a y 等 报道：马拉松运动员在比赛中其血浆水平下降约4 0 ；如果保持血浆胆碱水平或者补充 适量胆碱饮料，其疲劳发生将会延迟。提示当中枢a c h 浓度下降时，中枢疲劳就会发生。 氨在运动时主要由肌肉产生并释放到血液，可以通过血脑屏障，并具有毒害作用。 短时间大强度运动时骨骼肌中氨的生成主要来源于嘌呤核苷酸降解；长时间中等强度运 动时氨的主要来源是b c a a 在骨骼肌中的降解，特别在运动后期肌糖原大量排空后或在 运动前补充洳c a a 都可以使运动时血氨浓度升高。脑组织自身也可能产生氨，主要通 过脑组织中的嘌呤核苷酸降解和一些氨类的神经递质( 5 - h h t ，d a ，c a ) 脱氨基作用 产生氨。高浓度的氨在中枢神经系统内的缓冲方式是生成谷氨酰胺，同时必须消耗三羧 酸循环的中间代谢产物a 酮戊二酸而使三羧酸循环中间代谢产物流失，因此对脑的氧化 代谢能力产生非常不利的影响。另外氨可以改变脑膜对一些氨基酸的通透性，某些氨基 酸又是一些神经递质的前体，进而影响各种神经递质的代谢，据此认为氨可能是中枢疲 劳的重要原因之一。 2 1 3 外周疲劳的理论研究现状 外周疲劳理论指人体运动时，因肌肉能量代谢变化而引起外周细胞内外液改变，从 而导致肌肉工作能力下降的现象。 湖北大学硕士学位论文 “衰竭”学说 这种学说认为，人体运动时，肌肉的能源物质( a t p 、c p 、糖、脂肪等) 大量消耗，导 致机体能源物质短缺，肌肉工作能力下降、不能完成预定的运动强度，出现疲劳。不同运 动条件下的疲劳，其能源物质的消耗有所不同。在短时间大强度运动中，肌肉中的a t p c p 等高能磷酸物含量降低与运动疲劳有直接关系：而c p 的过分消耗对短时间、大强度运动 疲劳的影响更大，疲劳状态时，肌肉中的c p 含量仅相当于运动前的2 0 m 。在中等强度、 长时间的运动中，血糖水平和骨骼肌糖元的减少，造成大脑皮层和骨骼肌工作能力下降， 是造成运动疲劳的直接原因。在超长时间的运动中，脂肪供能下降是导致运动疲劳的主 要因素。1 8 l “堵塞 学说 人体运动时，因能量代谢活动的增强而导致某些代谢产物堆积过多而又不能及时消 除，进而导致肌肉工作能力下降的现象。乳酸是目前研究最多的致疲劳物质。乳酸的堆积 可通过多种途径造成运动疲劳：乳酸解离生成一，导致肌肉p h 值下降，抑制糖酵解过程， 造成a t p 供应障碍；乳酸解离生成的一可竞争性的置换肌钙蛋白中的c a 2 + ，使兴奋一收 缩脱偶联，导致肌肉机能下降；另外血乳酸含量的升高，降低了血液p h 值，造成脑工作 能力下降。运动过程中，a t p 大量分解，强烈激活a m p 的分解过程，脱氨使体内氨含量 升高。氨含量的升高促发糖酵解过程，使乳酸含量增加，体内p h 值下降，蛋制品肌肉和 大脑的工作能力下降。 神经一肌肉接点疲劳理论 人体运动时，因神经一肌肉接点代谢物质( a c h ) 变化及微环境条件改变而引起肌肉 工作能力降低的现象。当人体运动疲劳时，肌肉的持续性收缩导致神经一肌肉接点处的 神经递质乙酰胆碱( a e h ) 释放减少，或剧烈运动导致乙酰胆碱堆积、骨骼肌膜持续去极 化，肌肉缺乏正常的兴奋舒张交替，从而引起肌肉收缩力下降。 外周多层次影响的疲劳理论 该理论提出了体内存在一个能动性的外周代谢体系的概念，即存在于机体外周的“血 液一组织间液一骨骼肌一之间的各种梯度系统，这些系统包括：血液一组织间液一骨骼肌 之间的p h 梯度、离子梯度、酶活性梯度、电活动梯度等。它们在不同的时空上多层次地 参与机体代谢过程，并在不同的环节上对机体机能发生影响，共同构成了一个外周代谢 体系。运动疲劳是这个体系中多因素、多部位、多层次的综合性影响的结果，称为“外 周多层次影响理论 。殷劲、高兴等人【9 1 以自创的骨骼肌组织间液采样方法为突破点， 4 2 文献综述 对剧烈运动导致运动疲劳时机体外周代谢组织进行了体系研究，结果表明：短时间剧烈运 动所致的疲劳与下列因素有关：股直股、臀浅肌、组织间液、血液的乳酸值、l d h 同工 酶、c a ”、c l 浓度升高，并在肌组织、组织间液、血液之间形成浓度梯度；骨骼肌k + 浓 度升高，而n d 、h p o ；降低。从面证明：短时间剧烈运动导致的疲劳正是“能动性外周 代谢体系中多因素( 乳酸、l d h 同工酶、阴阳离子) 、多层次( 血液、组织液、骨骼肌) 综合性影响的结果。 氧自由基一脂质过氧化作用与外周疲劳 应用电子自旋共振技术( e s r ) 直接测定生物体内的氧自由基，证实在长时间持续性 运动和递增性力竭运动中，体内的氧化代谢加强，骨骼肌、心肌、肝脏等组织的自由基增 加，体内脂质过氧化反应加强。氧自由基和及其引起的脂质过氧化反应可以攻击细胞及线 粒体等生物膜，造成离子、能量代谢紊乱，从而导致运动疲劳【1 0 1 。值得注意的是，运动 引起的氧自由基增多和脂质过氧化反应加强的机制可能是多因素的，运动中耗氧量的增 加、能量代谢加强、抗氧化酶活性下降、胞浆中的c a 2 + 浓度升高都可以引起氧自由基的 增多。 近年来，有关自由基和线粒体钙循环与运动疲劳之间关系的研究正在进行中。长时间 有氧运动过程中机体的线粒体是产生运动性内源自由基的主要部位，自由基对线粒体膜 和钙循环的关系极为密切。当运动疲劳发生时，受氧自由基的影响，线粒体钙循环失调 首先发生，之后通过影响基质内的酶系统而使细胞能量转换功能降低。丁树哲等【儿1 认为， 中等强度的运动性疲劳是由以运动性内源自由基为先导、以c a 2 + 为中介的具有保护作用 的功能调节过程。这种过程一方面造成机体疲劳，另一方面调节氧的提供和基质底物的 利用，并阻止因线粒体的过度利用而出现的破裂趋势的发展。因此运动性疲劳首先是一 种自我表现保护机制，在这种机制的形成过程中，内源性自由基和钙离子可能是以调节 因子的形式发挥作用的。 钙离子代谢紊乱与运动疲劳 近年来，离子代谢在运动疲劳中的作用越来越受到重视，目前研究最多的与运动疲 劳有关的离子是钙离子。大量的动物实验表明，线粒体钙离子作为调节细胞内能量转换 的主要离，在有氧运动产生的运动性疲劳中是重要的调控因子。运动疲劳发生时，引发了 线粒体膜的脂质过氧化反应，心肌和骨骼肌线粒体膜的流动性显著降低，线粒体氧化代 谢能力和钙调节能力均有所下降；同时，肌浆网的c a 2 + 一a t p a s e 的活性下降，使其将c a 2 + 逆浓度梯度转运入肌浆网和将c a 2 + 释放到胞浆内的功能下降。因此，疲劳状态下，a t p 湖北大学硕士学位论文 大量消耗使肌细胞内的a t p 减少，导致胞浆内m 9 2 + 增多，从而m 9 2 十外流增加，胞浆内m 9 2 + 浓度下降，肌浆网功能随之下降，因此胞浆内和线粒体内的c a 2 + 浓度增加，细胞氧化磷酸 化过程受到抑制，导致a t p 生成减少；另一方面，胞浆内的a t p 减少，由此可导致细胞 内c a 2 + 代谢的紊乱【1 2 1 。如此反复的“恶性循环 可能就是运动性疲劳的钙解释机制。 2 1 4 外周疲劳的研究现状 外周疲劳是对发生在外周( 肌肉本身) 的运动性疲劳的一种粗略的定位。当前，对 外周疲劳的研究主要集中在肌细胞膜、t 管与肌浆网( s r ) 、线粒体、横桥等部位。 肌细胞膜和外周疲劳 肌细胞膜是肌细胞新陈代谢中细胞内外进行物质交换的场所，同时又是肌细胞兴奋 以及兴奋传播的部位。肌细胞膜为脂质双层结构，主要组分为类脂质及蛋白质，膜内外 离子浓度有显著的差异，这是由于肌细胞膜对于不同离子有不同的通透性，细胞内液中 的阳离子主要是k + ，细胞外液的阳离子主要是n a + 。当终板电位作用于肌细胞膜时引起 膜的通透性发生突然变化，删大量透过膜进入细胞浆内，造成膜的去极化。在肌细 胞兴奋后使内外的离子恢复到原来的浓度，才能保持继续兴奋的能力，这就要依靠肌细 胞膜上n a + k + - a t p 酶( 又称钠泵) 的工作，把细胞内的n a + 排出膜外及把细胞外的k + 运 回膜内。这是个逆浓度差的离子转运过程，需要消耗a t p 。长时间运动所导致的肌细胞 内a t p 浓度下降以及酶蛋白的活性下降都降低了钠泵的工作能力，从而影响了肌细胞膜 的去极化过程，导致肌肉工作能力下降。j o n e s 1 3 】观察到，在实验中当膜外k + 浓度从5 m m 增加到1 0 m m 时所记录的动作电位即类似于在疲劳肌细胞中所记录到的那样。也有实验 证明，进行长时间运动时，引起肾上腺素浓度上升，增加了肌细胞对k + 的通透性，引起 膜的超极化状态，使肌细胞兴奋减弱。 t 管和肌质网与外周疲劳 t 管系统的生理作用主要是允许肌细胞外膜的动作电位经过t 管传播到肌纤维的核 心部位。现今普遍认为t 管动作电位由t 管内膜蛋白质( 二氢吡啶，d 唧) 受体感受，当 肌细胞激活时t 管电荷移动，d h p 经受了电压驱动的构象变化，紧接着又激发了邻近部 位s r 钙通道开放释放c a 2 + 。h o w e l l 等( 1 9 8 1 年) 观察到细胞外c a 2 + 浓度从1 m m o l l 增加 n 2 0 m m o l l ，最大张力呈现降低。作者认为肌肉收缩活动引起t 管c a 2 + 浓度升高，可以 减慢t 管动作电位的传导速度，t 管的传导阻断使肌纤维轴核心部位不能完全激活。t 管 动作电位或t 管系统和s r 终池之间联系信号的衰退是产生疲劳的原因。【1 4 1 田野【”1 等认为 6 2 文献综述 肌质网的主要生物学功能是调节胞浆内的c a 2 + 浓度。最近许多研究人员一致观察到，在 肌肉运动性疲劳发生时，肌细胞中c a 2 + 的转移幅度下降。c a 2 + 的转移是指肌质网的c a 2 + 的释放和c a 2 + 的重摄取。肌质网c a 2 + 的释放幅度下降导致胞浆中的c a 2 + 不足，可引起兴 奋收缩脱耦联，从而影响肌丝的滑行。w e s t e r b l a d l l 6 1 等在疲劳肌实验中使用直接刺激肌 质网c a 2 + 释放的物质咖啡因，使疲劳肌纤维张力的下降得到逆转。当肌质网对c a 2 十的重 摄取能力下降时，可表现为肌纤维舒张期的延缓，进而影响横桥的摆动频率。【1 7 1 田野等 在实验中观察了w i s t e r 大鼠在持续运动方式下急性运动对肌质网转运能力的影响，发现 运动后股四头肌s r c a 2 + m 9 2 + _ a t p a s e 水解活性下降；s r c a 2 + _ a t p a s e 水解活性显著下降。 1 9 l 李杰以1 8 m m i n 的速度运动1 0 0 m i n 为运动性耐力模型，观察到腓肠肌和比目鱼肌s r c a 2 + - a t p a s e 活性都比对照组有显著性下降。s r c a 2 + m 9 2 + a t f a s e 和c a 2 + - a t p a s e 的活性 下降都影响了s r 转运c a 2 + 能力，是运动性疲劳产生可能原因之一。 线粒体( m i t ) 和外周疲劳 线粒体是细胞有氧代谢的场所，在肌肉收缩过程中，它通过氧化磷酸化，提供肌肉 收缩的能量。g o l l n i c k 等( 1 9 6 9 年) 报导大鼠力竭运动后线粒体显著肿胀，可使氧化磷 酸化解耦联。c a s t i l h o 等( 1 9 9 5 年) 指出活性氧攻击膜蛋白s h ，造成膜通透性转运。g u n t e r 等( 1 9 9 0 年) 报导线粒体膜疏基氧化还原状态与线粒体通透转运相联系，可能是疏基干 扰了膜的脂质双层结构。s t r a t m a n 等( 1 9 8 8 年) 报导急性力竭运动后线粒体疏基含量下 降。【1 9 l 上述实验表明运动时内源性活性氧增加，膜的脂质过氧化反应增多，膜蛋白构型 改变，导致通透性转运增加。谷胱苷肽( g s h ) 是细胞中最丰富的非蛋白疏基的来源。 v a l l e 等( 1 9 9 3 年) 指出c a 2 + 蓄积可导致膜蛋白聚合，其机制可能是c a 2 + 通过呼吸链刺激 活性氧的产生，且c a 2 + 结合到线粒体膜蛋白上，导致其构型发生变化，有利于活性氧攻 击膜蛋白疏基。线粒体呼吸能力下降是运动性疲劳产生的重要原因。 横桥和外周疲劳 横桥是肌肉收缩与舒张的关键部位，也是疲劳产生的可能部位。有研究指出，等长 收缩时力量生成直接与横桥结合的数量多少有关，这种类型运动时疲劳的发生与运动引 起的横桥损伤或紊乱有关。大强度等张收缩所引起的运动性疲劳可能是a d p 和一浓度升 高抑制了横桥的循环速度有关。 2 2 蜂胶提取液对运动后机体免疫机能的影响 蜂胶成分复杂，已鉴定出其含有黄酮类、萜烯类、脂类等多种化合物和多种维生素 7 湖北大学硕士学位论文 及微量元素等【2 0 1 ，研究表明【2 l 】，黄酮类化合物不仅可以清除机体内的自由基，而且对脂 质的过氧化作用有很强的抑制作用。长时间剧烈运动中，机体内0 2 不完全还原反应的产 物超氧阴离子生成量增加，引发其它自由基产生和脂质过氧化，从而使生物膜的膜蛋白 发生交连并使膜不饱和脂肪酸减少，造成运动能力下降蜂胶提取液中富含多种黄酮类 化合物，其抗氧化功能已被人们所证实。 体外试验结果显示，在不加丝裂原的条件下，蜂胶( p f ) 就能促进淋巴细胞增殖， 具有丝裂原样作用；低浓度的p f 能协同c o n a 束l j 激t 淋巴细胞的增殖，高浓度的作用反而 不明显，再次证实了其量效关系。对胸腺和脾都能促进其产生大量淋巴细胞，脾有丰富 的b 淋巴细胞，可分泌特殊性抗体；对骨髓、淋巴结等整个系统产生有益的影响【2 2 1 。 大量研究证明：蜂胶中的松属素、高良姜素、山奈素、咖啡酸脂等蜂胶浸出物都有 抗菌活性，其本身没有抗原性，但可起免疫佐剂作用，能促进抗体的产生，使血清总蛋 白和某种球蛋白的含量增高，白细胞和巨噬细胞的吞噬能力增强，机体的特异性和非特 异性免疫能力提高。1 2 3 l 防止运动员免疫能力下降已是运动医学工作者的重点，除合理安排训练强度和训练 量外，目前研究主要集中在营养补剂对人体免疫能力的调节作用上1 2 4 1 。蜂胶对人体免疫 能力有重要的影响，可能是大运动量、大强度训练期间运动员运动性疲劳预防和消除的 营养补剂，其增强大强度运动后机体免疫能力的作用机理可能是蜂胶对机体免疫系统具 有广泛的作用，既能增强体液免疫功能，又能促进细胞免疫功能。蜂胶对感染性疾病， 一方面具有广谱抗生素作用，抑制致病生物的生长和繁殖。一方面则使机体的免疫能力 增强，最终消灭病原体，使疾病得以痊愈【2 5 1 。动物实验表明，花粉和蜂胶混合添加剂 能提高动物的体重、铁离子的利用和血红蛋白的再生，并且还能增强其功效。所以人们 称蜂胶是天然免疫功能促进剂，对运动员免疫功能具有促进作用量，增强其免疫能力【2 邑 2 7 1 。 2 3 维生素c 清除自由基作用 抗氧化剂的保护作用：凡具有还原性而能抑制靶分子自动氧化即抑制自由基链反应 的物质称为抗氧化剂。能与自由基反应使之还原成非自由基的抗氧化剂称为自由基清除 剂。几种重要的抗氧化剂：超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶、维生素c 。 美国著名医学家c a t h c a r t 2 8 l l e v i n e 2 9 1 称，维c 是最理想、最快速的自由基清除剂。众所 周知，人体在正常新陈代谢情况下要产生少量游离的化学基团，如o h 基，h 等，称为自 2 文献综述 由基( f r e er a d i c a l ) ，这些物质具有较强的酸性，对人体有害，正常人通过肝脏、肾脏将自 由基解毒并排出体外。当患肺炎等感染性疾病，或糖尿病等代谢性疾病时，自由基产生 大量增加，超过人体正常解毒功能；而当患肝硬化、慢性肾炎等严重脏器疾病时，对自 由基的解毒和排毒功能减退，上述两种情况均会产生导致酸性物质大量集聚，造成代谢 性酸中毒，对人体各脏器和神经系统造成严重损害，不但直接加重病，而且使临床表现 复杂化，治疗会面临更大困难，病人预后不良。与其他一些自由基清除剂不同，维c 清 除自由基的生化反应产物是无毒害的，不会对肝、肾、心、脑等脏器功能造成损害，因 为维c 在与自由基结合过程中，一部分短暂生成去氢抗坏血酸一自由基化合物，经肾脏 排出体外，一部分在经过“水解反应”以后，重新生成维c ，恢复生化活性，使体内维c 去氢维c l g 值保持高比例( 大于2 以上) ，去氢维c 本身也是无毒产物。因此，维c 清除自 由基的过程是一个高速、无毒的循环过程，最符合生理反应的要求。 2 4 维生素c 的药物代谢动力学 l e v i n e 2 9 】等以及w i l s o n 大量的临床应用表明，维c 可以口服，可以静脉给药，也可 以经直肠给药。研究证实，口服本品后主要以原型通过胃和十二指肠，在小肠经由“钠 依赖性维生素c 载体”( s o d i u md e p e n d e n tv i t a m i nct r a n s p o r t e r ) 通过肠道屏障被吸收入血 液循环，少量在胃先与氢离子结合成为双氢维c ，然后经小肠壁载体( g l u c o s et r a n s p o r t e r ) 吸收入血，药物半衰期约3 一h 。 、 静脉给药在无额外给药的情况下，维c 体内血浆浓度的正常值约为1 0 - 2 0 m g i i d ， 人体维c 的正常储存量为1 s g ( 无生物活性) ，每天仅能转换3 0 - _ 4 5 i n g 为活性维c 参与新陈 代谢，内源性转换量显然不能满足机体需要，每天必须从体外补充。维c n n 是澄明无 色的水溶，无刺激性，其p h 值经缓冲剂调整至6 2 7 ，对酸碱平衡无影响，静脉注射或 滴注后，迅速均匀分布到全身各处，可以通过血脑屏障进入各种细胞内。生理情况下， 维c 在白细胞、组织细胞和血小板内的浓度高于红细胞和血浆，它可以进入肿瘤细胞， 并保持较高浓度。约2 5 的抗坏血酸与蛋白质结合，存在于血浆中。进人体内的维c 一 部分转化为无活性成分，储存于体内，一部分参与新陈代谢和肝脏解毒功能，转换为无 毒产物，主要从肾脏排出体外。现己明确有维c 代谢旁路，其中之一是l 型转为氧化型， 这一旁路在维c 的抗氧化功能中起重要作用。另一代谢旁路是转换为无毒性的维c 一2 硫酸盐，主要从。肾脏，少量从肠道排出体外。 9 湖北大学硕士学位论文 2 5 蜂胶提取液与维生素c 的协同抗氧化作用 机体在运动过程，体内将产生大量的自由基。其化学性质活泼，可与机体内c h o 、蛋 白质、核酸及脂类等发生反应，造成细胞功能和结构的损伤和破坏。自由基不仅能引起 线粒体呼吸链产生a t p 的过程受到损害，使细胞能量生成发生障碍，还能导致某些酶的失 活及肌肉收缩力下降等【3 0 】。研究发现，运动中自由基的大量产生和血浆脂质过氧化( l p o ) 的显著性升高，是导致运动性疲劳产生的重要原因。大量研究表明，蜂胶提取液不仅能保 护吞噬细胞免受自身的氧化损伤，促进t 、b 淋巴细胞增生，刺激t 细胞的功能，增强巨噬细 胞、细胞毒性t 细胞和自然杀伤细胞的能力，减少淋巴细胞d n a 的氧化损伤以及促进某些 细胞因子的产生【3 1 1 ，还能直接与自由基作用，作为生物抗氧化剂，对体内单线态氧的猝 灭、搜集过氧自由基以及自由基阴离子等方面发挥积极作用，消除体内因运动而产生的 过氧自由基，减少自由基对细胞遗传物质( d n a 、r n a ) 和细胞膜( 如蛋白质、脂质和糖类) 的损伤。从而延缓疲劳的发生或有助于运动后疲劳的消除。蜂胶提取液与维生素c 这种 相互作用可能与其促进脂肪利用、促进糖异生，从而节约糖原及加速合成糖原有关。乳 酸是糖酵解的终产物，又是有氧氧化及糖异生的基质它能促进血乳酸浓度的降低，这与 其提高应激状态下乳酸脱氢酶的活性，促进糖异生作用，加速乳酸消除有关。而对于骨 骼肌自由基的代谢，促进力竭游泳后小鼠体能的恢复，其机制可能与其能增强抗氧化酶 的活性，加速自由基的清除，减轻自由基对骨骼肌的损伤作用有关。作为两种自由基清 除剂，他们能在组织细胞中直接捕获或结合自由基。 1 0 3 实验材料与方法 3 1 实验材料与分组 3 实验材料与方法 实验对象：为5 周龄健康雄性小鼠3 2 只，体重1 8 2 2 9 ，由湖北省中南医院实验动物中 心提供。标准啮齿类动物干燥饲料喂食，自由饮食。 动物饲养环境：照明随同自然光变化。通风，室温2 2 2 8 度，湿度4 0 * 一6 5 。 实验分组：将小鼠随机分为4 组： 燃黼 1 周适应性训练后，灌服生 t8 运动对照组 理盐水 l 周适应性训练后，灌服配 豳 t 18运动+ 蜂胶提取液组 制的蜂胶提取液 1 周适应性训练后，灌服维 溺 t 28 运动+ 维生素c 组 生素c 溶液 l 周适应性训练后，灌服配制 豳 t m8 运动+ 蜂胶提取液+ 维生素c 组 蜂胶+ 维生素c 的混合液 3 2 实验用药 药液制备：取蜂胶粉1 0 0 克( 河南益康蜂业有限公司生产) ，加入一定量乙醇溶解， 浸泡3 天后加水溶解，摇荡过滤制备成所需溶液。依据初步实验人群实验，确定人体使 用的蜂胶提取液l o g d ，按照中国成人男子标准体重6 5k g 计算，即0 1 5 9 k g ，小鼠的 给药剂量3 0 m g d 。 按照维生素c 的常规参考值1 5 0 0 m g k g 。小鼠用量为3 0 m g d ，每天灌胃1 次，持续 3 周。对照组灌服等量生理盐水。 3 3 运动模型 训练组进行3 周的游泳训练，依照啮齿类动物的生活习性，游泳训练安排在傍晚固 定时间进行。每周游6 天，间接性加水保持水温( 3 0 - + 2 c ) ，水深3 0 c m ，游泳过程为强迫 湖北大学硕士学位论文 式，避免漂浮水面。第一周游泳4 0 m i n d ，以后每周递2 h 2 0 m i n 。另外，每周一、四称重。 在处死前进行最后一次无负重的力竭性游泳，记录游泳时间。力竭判断的标准为：小鼠 沉入水中超过l o ”，且放在平面上无法完成翻正反射。 3 4 给药方法 适应性饲养1 周后开始实验。除t 组外，其余3 组小鼠每天按3 0 m g 灌服相应的药 液；t 组灌服相同体积的生理盐水。每日上午相同时间喂药，给药时间从适应性饲养结 束至取材日。共计3 周。 3 5 采样 各组于末次灌胃后3 0 m i n 开始力竭游泳，结束后摘眼球取血，离心取血清，采用北 京北化康泰临床试剂有限公司试剂盒，r t - 1 9 0 4 c 型半自动生化分析仪。氧化酶法测血糖 ( g l u c ) 浓度，乳酸仪测定血乳酸( b l a ) ，二乙酰一肟法测定血尿素氮( b u n ) 含量， 同时取肝样采用葸酮比色法测定肝糖原( l g ) 。 3 。6 数据测定 3 6 1 动物称重 在实验过程中，每周一，周四灌胃前用电子天平秤大鼠体重，做好相应记录。但最 后一次称重为力竭运动前即刻。 3 6 2 力竭游泳时间测定 进行力竭游泳，秒表计时并用小棒不停驱赶小鼠，以免小鼠漂浮于水面而影响力竭 时间的真实反映。小鼠沉入水中超过l o ”，且不能自主浮上水面。放在平面上无法完成 翻正反射。 3 7 实验小鼠血糖，血乳酸的测定 3 7 1 样品要求 1 样本应为未溶血血清。 1 2 3 实验材料与方法 2 血清应该尽快分离，在全血中每小时血糖大约降低7 ，血清中血糖在2 c i o c 储存可稳定2 4 j * 时。 3 7 2 血糖的测定原理及步骤 原理：血清或血浆中的葡葡糖在加热的有机酸溶液中能与某些芳香族胺类反应，生 成有色化合物，如与只和醛糖起作用的邻甲苯胺反应，生成蓝色的s c h i f f 碱，从而测定 血糖值，反应如下： 詈m 聂卫锄 父：l 一，吨” h + h o 磊2 0 “ 测定步骤： 取7 支试管，分别标以0 - 6 号，每管中加入邻甲苯胺试剂5 m l ，葡萄糖标准液依次 加入l 一5 号管中，蒸镏水、血清分别加入0 和6 号管中，加入量均为0 1 m l 。混匀后水 浴中煮沸1 5 分钟，取出后在流水中冷却，用6 8 0 h m 波长，以“0 号管调零，分别测定 a 。用l 5 号管的a 值为纵坐标，对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，由6 号 管的a 值从标准曲线上查出葡萄糖浓度，求出血糖值。 3 7 3 血乳酸的测定原理及步骤 乳酸盐测定仪测定原理【3 3 ，】： 检测探头上装有一片三层的膜，其中间层为固定的乳酸盐氧化酶。表面被膜覆盖的 探头位于充满缓冲液的样品室内，当样品被注入样品室后，部分底物会渗进膜中；当它 们接触到固定酶( 乳酸盐氧化酶) 时便迅速被氧化，产生过氧化氢。过氧化化氢( h 2 0 2 ) 继而在铂阳极上被氧化产生电子。当过氧化氢生成率和离开固定膜层的速率达到稳定时 便可得到一个动态平衡状态，可用稳态响应表示。电子流与稳态过氧化氢浓度成线性比 例，因此与乳酸盐浓度成正比。 测定步骤： 各采血2 0pl 加入4 0 弘l 破膜液中，立即充分振荡破碎细胞：立竭游泳后立即采血 已 严r 湖北大学硕士学位论文 2 0pl 加入4 0ul 破膜液中振荡；休息2 0 m i n 后再各采血2 0ul 加入4 0i ll 破膜液中振 荡，按照说明书操作乳酸盐测定仪。 3 7 4 结果计算 血糖含量= a u a sx 标准液浓度标准液浓度l o o m g d l ( 5 5 5 m m o l l ) ( a u 一测定管吸光度a s - 标准管吸光度) 血乳酸量：实际值= 测得值x 3 ( 2 0ul 样品加入4 0i ll 破膜液中，已稀释了3 倍) 3 8 血尿素氮( b u n ) 浓度测定 3 8 1 原理 样品中尿素在氯化高铁磷酸溶液中与二乙酰肟和硫氨脲共煮，形成一种红色的化 合物d i a z i n e ，其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出 尿素的含量。 3 3 , 3 4 j on o i j00 i ii i h i il i c h 3 一c - - c - - c h 3 - i - h , o 一c h ，c c c h 】+ n h ：o h 吼_ oc o 一+ n c _ 。冷c l q 3 。p 3 8 2 仪器和试剂 7 2 1 分光光度计，l o m l 带塞试管，l m l ( 或1 。5 m l ) 塑料离心管，电炉，锅，灌胃针 头。试剂盒( 二乙酰一肟法) ：- - k , 酰一肟应用液、氯化铁一磷酸应用液、尿素标准液 ( 2 0 o m g d l ) 。 3 8 3 实验步骤 全血2 0 0 0 p r n m i n 离，d 1 5 m l n ，取血清备用。置沸水浴中煮沸1 0 分钟，再于冷水中冷 却。在5 2 0 h m 波长处( 或绿色滤光板) ，以蒸馏水调零，测定各管吸光度值( a 值) 。 1 4 3 实验材料与方法 3 8 4 结果计算 l m m o l l 尿素= 2 r e t o o l 1 尿素氮 尿素( t o o l l ) - - - - a u x1 0 a s ( a u - n 定管吸光度a s 一标准管吸光度) 3 。9 肝糖原测定 3 9 1 检测原理 葸酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于6 2 0 r i m 处有最大吸收1 3 5 3 6 1 。测 定其光密度，可以确定糖原的含量。 3 h 2 0 铱h , s 0 4 3 9 2 仪器与试剂 仪器：7 2 1 型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，移液泵，沸水浴，灌 胃针头，手术器械，玻璃漏斗，加样器，2 m l 、5 m l 、1 0 m l 吸量管，2 0 m l 带塞刻 度试管，1 0 m l 带塞离心管。 试剂：5 三氯醋酸( 用蒸馏水配) ( t c a ) ，葡萄糖标准液，浓硫酸( a r ) ，葸酮试剂。 3 9 3 实验步骤 取肝组织1 0 0 m g ，加入8 m lt c a ，每管匀浆l m i n ，将匀浆液倒入离心管，以3 0 0 0 转m i n 离- l , 1 5 m i n ，将上清液转移至另一试管内。再加入9 5 的乙醇4 m l ，充分混匀。待沉淀完 全后，将试管于3 0 0 0 转, i n 离。c , , 1 5 m i n 。小心倒掉上清液，用2 m l 蒸馏水溶解糖原，加 入1 0 m l 葸酮试剂加入各管。在6 2 0 r i m 波长下，测定吸光度。 湖北大学硕士学位论文 3 9 4 结果计算 糖原含量计算： a u 提取液